약용버섯인 영지버섯의 단핵균주 육성 및 원형질체 융합을 위한 육종소재를 개발하기 위하여 원형질체를 분리하여 neohaplont를 육성하였으며, 원형질체에 자외선을 조사하여 영양요구성 균주를 유발하였다. 영지의 2핵 균주로부터 원형질체를 분리, 재생하여 선발된 neohaplont의 선발율은 ASI 7091이 11.9%, ASI 7094는 전혀 선발을 하지 못하였으며 균주간 평균 선발율은 5.24%였다. 영지 단핵균주의 균사체로부터 분리한 원형질체에 자외선을 조사하였을 때 300초에서는 ASI 7074는 1.9%, ASI 7091은 0.17%의 생존율을 나타내었고 ASI 7100의 경우 모두 사멸하였다. 자외선을 10초에서 300초까지 자외선을 조사하여 총 1,536 colony를 얻어 영양요구주를 선발한 결과 ASI 7091 균주는 원형질체에 100초 처리한 colony에서 Nicotinic acid, PABA 요구주와 Riboflavin 요구주를 선발하였으며, 7100 균주에서는 60초의 자외선 처리에서 특성이 확인되지 않은 2개 균주를 선발하였다.
약용버섯인 영지버섯의 단핵균주 육성 및 원형질체 융합을 위한 육종소재를 개발하기 위하여 원형질체를 분리하여 neohaplont를 육성하였으며, 원형질체에 자외선을 조사하여 영양요구성 균주를 유발하였다. 영지의 2핵 균주로부터 원형질체를 분리, 재생하여 선발된 neohaplont의 선발율은 ASI 7091이 11.9%, ASI 7094는 전혀 선발을 하지 못하였으며 균주간 평균 선발율은 5.24%였다. 영지 단핵균주의 균사체로부터 분리한 원형질체에 자외선을 조사하였을 때 300초에서는 ASI 7074는 1.9%, ASI 7091은 0.17%의 생존율을 나타내었고 ASI 7100의 경우 모두 사멸하였다. 자외선을 10초에서 300초까지 자외선을 조사하여 총 1,536 colony를 얻어 영양요구주를 선발한 결과 ASI 7091 균주는 원형질체에 100초 처리한 colony에서 Nicotinic acid, PABA 요구주와 Riboflavin 요구주를 선발하였으며, 7100 균주에서는 60초의 자외선 처리에서 특성이 확인되지 않은 2개 균주를 선발하였다.
To develop neohaplonts for Ganoderma breeding, protoplasts were isolated from dikaryotic mycelium and regenerated. Selection rate of neohaplonts varied between ASI7074, ASI7091, ASI7094, ASI7100 and ASI7115, showing 5.24% on the average. Auxotropic mutants from Ganoderma monokarions were recovered b...
To develop neohaplonts for Ganoderma breeding, protoplasts were isolated from dikaryotic mycelium and regenerated. Selection rate of neohaplonts varied between ASI7074, ASI7091, ASI7094, ASI7100 and ASI7115, showing 5.24% on the average. Auxotropic mutants from Ganoderma monokarions were recovered by UV irradiation on protoplasts. Protoplast survival rates were 1.9% ASI 7074, 0.17% ASI 7091, and zero percent ASI 7100 using 300 second irradiation. Four auxotrophic strains were recovered from 1,536 colonies screened that will be further utilized for protoplast fusion and transformation.
To develop neohaplonts for Ganoderma breeding, protoplasts were isolated from dikaryotic mycelium and regenerated. Selection rate of neohaplonts varied between ASI7074, ASI7091, ASI7094, ASI7100 and ASI7115, showing 5.24% on the average. Auxotropic mutants from Ganoderma monokarions were recovered by UV irradiation on protoplasts. Protoplast survival rates were 1.9% ASI 7074, 0.17% ASI 7091, and zero percent ASI 7100 using 300 second irradiation. Four auxotrophic strains were recovered from 1,536 colonies screened that will be further utilized for protoplast fusion and transformation.
