목적: 단백뇨 질환에서 볼 수 있는 사구체 상피세포(glomerular epithelial cells, GEpC) 족돌기(foot process)의 병리학적 변화에 있어서 GEpC사이의 세극막(slit diaphragm)과 세포골격을 연결하는 ZO-1 단백의 당뇨조건에 따른 변화를 알아보고자 하였다. 방법: 백서 GEpC을 배양하고 고농도의 당과 후기당화합물(advanced glycosylation enduroducts, AGE)를 적용하여 당뇨병 환경에 가까운 조건을 설정한 후, ZO-1 단백양은 Western 분석으로, 분포 변화는 공초점 현미경으로, 유전자 표현의 변화는 RT-PCR로 관찰하였다. 실험군은 당의 농도를 5 또는 30 mM로, AGE와 BSA를 첨가하고 osmotic control로서 당 5 mM에 mannitol 25 M을 섞은 것을 조합하여 A5, A30, B5, B30, Aosm로 하였다. 결과: 공초점 현미경 상 ZO-1은 정상적인 환경인 B5에서 B30, A5, 가장 병적인 A30 환경으로 진행할수록 세포질의 바깥에서 안쪽으로 이동하는 양상을 보였다. ZO-1 단백양은 B5 결과를 대조군으로 비교하여 당을 첨가한 B30에서 11.1%, AGE를 추가한 조건인 A5에서 2.3% 감소하였나 통계적 유의성은 없었고, 당과 AGE가 동시에 첨가된 A30에서는 19.0%의 유의한 감소를 보였다. mRNA의 발현도 A30에서만 12.0%의 의의 있는 감소를 보였다. 이러한 단백질과 mRNA의 감소 소견은 osmotic control (Aosm)에서는 관찰할 수 없었다. 결론: 고농도의 당과 AGE에 의한 GEpC의 ZO-1의 분포 변화와 유전자 수준에서의 억제로 단백의 생성 감소를 초래함으로써, 장기간 당뇨 환경체서 족돌기의 형태학적 변화를 설명할 수 있으며, 추후 이의 변화 기전에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
목적: 단백뇨 질환에서 볼 수 있는 사구체 상피세포(glomerular epithelial cells, GEpC) 족돌기(foot process)의 병리학적 변화에 있어서 GEpC사이의 세극막(slit diaphragm)과 세포골격을 연결하는 ZO-1 단백의 당뇨조건에 따른 변화를 알아보고자 하였다. 방법: 백서 GEpC을 배양하고 고농도의 당과 후기당화합물(advanced glycosylation enduroducts, AGE)를 적용하여 당뇨병 환경에 가까운 조건을 설정한 후, ZO-1 단백양은 Western 분석으로, 분포 변화는 공초점 현미경으로, 유전자 표현의 변화는 RT-PCR로 관찰하였다. 실험군은 당의 농도를 5 또는 30 mM로, AGE와 BSA를 첨가하고 osmotic control로서 당 5 mM에 mannitol 25 M을 섞은 것을 조합하여 A5, A30, B5, B30, Aosm로 하였다. 결과: 공초점 현미경 상 ZO-1은 정상적인 환경인 B5에서 B30, A5, 가장 병적인 A30 환경으로 진행할수록 세포질의 바깥에서 안쪽으로 이동하는 양상을 보였다. ZO-1 단백양은 B5 결과를 대조군으로 비교하여 당을 첨가한 B30에서 11.1%, AGE를 추가한 조건인 A5에서 2.3% 감소하였나 통계적 유의성은 없었고, 당과 AGE가 동시에 첨가된 A30에서는 19.0%의 유의한 감소를 보였다. mRNA의 발현도 A30에서만 12.0%의 의의 있는 감소를 보였다. 이러한 단백질과 mRNA의 감소 소견은 osmotic control (Aosm)에서는 관찰할 수 없었다. 결론: 고농도의 당과 AGE에 의한 GEpC의 ZO-1의 분포 변화와 유전자 수준에서의 억제로 단백의 생성 감소를 초래함으로써, 장기간 당뇨 환경체서 족돌기의 형태학적 변화를 설명할 수 있으며, 추후 이의 변화 기전에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
Purpose: Regardless of the underlying diseases, the proteinuric condition demonstrates ultrastructural changes in podocytes with retraction and effacement of the highly specialized interdigitating foot processes. We examined the molecular basis for this alteration of the podocyte phenotypes, includi...
