견 피브로인 가수분해물의 몇 가지 특성과 in vitro 및 in vivo에 의한 동물 인지 기능 향상효과를 알아본 결과, 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 1) 효소 가수분해 실크 피브로인 펩타이드의 분획에 있어 3가지의 분자량이 다른 분획을 제조할 수 있었다. 2) 분획 별 실크 피브로인 펩타이드의 유리 아미노산 조성은 분획간의 유의차가 나타났으며, 분획 2 및 3의 경우 활성부분을 가진 Cys, Tyr 및 Phe부분이 상당한 양을 차지하였다. 3) 대표적으로 산 및 효소 가수분해물의 핵자기공명(NMR) 법에 의한 구조적 차이는 산으로 가수분해한 저분자와 그렇치 않은 샘풀 간에는 확실한 구조적 차이에 기인한 상이한 스펙트럼을 관측할 수 있었다. 4) 분자량 별 실크 피브로인의 인지기능 향상 효과를 세포배양(in vitro)및 동물투여(in vivo)에 의해 알아본 결과, 세포배양에 의한 활성 효과는 분자량에 따라 다소 차이가 나타났으며, 그 중 분자량 500미만의 샘플군(LF)이 대조인 유발군에 비해 23.5%의 세포보호 효과가 있었다. 또한 동물(in vivo)에 의한 인지기능 향상 효과에 있어서는 보다 확실한 차이가 나타났는데, 그 중 분자량 500-1000정도의 분자량 범위의 분획물질을 10 mg/kg을 투여하였을 경우, 대조군(scopolamine)에 비하여 최고 50%까지 기억회복 효과를 나타내었다.
견 피브로인 가수분해물의 몇 가지 특성과 in vitro 및 in vivo에 의한 동물 인지 기능 향상효과를 알아본 결과, 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 1) 효소 가수분해 실크 피브로인 펩타이드의 분획에 있어 3가지의 분자량이 다른 분획을 제조할 수 있었다. 2) 분획 별 실크 피브로인 펩타이드의 유리 아미노산 조성은 분획간의 유의차가 나타났으며, 분획 2 및 3의 경우 활성부분을 가진 Cys, Tyr 및 Phe부분이 상당한 양을 차지하였다. 3) 대표적으로 산 및 효소 가수분해물의 핵자기공명(NMR) 법에 의한 구조적 차이는 산으로 가수분해한 저분자와 그렇치 않은 샘풀 간에는 확실한 구조적 차이에 기인한 상이한 스펙트럼을 관측할 수 있었다. 4) 분자량 별 실크 피브로인의 인지기능 향상 효과를 세포배양(in vitro)및 동물투여(in vivo)에 의해 알아본 결과, 세포배양에 의한 활성 효과는 분자량에 따라 다소 차이가 나타났으며, 그 중 분자량 500미만의 샘플군(LF)이 대조인 유발군에 비해 23.5%의 세포보호 효과가 있었다. 또한 동물(in vivo)에 의한 인지기능 향상 효과에 있어서는 보다 확실한 차이가 나타났는데, 그 중 분자량 500-1000정도의 분자량 범위의 분획물질을 10 mg/kg을 투여하였을 경우, 대조군(scopolamine)에 비하여 최고 50%까지 기억회복 효과를 나타내었다.
We were investigated the cognitive ability enhancement in rats using B. mori fibroin molecular controlled hydrolysate by preparative recycle HPLC system. Also, some of its physicochemical properties and free amino acid components were investigated, too. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum are ...
We were investigated the cognitive ability enhancement in rats using B. mori fibroin molecular controlled hydrolysate by preparative recycle HPLC system. Also, some of its physicochemical properties and free amino acid components were investigated, too. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum are measured different pattern between high (HF) and low (LF) molecular controlled B. mori fibroin samples, respectively. The in vitro test by neuron primary cell culture are showed dependent on molecular weight (Mw) of B. mori fibroin in the order of LF > MF > HF, too. However, the memorial effects in rats by in vivo test are large dependent molecular weight on that maximum 50% than control. Also, the memorial effect was higher than the enzymatic relative and acid hydrolysate, which was 50.0$\pm$2.1 and 25.9$\pm$0.32%, respectively.