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문제 정의
본 연구에서는 교잡 육종에 가장 필수적이라고 할 수 있는 단핵균주를 영지버섯의 2핵 균사체로부터 원형질체를 분리하여 neohaplonts 선발에 의하여 획득하고자 하였으며, 단핵의 균사체로 부터는 원형질체를 분리한 후 원형질 체에 자외선을 처리하여 영양요구성 균주를 선발하였다. 이렇게 선발된 단핵균주로 균주간의 교잡을 실시하여 새로운 균주을 육성하고자 하였으며, 추후 계속될 원형질체 융합이나 형질전환 등에 필수적인 영양요구주를 육성하고자 본 연구를 수행하였다.
영지버섯의 우량균주를 육성에 필수적인 균주간 교배를 하기 위하여는 단핵균주의 분리가 필요하다. 영지중 자실체 형태가 녹각이면서 쓴맛이 강한 ASI 7074, 7094, 7100, 7115 균주와 편각형 중 고미도가 가장 높은 ASI 7091 균주(김 등, 1994)의 neohaplonts를 선발 하고자 하였다. 이들 균주의 2핵 균사체에 Novozym 234 등 세포벽 분해효소를 처리하여 원형질체를 분리하고 (그림 2) MCM 배지에 0.
본 연구에서는 교잡 육종에 가장 필수적이라고 할 수 있는 단핵균주를 영지버섯의 2핵 균사체로부터 원형질체를 분리하여 neohaplonts 선발에 의하여 획득하고자 하였으며, 단핵의 균사체로 부터는 원형질체를 분리한 후 원형질 체에 자외선을 처리하여 영양요구성 균주를 선발하였다. 이렇게 선발된 단핵균주로 균주간의 교잡을 실시하여 새로운 균주을 육성하고자 하였으며, 추후 계속될 원형질체 융합이나 형질전환 등에 필수적인 영양요구주를 육성하고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
공시균주의 단핵 균사체에서 원형질체를 분리한 후 자외선 처리를 하였다. 처리방법은 253.
6 M sucrose에 세포벽 분해 효소 (Novozym 234 5 mg/㎖ + β-glucuronidase 5 ㎕/㎖) 용액을 처리하여 30℃에서 120 rpm으로 3∼4시간 진탕 반응시켰다. 반응 후 생성된 원형질체는 sintered glass filter (porosity No. 1)를 사용하여 균사체 잔유물로 부터 순수 분리하고 삼투압 조절제로 두번 세척한 다음 현 탁시켜 0.6 M의 sucrose가 첨가된 MCM배지에 배양하는 방법으로 재생시켰다. 재생된 균총은 GCM에 계대배양하며 현미경으로 관찰하여 clamp connection이 없는 단핵균주를 선발하였다.
원형질체로부터 재생된 균주를 MCM을 분주한 petri-dish 에 16개씩 옮겼으며, 이들 균총중 MMM에서 생육이 되지 않은 균주만 선발하였다. 선발된 균주는 MCM을 이용 배양한 후 다시 MMM에 배양하고는 petri dish 1개당 12개씩 옮겨 검정을 통하여 유전표지 확인에 이용하였다. 사용한 배지의 조성은 yeast extract 1 ㎎/㎖, casamino acid 5 ㎎/㎖, purine과 pyrimidine은 각각 50 ㎍/㎖이었다 (그림 1).
약용버섯인 영지버섯의 단핵균주 육성 및 원형질체 융합을 위한 육종소재를 개발하기 위하여 원형질체를 분리하여 neohaplont를 육성하였으며, 원형질체에 자외선을 조사하여 영양요구성 균주를 유발하였다. 영지의 2핵 균주로부터 원형질체를 분리, 재생하여 선발된 neohaplont의 선발율은 ASI 7091이 11.
영지의 원형질체 융합 등에 이용하기 위한 영양요구성 균주를 분리하고자 영지 균주별 단핵 균사체를 배양한 후 세포벽 분해효소를 처리하여 원형질체를 분리하였다. 분리된 원형질체에 일정한 시간별로 자외선을 조사하고 자외선을 조사하지 않은 대조구의 재생율과 비교하여 생존율을 나타낸 것은 그림 3과 같다.