Purpose: Regardless of the underlying diseases, the proteinuric condition demonstrates ultrastructural changes in podocytes with retraction and effacement of the highly specialized interdigitating foot processes. We examined the molecular basis for this alteration of the podocyte phenotypes, including quantitative and distributional changes of ZO-1 protein as a candidate contributing to the pathogenic changes in the barrier to protein filtration. Methods: To investigate whether high glucose and advanced glycosylation endproduct(AGE) induce podocyte cytoskeletal changes, we cultured rat GEpC under 1) normal glucose(5 mM=control) or 2) high glucose(30 mM) or 3) AGE-added or 4) high glucose plus AGE-added conditions. The distribution of ZO-1 was observed by confocal microscope and the change of ZO-1 expression was measured by Western blotting and RT-PCR. Results: By confocal microscopy, we observed that ZO-1 moves from peripheral cytoplasm to inner actin filaments complexes in both AGE-added and high glucose condition. In Western blotting, high glucose or AGE-added condition decreased the ZO-1 protein expression by 11.1%(P>0.05) and 2.3%(P>0.05), respectively compared to the normal glucose condition. High glucose plus AGE-added condition further decreased ZO-1 protein expression to statistically significant level(12%, P<0.05). No significant change was seen in the osmotic control. In RT-PCR, high glucose plus AGE-added condition significantly decreased the expression of ZO-1 mRNA by 12% compared to normal glucose condition. Conclusion: We suggest that both high glucose and AGE-added condition induce the cytoplasmic translocation and suppresses the production of ZO-1 at transcriptional level and these changes may explain the functional changes of podocytes in diabetic conditions.
Purpose: Regardless of the underlying diseases, the proteinuric condition demonstrates ultrastructural changes in podocytes with retraction and effacement of the highly specialized interdigitating foot processes. We examined the molecular basis for this alteration of the podocyte phenotypes, including quantitative and distributional changes of ZO-1 protein as a candidate contributing to the pathogenic changes in the barrier to protein filtration. Methods: To investigate whether high glucose and advanced glycosylation endproduct(AGE) induce podocyte cytoskeletal changes, we cultured rat GEpC under 1) normal glucose(5 mM=control) or 2) high glucose(30 mM) or 3) AGE-added or 4) high glucose plus AGE-added conditions. The distribution of ZO-1 was observed by confocal microscope and the change of ZO-1 expression was measured by Western blotting and RT-PCR. Results: By confocal microscopy, we observed that ZO-1 moves from peripheral cytoplasm to inner actin filaments complexes in both AGE-added and high glucose condition. In Western blotting, high glucose or AGE-added condition decreased the ZO-1 protein expression by 11.1%(P>0.05) and 2.3%(P>0.05), respectively compared to the normal glucose condition. High glucose plus AGE-added condition further decreased ZO-1 protein expression to statistically significant level(12%, P<0.05). No significant change was seen in the osmotic control. In RT-PCR, high glucose plus AGE-added condition significantly decreased the expression of ZO-1 mRNA by 12% compared to normal glucose condition. Conclusion: We suggest that both high glucose and AGE-added condition induce the cytoplasmic translocation and suppresses the production of ZO-1 at transcriptional level and these changes may explain the functional changes of podocytes in diabetic conditions.
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문제 정의
이러한 결과의 차이는 실험대상 세포가 다름으로 인한 세극막의 다른 단백이나 actin 세포골격의 변화의 차이, Kim 등[17]의 연구는 7일간 노출시킨 데 반해 본 연구는 2일간 노출시킨 배양시간의 차이와 이에 대한 보상기전 활성화 유무 등에 의한 것으로 사료된다. 또한, Kim 등[1 7]의 연구는 in vivo 연구에서도 유사한 결과를 증명하였으므로 향후 본 연구자들은 in vivo 에서 당뇨병 유병 기간의 차이에 의한 Z0-1 의 변화도 관찰하고자 한다.