We were investigated the cognitive ability enhancement in rats using B. mori fibroin molecular controlled hydrolysate by preparative recycle HPLC system. Also, some of its physicochemical properties and free amino acid components were investigated, too. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum are measured different pattern between high (HF) and low (LF) molecular controlled B. mori fibroin samples, respectively. The in vitro test by neuron primary cell culture are showed dependent on molecular weight (Mw) of B. mori fibroin in the order of LF > MF > HF, too. However, the memorial effects in rats by in vivo test are large dependent molecular weight on that maximum 50% than control. Also, the memorial effect was higher than the enzymatic relative and acid hydrolysate, which was 50.0$\pm$2.1 and 25.9$\pm$0.32%, respectively.
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문제 정의
이러한 분자량의 차이에 의한 효과를 알아보기 위하여 대조군(scopolamine)에 의한 동물의 인지기능 향상 효과를 알아보았다. 대조약물인 scopolamine을 투여하게 되면 순간적으로 대뇌의 신경이 차단되어 인지기능을 나타낼 수 없게 된다.
이에 본 연구는 견피브로인 가수분해물의 몇 가지 특징과 in vitro 및 동물에 적용한 인지기능 향상 효과(讥 讨vo)에 대한 적용 예를 소개하고자 한다. 이러한 성과에 대한 정확한 메카니즘에 대해서는 현재 연구가 계속 중임을 밝혀 두고자 한다.
제안 방법
위의 제 2절에서 얻어진 분획물의 분말 시료를 아미노산 pH 2.20 Loading buffer에 녹인 후 자동 아미노산 분석 장치 (Pharmacia Biotec. Biochrom 20 Plu아를 이용하여 18종 아미노산 표준 샘플(Sigma, USA)에 대한 유리 아미노산 조성을 분석하였다.
PC12 cells ca. IX 103 * 5 cells/cnf)에 제조한 분획물(HF, MF, LF)을 50 |ig/(il씩 가한 다음 48시간 배양한 후 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 대조구는 과산화수소(HQ)를 50 晚/μ1을 처리하였다.
효소 가수분해 용액을 SephadexG-25 Gel Filtration Chromatography (Pharamacia, GradiFrac,UV-1 detection, Sweden) 장치를 이용하여 피브로인과 염을 완전히 분리하였다. 그 후, 3%(w/w)의 단백질 분해요소 (Nove, DenmarkX 첨가하여 질소가스 충진 조건에서 55℃, 24시간 가수분해를 실시하였다. 그 후, 100℃에서 5분간 효소의 불활성 처리를 하여 잔유물을 제거한 다음, 0.
실크 분획물은 생리 식염수에 용해하여 50 )ig/|U을 14일간 oral needle을 사용하여 경구 투여 하였으며, 10마리의 Rat을 8방 미로찾기 기구(Advanced, Sweden)를 이용하여 행동반응 결과를 측정하였다. 대조구는 같은동물에 scopolamine(Sigma, USA)을 25 |ig/|il 투여하여 중추신경을 차단시킨 다음, 2시간 후 실크분획물을 투여하여 미로찾기 시간의 차이를 인지기능 향상의 척도로 삼았다.
IX 103 * 5 cells/cnf)에 제조한 분획물(HF, MF, LF)을 50 |ig/(il씩 가한 다음 48시간 배양한 후 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 대조구는 과산화수소(HQ)를 50 晚/μ1을 처리하였다. 세포 생존율은 다음의 식에 의해 계산하였다
삼육 실험 동물센터로부터 분양 받은 체중 250±5 g 내 외의 외견상 건강한 Sprague-Dawley Rat의 웅성 흰주를 사용하여 고형 사료 및 일정 조건(온도:20±2。。, 습도:50 %, 명암:12시간 light/dark cycle)하에서 충분히 적응시킨 후 사용하였다. 실크 분획물은 생리 식염수에 용해하여 50 )ig/|U을 14일간 oral needle을 사용하여 경구 투여 하였으며, 10마리의 Rat을 8방 미로찾기 기구(Advanced, Sweden)를 이용하여 행동반응 결과를 측정하였다. 대조구는 같은동물에 scopolamine(Sigma, USA)을 25 |ig/|il 투여하여 중추신경을 차단시킨 다음, 2시간 후 실크분획물을 투여하여 미로찾기 시간의 차이를 인지기능 향상의 척도로 삼았다.
즉, 처음에는 단일 피크로 관측되어지다가 Preparative Recycling HPLC를 이용하여 7회 cycle을 한 결과, 3개의 단일 피크로 분리되어짐을 알 수 있다. 앞부분(Fraction-1) 을 LF 및 가운데 부분(Fraction-2)을 MF 및 뒷부분(Fractional 피크를 HF로 분획화 하였다. 이들의 피크로 보아서단일물질로 생각은 되어지나 본 연구로서는 정확한 결과는 알 수 없다.