사용한 배지의 조성은 yeast extract 1 ㎎/㎖, casamino acid 5 ㎎/㎖, purine과 pyrimidine은 각각 50 ㎍/㎖이었다 (그림 1). 유전 표지 확인은 Yoo 등 (1985)의 방법과 같이 MMM에 amino acid 0.5 ㎎, vitamin과 nucleic acid base는 0.1 ㎎/㎖을 각각 첨가하여 사용하였다 (표 1).
7 nm의 자외선등으로 부터 10 cm 거리에 원형질체를 포함한 petri dish를 위치 시켜 처리시간별로 조사하였다. 자외선 처리는 빛이 완전히 차단된 암실에서 수행하였으며 처리 후 약 30분간 암상태로 두었다가 0.6 M sucrose가 첨가된 MCM에서 재생하였다. 처리시간별 생존율은 자외선을 처리한 원형질체에서 재생된 균총수를 자외선을 처리하지 않은 원형질체에서 재생된 균총수로 나누어 백분율로 나타내었다.
공시균주의 단핵 균사체에서 원형질체를 분리한 후 자외선 처리를 하였다. 처리방법은 253.7 nm의 자외선등으로 부터 10 cm 거리에 원형질체를 포함한 petri dish를 위치 시켜 처리시간별로 조사하였다. 자외선 처리는 빛이 완전히 차단된 암실에서 수행하였으며 처리 후 약 30분간 암상태로 두었다가 0.
대상 데이터
, 1994)을 이용하였다. Neohaplont 및 영양요구주 선발에 사용된 배지는 버섯완전배지 (MCM ; 20 g dextrose, 0.5 g MgSO4·7H2O, 0.46 g KH2PO4, 1 g K2HPO4, 2 g yeast ex., 2 g peptone, 20 g agar/1,000 ml)와 버섯최소배지 (MMM ; 20 g dextrose, 0.5 g MgSO4·7H2O, 0.46 g KH2PO4, 1 g K2HPO4, 20 g bacto-agar/1,000 ml)를 사용하였다.
선발된 균주는 MCM을 이용 배양한 후 다시 MMM에 배양하고는 petri dish 1개당 12개씩 옮겨 검정을 통하여 유전표지 확인에 이용하였다. 사용한 배지의 조성은 yeast extract 1 ㎎/㎖, casamino acid 5 ㎎/㎖, purine과 pyrimidine은 각각 50 ㎍/㎖이었다 (그림 1). 유전 표지 확인은 Yoo 등 (1985)의 방법과 같이 MMM에 amino acid 0.
영지의 neohaplont 및 영양요구주 선발에 이용된 균주는 농업과학기술원 응용미생물과에 보존중인 쓴맛이 강하면서 자실체가 편각형인 ASI 7091과 녹각형인 ASI 7074, 7094, 7100, 7115 (Kim et al., 1994)을 이용하였다. Neohaplont 및 영양요구주 선발에 사용된 배지는 버섯완전배지 (MCM ; 20 g dextrose, 0.
원형질체로부터 재생된 균주를 MCM을 분주한 petri-dish 에 16개씩 옮겼으며, 이들 균총중 MMM에서 생육이 되지 않은 균주만 선발하였다. 선발된 균주는 MCM을 이용 배양한 후 다시 MMM에 배양하고는 petri dish 1개당 12개씩 옮겨 검정을 통하여 유전표지 확인에 이용하였다.
영지중 자실체 형태가 녹각이면서 쓴맛이 강한 ASI 7074, 7094, 7100, 7115 균주와 편각형 중 고미도가 가장 높은 ASI 7091 균주(김 등, 1994)의 neohaplonts를 선발 하고자 하였다. 이들 균주의 2핵 균사체에 Novozym 234 등 세포벽 분해효소를 처리하여 원형질체를 분리하고 (그림 2) MCM 배지에 0.6 M 삼투압 조절제가 첨가된 배지에서 재생시킨 균총으로부터 표 2와 같은 단핵의 neohaplonts를 선발하였다. 각 균주마다 선발율에 차이가 있으며, 특히 ASI 7091 균주는 단핵균주 선발 비율이 11.