그러나 현재까지 당뇨병성 신병증에서의 ZO-1의 역할에 대한 연구는 드문 실정이다[17]. 이에 본 연구자들은 당뇨병성 신병증을 포함한 단백뇨 질환에서 자주 관찰할 수 있는 GEpC의 형태학적 이상에 있어서 ZO-1의 변화를 생체 외 배양실험을 통하여 알아보고자 하였다.
이 결과들은 양적 변화까지는 관찰하지 않았으나 족돌기의 미세구조변화가 없이도 단백뇨가 있는 상태에서 ZO-1 분포의 재분배가 일어남을 의미한다. 이와 같이 실험적인 사구체 병리적 환경에서 ZO-1은 발현이 감소 혹은 분포의 재분배 등이 일어남을 알 수 있고 이러한 결과는 본 연구에서 보이는 실험적 당뇨병 환경에서의 ZO-1 발현의 감소와 재분포와의 관련성을 추론할 수 있다.
제안 방법
사용한 백서의 ZO-1 sense의 염기서열은 5'-CGTTCTAGAAGATAGCCTGC—3'이고, antisense의 염기서열은 5'-CTCTTGGAGCT-GCGAAGACC-3'이었으며 housekeeper로서 백서의 GAPDH sense의 염기서열은 5'-CTCTA-CCCACGGCAAGTTCAA-3' 이 고, antisense 의 염기서열은 5—GGATGACCTTGCCCACAGC- 3, 이었고 Bionics(Korea)에 주문 제작하였다. 10×PCR bufferdntron, Korea), 2.5 mM dNTP (Intron, Korea)과 각각의 특정 primer에 증류수를 더하여 전체 양을 50 μl으로 맞춘 후 94℃ 에서 5분간 가열한 다음 94℃ 30초, 각각에 맞는 annealing 온도에서 30초간, 72℃ 에서 30초간 30 cycles을 시행하였다. 생성물을 1.
48시간 동안 각 조건에서 배양한 GEpC의 RNA를 분리하기 위해 RNA isolation solution과 chloroform으로 추출 후 isopropanol과 3% sodium acetate, 100% ethanol을 이용하여 침전시킨 다음 전체 RNA를 분리하였다. 전체 RNA 5 의 농도로 M-MLV reverse transcript tase(Intron, Korea)과 oligo-dT(KDR, Korea), 2.
이에 대한 의미는 이전 논문에서 상세히 서술하였다 [21]. AGE는 이전에 기술한 방법대로 준비한 것을 이용하였고 동시에 준비한 bovine serum albumin(BSA)를 대조군으로 하여 5 ㎍/ml의 농도로 배양액에 희석하여 투여하였다[19, 22, 23]. 약하여, 배양액 속 당의 농도를 5 또는 30 mM로, AGE와 BSA를 첨가하고 osmotic control로서 당(포도당) 5 mM에 mannitol 25 mM을 섞은 것을 조합하여 A5, A30, Aosm, B5, B30으로 군을 나누었다[19, 22], 각 군의 의미는 이전 논문에서 상세히 서술하였다[21].
South San Francisco, California, USA)를 60분간 반응시키고 TBST로 세척한 후 LumiGLO chemiluminescent substrate를 이용하여 X-ray film에 노출시켰다. Band density를 densitome-try(LabWorks 4.0, UVP, Inc. Upland, CA, USA)로 각각 측정하여 각 조건의 결과를 비교하였다.
ZO-1에 대한 PCR 생성물을 481 base pairs에서 확인할 수 있었으며 ZO-l mRNA의 표현양을 GAPDH mRNA 의 표현양으로 교정한 후 B5의 결과를 대조군으로 하여 각 군의 결과를 비교하였다. RT-PCR 에 의한 ZO-1의 band density는 고농도의 당을 첨가한 B30에서 8.