우선 분자량이 다른 분획 물질의 활성을 알아보기 위하여 PC12 세포배양에 의한 활성을 알아보았다. 그림 3에 비교 그림을 실었다.
위에서 얻어진 실크 피브로인 수용액을 이용하여 분획 화를 시도하였다. 편의상 평균분자량(Mw)의 크기로 구분을 하였는데 HF (Mw 1000-2000), MF (Mw 500-1000), LF (Mw 500미만)로 구분하였다.
부터 얻어지는 견사를 사용하였다. 정련은 생사를 욕비 50 : 1에서 5wt%의 마르셀 비누 및 3wt%의 Na2CO3 혼합 용액에 넣어 9(TC에서 40분간 2회 처리한 후, 증류수로 3번 정도 같은 작업을 반복하여 충분히 수세하여 사용하였다. 이때의 연감율은 24%였으며, 이것을 순수 피브로인 원료로 하였다.
제조방법에 따른 구조적 차이를 알아보기 위하여, 염산 가수분해물(LF)을 대조로하여 효소 가수분해물을 핵자기 공명장치 (JEOL-400MHZ)에 의한 13C NMR 측정을 행하였다. 조건은 Asakura (Asakura et al.
위에서 얻어진 실크 피브로인 수용액을 이용하여 분획 화를 시도하였다. 편의상 평균분자량(Mw)의 크기로 구분을 하였는데 HF (Mw 1000-2000), MF (Mw 500-1000), LF (Mw 500미만)로 구분하였다. 분획은 Preparative Recycling HPLC (LC-918 Model, JAI, Japan, Column : JAIGEL-GC310, UV : 220 nm, RI-Detector)장치를 이용한수동제어법에 의해 진행하였다.
표 1에 위에서 분리한 분획물의 유리 아미노산 조성을 비교하여 실었다. 유리 아미노산은 어떤 물질이 원래 상태에서 기능성을 나타내는 척도가 될 수 있기에 기능성이 강조되는 식품 및 의약 단백질과 같은 분야에서 중요하게 작용될 수 있다.
대상 데이터
그림 3에 비교 그림을 실었다. 대조는 과산화수소(HQ)에 의한 세포 독성을 유발군으로 삼았다. 정상 세포를 100 으 로 하고 HQ?에 의한 세포 독성을 0 으로 환산하였을 때의 세포 보호 활성 효과를 나타내고 있다.
삼육 실험 동물센터로부터 분양 받은 체중 250±5 g 내 외의 외견상 건강한 Sprague-Dawley Rat의 웅성 흰주를 사용하여 고형 사료 및 일정 조건(온도:20±2。。, 습도:50 %, 명암:12시간 light/dark cycle)하에서 충분히 적응시킨 후 사용하였다. 실크 분획물은 생리 식염수에 용해하여 50 )ig/|U을 14일간 oral needle을 사용하여 경구 투여 하였으며, 10마리의 Rat을 8방 미로찾기 기구(Advanced, Sweden)를 이용하여 행동반응 결과를 측정하였다.
이론/모형
편의상 평균분자량(Mw)의 크기로 구분을 하였는데 HF (Mw 1000-2000), MF (Mw 500-1000), LF (Mw 500미만)로 구분하였다. 분획은 Preparative Recycling HPLC (LC-918 Model, JAI, Japan, Column : JAIGEL-GC310, UV : 220 nm, RI-Detector)장치를 이용한수동제어법에 의해 진행하였다.
위에서 얻어진 순수견 피브로인의 용해는 여 등(2000) 의 방법에 따라 제조하였다. 효소 가수분해 용액을 SephadexG-25 Gel Filtration Chromatography (Pharamacia, GradiFrac,UV-1 detection, Sweden) 장치를 이용하여 피브로인과 염을 완전히 분리하였다.
제조방법에 따른 구조적 차이를 알아보기 위하여, 염산 가수분해물(LF)을 대조로하여 효소 가수분해물을 핵자기 공명장치 (JEOL-400MHZ)에 의한 13C NMR 측정을 행하였다. 조건은 Asakura (Asakura et al., 1991; Asakura et al.,1983}의 방법에 따랐다.
성능/효과
1) 효소 가수분해 실크 피브로인 펩타이드의 분획에 있어 3가지의 분자량이 다른 분획을 제조할 수 있었다.
2) 분획 별 실크 피브로인 펩타이드의 유리 아미노산 조 성은 분획간의 유의차가 나타났으며, 분획 2 및 3의 경우 활성부분을 가진 Cys, Tyr 및 Phe부분이 상당한 양을 차 지하였다.