6 M의 sucrose가 첨가된 MCM배지에 배양하는 방법으로 재생시켰다. 재생된 균총은 GCM에 계대배양하며 현미경으로 관찰하여 clamp connection이 없는 단핵균주를 선발하였다.
ASI 7091과 7100 균주는 원형질체에 60초와 100초의 자외선 처리에서 각각 2개 균주씩 선발하였으나 ASI 7074 균주에서는 영양요구주를 선발하지 못하였다. 처음에 영양요구주를 육성하고자 선발된 colony는 ASI 7074는 604개, ASI 7091은 704개, ASI 7100은 192개로 총 1,536 colony 중에서 4개 균주의 영양요구주를 선발하였다. 따라서 ASI 7091은 0.
성능/효과
6 M 삼투압 조절제가 첨가된 배지에서 재생시킨 균총으로부터 표 2와 같은 단핵의 neohaplonts를 선발하였다. 각 균주마다 선발율에 차이가 있으며, 특히 ASI 7091 균주는 단핵균주 선발 비율이 11.9%로 가장 높 았으며, ASI 7094는 단핵균주를 전혀 선발이 이루어지지 못하였다.
분리된 원형질체에 일정한 시간별로 자외선을 조사하고 자외선을 조사하지 않은 대조구의 재생율과 비교하여 생존율을 나타낸 것은 그림 3과 같다. 균주간의 생존율을 보면 ASI 7074는 90초 동안 자외선을 조사하여도 약 50% 정도로 ASI 7091과 7100 균주보다 높았다. 그러나 180초간의 자외선 조사에서는 3개 균주 모두 거의 비슷하였으며, 300초에서는 ASI 7074는 1.
균주간의 생존율을 보면 ASI 7074는 90초 동안 자외선을 조사하여도 약 50% 정도로 ASI 7091과 7100 균주보다 높았다. 그러나 180초간의 자외선 조사에서는 3개 균주 모두 거의 비슷하였으며, 300초에서는 ASI 7074는 1.9%, ASI 7091은 0.17%을 나타내었고 ASI 7100은 완전히 상실하였다. 식용버섯인 느타리버섯의 원형질체를 분리하여 자외선을 조사한경우에 치사되는 시간은 종에 따라 20-90초 정도로 차이는 있으나(Yoo 등, 1985; Takashi 등, 1993; Lee 등, 1986; 조, 1994), 이러한 처리시간별 영지의 원형질체 생존력은 다른 버섯에 비하여 월등히 높은 것을 알 수 있었다.
처음에 영양요구주를 육성하고자 선발된 colony는 ASI 7074는 604개, ASI 7091은 704개, ASI 7100은 192개로 총 1,536 colony 중에서 4개 균주의 영양요구주를 선발하였다. 따라서 ASI 7091은 0.28%, ASI 7100은 1.04%의 선발율을 보여 ASI 7100의 선발율이 훨씬 높아균주간에도 선발비율에는 많은 차이를 나타내었다.
의 2핵 균주의 교배형이 A3B3/A4B4인 것으로부터 원형질체를 분리한 후 재생시켜 단핵균주를 선발 한 후 교배형을확인한 결과 총 100균주 중 A3B3가 96균주, A4B4가 4균주였다고 보고하였다. 따라서 버섯 종별로 neohaplonts의 선발율은 상당히 차이가 있음을 알 수 있었다. 이와 같이 원형질체 재생에 의해서 neohaplonts를 선발하는 것은 포자발아율이 낮은 종이나 자실체 형성이 곤란한 버섯에서는상당히 편리한 방법이 될 수 있을 것이다.