5). 각각의 세포 크기를 프로그램을 통하여 동일하게 한 후 비교하였다.
관찰은 Fluorescence microscope(TCS SP2 AOBS, Leica, Germany)으로 FITC-conjugated는 emission 496-534 nm, excitation 488 nm의 파장으로, TRITC-conjugated는 emission 555-635 nm, excitation 543 nm의 파장으로 항원의 분포변화를 관찰하였다. 공간적 분석은 핵 주위로 양쪽 세포막을 연결하는 직선 위에 분포한 염색물질을 색깔별로 분리하고 이를 도식화하였다(Leica confocal software v2.5). 각각의 세포 크기를 프로그램을 통하여 동일하게 한 후 비교하였다.
5 ㎍/ml의 농도로 희석한 후 검체 당 200 씩 37℃ 에서 40분간 반응시켰고, 다음 triton X-100이 들어있는 PBS로 10분간 3회 세척하고 다시 PBS로 2회 세척한 후 slide glass 위에 mount media을 적당량 떨어드린 후 cover glass를 덮어 관찰하기 전까지 4℃에서 보관하였다. 관찰은 Fluorescence microscope(TCS SP2 AOBS, Leica, Germany)으로 FITC-conjugated는 emission 496-534 nm, excitation 488 nm의 파장으로, TRITC-conjugated는 emission 555-635 nm, excitation 543 nm의 파장으로 항원의 분포변화를 관찰하였다. 공간적 분석은 핵 주위로 양쪽 세포막을 연결하는 직선 위에 분포한 염색물질을 색깔별로 분리하고 이를 도식화하였다(Leica confocal software v2.
02 M glycine이 들어있는 PBS을 이용하여 3번 세척하였다. 그 후 비특이적인 배경을 최소화하기 위하여 10% normal goat serum(GIBCO BRL, Rockville, MD, USA)을 well 당 200 μl씩 처리하여 37℃에서 30분간 배양한 다음 goat serum을 버리고 monoclonal mouse anti-rat ZO-l(Zymed Laboratories Inc. South San Francisco, CA, USA) 항체를 l:50 으로 희석하여 well 당 200 μl 씩 37℃에서 1시간 배양한 뒤 PBS를 이용하여 10분간 3번씩 shaker에서 세척하였다. FITC-conjugated antimouse IgG 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 우선 25 μg/ml으로 PBS 에 희석하여 37 ℃ 에서 40분간 배양하고 0.
혼합하여 흔히 비교한다. 따라서 전술한 유지배양액에 5 mM의 당에 인슐린을 생리적 농도인 0.66 unit/ml를 포함시킨 배양액과 인슐린을 섞지 않은 30 mM 의 당을 배합한 배양액으로 48시간 동안 배양하여 이들 세포를 실험에 이용하였다. 이때 배양액은 4일에 한차례 교환하고 분리 전 배경를 줄이기 위하여 fetal calf serume 0.
5 mM dNTP(Intron, Korea), 그리고 증류수로 최종 20 μl로 부피를 맞춘 후 37℃ 에서 20분간 반응 후 90℃ 에서 효소의 반응을 불활성화시킨 후 합성된 cDNA을 주형으로 RT-PCR을 수행하였다. 사용한 백서의 ZO-1 sense의 염기서열은 5'-CGTTCTAGAAGATAGCCTGC—3'이고, antisense의 염기서열은 5'-CTCTTGGAGCT-GCGAAGACC-3'이었으며 housekeeper로서 백서의 GAPDH sense의 염기서열은 5'-CTCTA-CCCACGGCAAGTTCAA-3' 이 고, antisense 의 염기서열은 5—GGATGACCTTGCCCACAGC- 3, 이었고 Bionics(Korea)에 주문 제작하였다. 10×PCR bufferdntron, Korea), 2.