3) 대표적으로 산 및 효소 가수분해물의 핵자기공명 (NMR) 법에 의한 구조적 차이는 산으로 가수분해한 저분자와 그렇치 않은 샘풀 간에는 확실한 구조적 차이에 기인한 상이한 스펙트럼을 관측할 수 있었다.
4) 분자량 별 실크 피브로인의 인지기능 향상 효과를 세 포배양(讥 vitro) 및 동물투여(讥 Wvo)에 의해 알아본 결과, 세포배양에 의한 활성 효과는 분자량에 따라 다소 차이가 나타났으며, 그 중 분자량 500미만의 샘플군(LF)이 대조인 유발군에 비해 23.5%의 세포보호 효과가 있었다. 또한 동 물(讥 讨四)에 의한 인지기능 향상 효과에 있어서는 보다 확실한 차이가 나타났는데, 그 중 분자량 500-1000정도의 분자량 범위의 분획물질을 10 ㎎/㎏을 투여하였을 경우, 대조군(scopolamine)에 비하여 최고 50%까지 기억회복 효과를 나타내었다.
5%의 세포보호 효과가 있었다. 또한 동 물(讥 讨四)에 의한 인지기능 향상 효과에 있어서는 보다 확실한 차이가 나타났는데, 그 중 분자량 500-1000정도의 분자량 범위의 분획물질을 10 ㎎/㎏을 투여하였을 경우, 대조군(scopolamine)에 비하여 최고 50%까지 기억회복 효과를 나타내었다.
9%의 기억력 회복효과를 나타내어 각 분자량 에 의한 확실한 활성을 나타내었다. 제 4절의 in vitro 세포에 의한 결과는 분자량이 제일 저분자량이 세포활성이 있었으나 직접 in 동물에 실험에 있어서는 중간정도 (MF)의 분자량이 효과가 있었다. 정확히 어느 정도의 분자량대에서 활성이 있는지에 대해서는 현재 연구가 진행 중에 있으며, 금후 단일물질에 의한 실험의 결과와 그 물 질의 구조를 파악할 경우 기능성과 구조의 상관관계를 밝 힐 수 있는 중요한 연구결과를 기대할 수 있을 것으로 기 대한다.
표 1에 나와 있는 것과 같이 대조로 사용한 염산 가수분해물의 유리아미노산 조성과 효소 가수분해분획물의 유 리 아미노산 조성은 많은 차이가 있음을 알 수 있다. 특히 실크 피브로인에서 주성분으로 알려지고 있는 Gly, Ala, Ser 및 활성의 기능을 나타내는 Cys, Tyr 및 Phe의 조성에 현격한 차이가 있음을 알 수 있으며 곧 기능성과 연관이 되어질 수 있음을 의미한다. 즉, Table 1의 유리아미노산 조성에서 볼 경우 Fraction-1(LF)의 경우는 대조의 염산 가수분해 성분과 어느 정도 비슷하며, Fraction-2(MF) 및 Fraction-3(HF>의 경우는 활성기로 작용할 수 있는 아미노산이 .
후속연구
제 4절의 in vitro 세포에 의한 결과는 분자량이 제일 저분자량이 세포활성이 있었으나 직접 in 동물에 실험에 있어서는 중간정도 (MF)의 분자량이 효과가 있었다. 정확히 어느 정도의 분자량대에서 활성이 있는지에 대해서는 현재 연구가 진행 중에 있으며, 금후 단일물질에 의한 실험의 결과와 그 물 질의 구조를 파악할 경우 기능성과 구조의 상관관계를 밝 힐 수 있는 중요한 연구결과를 기대할 수 있을 것으로 기 대한다.
참고문헌 (10)
Asakura T., M. Demura, M. Nagashima, R. Sakaguchi, M. Osanai and K. Ogawa (1991) Metabolic flux and incorporation of [2- $^13$ C] glycine into silk fibroin studied by 13C NMR in vivo and in vitro, lnsec. Biochem., 21(7): 743~748
Asakura T., H. Suzuki and Y. Watanabe (1983) Conformational Characteritation of Silk Fibroin in Intact Bombyx mori and Philosamia cynthia ricini Silkuorms by $^13$ C NMR Spectroscopy, Macromoleculus, 16(6): 1024~1026
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Moechars, D. (1999) Early phenotypic changes in transgenic mice that overexpress different mutants of amyloid precursor protein in brain, J. Biol. Chem., 274: 6483~6492
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