24%였다. 영지 단핵균주의 균사체로부터 분리한 원형질체에 자외선을 조사하였을 때 300초에서는 ASI 7074는 1.9%, ASI 7091은0.17%의 생존율을 나타내었고 ASI 7100의 경우 모두 사멸하였다. 자외선을 10초에서 300초까지 자외선을 조사하여 총 1,536 colony를 얻어 영양요구주를 선발한 결과 ASI 7091 균주는 원형질체에 100초 처리한 colony에서 Nicotinic acid, PABA 요구주와 Riboflavin 요구주를 선발하였으며, 7100 균주에서는 60초의 자외선 처리에서 특성이 확인되지 않은 2개 균주를 선발하였다.
약용버섯인 영지버섯의 단핵균주 육성 및 원형질체 융합을 위한 육종소재를 개발하기 위하여 원형질체를 분리하여 neohaplont를 육성하였으며, 원형질체에 자외선을 조사하여 영양요구성 균주를 유발하였다. 영지의 2핵 균주로부터 원형질체를 분리, 재생하여 선발된 neohaplont의 선발율은 ASI 7091이 11.9%, ASI 7094는 전혀 선발을 하지 못하였으며 균주간 평균 선발율은 5.24%였다. 영지 단핵균주의 균사체로부터 분리한 원형질체에 자외선을 조사하였을 때 300초에서는 ASI 7074는 1.
17%의 생존율을 나타내었고 ASI 7100의 경우 모두 사멸하였다. 자외선을 10초에서 300초까지 자외선을 조사하여 총 1,536 colony를 얻어 영양요구주를 선발한 결과 ASI 7091 균주는 원형질체에 100초 처리한 colony에서 Nicotinic acid, PABA 요구주와 Riboflavin 요구주를 선발하였으며, 7100 균주에서는 60초의 자외선 처리에서 특성이 확인되지 않은 2개 균주를 선발하였다.
후속연구
그러나 영지의 원형질체인 경우 ASI 7091은 20%, ASI 7100은 약 50%의 생존 범위에서 영양요구주가 분리되어 버섯 종간이나 균주간에도 약간의 차이가 있는 것으로 사료되었다. 이처럼 선발된 영양요구주는 앞으로 영지의 후대에서 발현되는 표지 인자로 이용되거나 아니면 원형질체 융합 또는 형질전환 등에 아주 유용하게 이용 할 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
버섯에 있어서 효율적인 교잡 육종은 무엇의 획득이 가장 필수적인가?
그러나 이러한 품종보다 수량과 품질이 우수한 새로운 품종을 육성하기 위해서는 세계각지에서 수집된 다양한 형질을 가진 균주를 이용하여 교잡 육종을 하는 것이 가장 효율적이라고 할 수 있다. 버섯에 있어서 효율적인 교잡 육종은 단핵균주의 획득이 가장 필수적이라 할 수있는데 영지에서는 포자발아가 힘들고 효율이 낮아 단핵 균주의 획득이 쉽지 않은 상태이다 (김 등, 1998). 따라서 포자 발아 이외의 단핵균주의 획득방법이 육종에 있어서는 필수적이다.
영지에서 단핵 균주의 획득이 쉽지 않은 이유는?
그러나 이러한 품종보다 수량과 품질이 우수한 새로운 품종을 육성하기 위해서는 세계각지에서 수집된 다양한 형질을 가진 균주를 이용하여 교잡 육종을 하는 것이 가장 효율적이라고 할 수 있다. 버섯에 있어서 효율적인 교잡 육종은 단핵균주의 획득이 가장 필수적이라 할 수있는데 영지에서는 포자발아가 힘들고 효율이 낮아 단핵 균주의 획득이 쉽지 않은 상태이다 (김 등, 1998). 따라서 포자 발아 이외의 단핵균주의 획득방법이 육종에 있어서는 필수적이다.
다양한 영양요구주의 선발을 위한 보고로는 어떤 것들이 있는가?
이와같은원형질체융합이나형질전환을하기위해서는다양한 영양요구주의 선발이 이루어져야 육종목표에 쉽게 접근할 수 있을 것이다. G. lucidum의 경우 2핵 균사체를 균질화한 후 U. V.를 조사해서 영양요구주를 선발한 다수의 보고가 있으며(Um et al., 1988; 박, 1991), G. applanatum 의 영양요구주를 선발한 보고 (Park et al., 1988)도 있다.
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