5 mM dNTP (Intron, Korea)과 각각의 특정 primer에 증류수를 더하여 전체 양을 50 μl으로 맞춘 후 94℃ 에서 5분간 가열한 다음 94℃ 30초, 각각에 맞는 annealing 온도에서 30초간, 72℃ 에서 30초간 30 cycles을 시행하였다. 생성물을 1.5% agarose gel을 이용하여 각 시료의 PCR 생성물 15 μl를 전기영동하고 ethidium bromide로 염색하여 UV light 하에서 Polaroid film에 감광시키고 densitometry (LabWorks 4.0, UVP, Inc. Upland, CA, USA)로 각각 측정한 후 GAPDH의 값으로 보정하였다.
AGE는 이전에 기술한 방법대로 준비한 것을 이용하였고 동시에 준비한 bovine serum albumin(BSA)를 대조군으로 하여 5 ㎍/ml의 농도로 배양액에 희석하여 투여하였다[19, 22, 23]. 약하여, 배양액 속 당의 농도를 5 또는 30 mM로, AGE와 BSA를 첨가하고 osmotic control로서 당(포도당) 5 mM에 mannitol 25 mM을 섞은 것을 조합하여 A5, A30, Aosm, B5, B30으로 군을 나누었다[19, 22], 각 군의 의미는 이전 논문에서 상세히 서술하였다[21].
유지 배양액으로는 10% fetal bovine serum (FBS), 1 M Hepes, 0.2 M L-glutamine, 0.01 U/mL insulin 그리고 항생제를 혼합한 RPMI 1640 배양액 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)을 사용하였고 배경를 줄이기 위해 각각의 실험 전에 FBS 0.5%만을 첨가하였다. 배양액 교환은 3일에 한번씩 하였고 계대배양은 0.
다음 전체 RNA를 분리하였다. 전체 RNA 5 의 농도로 M-MLV reverse transcript tase(Intron, Korea)과 oligo-dT(KDR, Korea), 2.5 mM dNTP(Intron, Korea), 그리고 증류수로 최종 20 μl로 부피를 맞춘 후 37℃ 에서 20분간 반응 후 90℃ 에서 효소의 반응을 불활성화시킨 후 합성된 cDNA을 주형으로 RT-PCR을 수행하였다. 사용한 백서의 ZO-1 sense의 염기서열은 5'-CGTTCTAGAAGATAGCCTGC—3'이고, antisense의 염기서열은 5'-CTCTTGGAGCT-GCGAAGACC-3'이었으며 housekeeper로서 백서의 GAPDH sense의 염기서열은 5'-CTCTA-CCCACGGCAAGTTCAA-3' 이 고, antisense 의 염기서열은 5—GGATGACCTTGCCCACAGC- 3, 이었고 Bionics(Korea)에 주문 제작하였다.
대상 데이터
Kreisberg가 성상을 확인하고 공여한 백서의 GEpC를 배양하여 실험에 이용하였다[18, 19]. 유지 배양액으로는 10% fetal bovine serum (FBS), 1 M Hepes, 0.
본 연구에서 사용한 비가역적인 AGE는 세포 표면의 수용체와 반응하여 광범위한 신손상과 관련된 일련의 세포작용을 일으킨다[38, 39]. 본 연구에서는 AGE와 고농도 포도당으로 자극한 당뇨병성 신병증 환경에서의 GEpC에서 ZO-1의 분포는 in vivo 비당뇨병성 신증에서의 보고와 유사하게, 그리고 본 연구자가 보고하였던 α-actinin-4 의 결과[21]와 유사하게 세포질의 바깥에서 안쪽으로 이동하는 양상(cytoplasmic translocation)을 보였다.
데이터처리
대조군과 함께 각 항목에 대하여 Western 분석은 4회, RT-PCRe 5회 실험한 후 결과를 비모수적 Mann-Whitney U test 방법으로 통계처리하였으며 P값이 0.05 미만일 때 통계학적 유의성을 두었다.
성능/효과
Bands는 205 kD 부위에서 관찰할 수 있었으며 가장 생리적 환경인 B5 결과를 대조군으로 하여 각 군의 ZO-L의 band density를 비교하였을 때 당을 첨가한 B30에서 11.1%, AGE를 첨가한 A5에서는 2.3%가 감소하였나 유의하지는 않았다. 그러나 당과 AGE를 동시에 첨가한 A30에서는 19.
RT-PCR 에 의한 ZO-1의 band density는 고농도의 당을 첨가한 B30에서 8.2%의 감소와 AGE를 추가한 조건인 A5에서 5.0%의 감소를 보였으나 통계적인 의의는 없었고(p>0.05, Fig. 5), AGE와 고농도의 당을 동시에 추가한 조건인 A30에서 12.0%의 의의 있는 감소를 보였다(P<0.05, Fig. 5). A30에서의 감소는 A5의 결과와도 유의한 감소를 보였다(p<0.
4). 따라서 고농도의 당과 AGE에 의해 GEpC의 ZO-1 단백량은 감소하는 양상을 보였고 이러한 양상은 삼투압 차이 효과가 아닌 당과 AGE에 의한 효과임을 알 수 있었다.
일련의 세포작용을 일으킨다[38, 39]. 본 연구에서는 AGE와 고농도 포도당으로 자극한 당뇨병성 신병증 환경에서의 GEpC에서 ZO-1의 분포는 in vivo 비당뇨병성 신증에서의 보고와 유사하게, 그리고 본 연구자가 보고하였던 α-actinin-4 의 결과[21]와 유사하게 세포질의 바깥에서 안쪽으로 이동하는 양상(cytoplasmic translocation)을 보였다. 그러나, Western blot 및 RT-PCR 검사에서 ZO-1의 mRNA의 표현양상의 감소와 함께 단백수준에서 생성이 감소하였는데, 이는 ZO-1 mRNA와 단백의 발현이 고농도 포도당으로 자극한 족세포 및 실험적 당뇨병성 신병증의 사구체에서 증가하였다는 이전의 보고와는 상반된다.
Kurihara 등[11]은 정상적으로 세극막의 세포질 표면을 따라 존재하던 ZO-1이 puromycin aminonucleoside에 의해 유발된 신증후군 동물모델에서 기존의 세극막 뿐만 아니라 새로 생긴 occluding-type junctions을 따라서 집합함을 면역전자현미경으로 관찰하였다. 이 결과들은 양적 변화까지는 관찰하지 않았으나 족돌기의 미세구조변화가 없이도 단백뇨가 있는 상태에서 ZO-1 분포의 재분배가 일어남을 의미한다. 이와 같이 실험적인 사구체 병리적 환경에서 ZO-1은 발현이 감소 혹은 분포의 재분배 등이 일어남을 알 수 있고 이러한 결과는 본 연구에서 보이는 실험적 당뇨병 환경에서의 ZO-1 발현의 감소와 재분포와의 관련성을 추론할 수 있다.
그러나 osmotic control(Aosm)에서는 유의한 변화를 관찰할 수 없었다. 즉, 고농도의 당과 AGEe 유전자 수준에서 GEpC의 ZO-1의 생성을 억제시키고 ZO-1를 세포질 내로 이동시키는 분포의 변화를 초래하였다.
3). 핵의 옆면에 분석면을 정하여 분식하였을 때 정상 생리적인 환경인 B5에서 B30, A5를 거쳐 가장 병적인 A30 환경으로 진행할수록 ZO-1는 세포질의 바깥에서 안쪽으로 이동하는 양상(cytoplasmic translocation)을 보였다(Fig. 3).
후속연구
결론적으로, AGE 와 고농도의 당에 의한 GEpC의 Z0-1 단백의 분포변화와 양의 감소로서 장기간 당뇨환경에서 족돌기의 기능적 변화를 추측할 수 있을 것이며 추후 AGE에 의한 Z0-1의 변화 기전에 대한 연구 및 in vivo 당뇨병성 신병증에서 시기별 Z0-1의 양과 분포변화에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
아직 당뇨병성 신병증 환자의 신조직에서 ZO-1 에 대한 보고는 없으나 전술한 환자조직에서 ZO-1의 분포변화는 관찰하지 않았으며, 양의 변화를 관찰할 수 없다는 결과는 조직채취시기, 방법의 차이, 실제 검사자체의 문제 등에 대한 추후 확인이 필요하리라 사료된다.
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