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문제 정의
- 25±1℃로 배양하던 C. dubia를 온도를 올린 상태에서 독성 물질에 접촉하였을 적에 생존에 미치는 영향을 알아보았다. 즉, 50 mL 비 이 커 에 19mL의 배 양액 을 채 우고 water bath를 이용하여 배지의 온도를 소정의 온도로 올린 후, 각각의 비이 커에 C.
- magw의 독성영향 결과를 제시하였다. 본 연구는 인체 및 여러 생물체에 유해하게 작용하는 몇 가지 유해 중금속 및 독성물질에 대해 USEPA (USEPA, 1989) 에서 권장하는 C. dubia를 이용하여 독성물질에 C. dubia 유생 을 노출시킬적에 물리적인 환경요인 중 온도를 기존 조건 (20-25℃)보다 높혀 측정시간을 단축시키는 새로운 독성조사 법을 정립하고자 하여 Toxicity Test Based on Temperature Control (TTBTC) 조사법을 처음으로 시도하였으며, 아울러 기존의 48시간 독성조사법과 독성에 대한 민감도를 상호 비교 하였다.
제안 방법
- dubia 의 실험온도는 25 ℃ 이었다. 48시간 LG(값은 각각의 독성농도 와 공시료에서 살아있는 C. dubia의 수를 세어 결정하였다. TTBTC 독성조사법은 25±1℃에서 배양되던 C.
- C. dubia의 유생을 카드뮴, 구리, 아연 등의 중금속에 노출시 키고 표준 48시간 독성조사법 및 TTBTC법으로 독성을 각각 측정하였다. 온도 35.
- dubia의 수를 세어 결정하였다. TTBTC 독성조사법은 25±1℃에서 배양되던 C. dubia를 온도를 올린 상태에서 독성물질에 접촉시켜 독성조사를 실시하였다. 실험절차는 Fig.
- dubia를 각각 10마리씩 넣고 독성물질에 노출시켰다. 대조군이 생존에 영향을 받지 않는 온도범위와 접촉시간을 알아보고자 온도를 35.5, 36.0, 36.5, 37.0 ℃ 로 조정하고 접촉시간을 200분까지 관찰하여 생존개체를 헤아렸다. 이러한 실험 은 10회 반복하여 관찰하였다.
- 배양온도는 항온조를 이용하여 25℃로 유지하였고, 충분하게 공기를 주입하기 위해 폭기장치로 수표면을 폭기시 키고, 조명은 형광등으로 하였으며, 빛의 강도는 약 10- 20/zE/m2/s (50 to lOOR-c)로 유지하였고, 명암주기 16:8(L:D) 의 광주기로 조절하였다. 배양액의 교환은 주 1회로 하고, 배양액 교환에 의한 상기 생물이 받을 충격을 줄이기 위해 배양액 교환은 2/3 이하로 하였다. C.
- 배양액은 Park (2003)에 의거 하여 중수 (moderate hardwater)를 사용하였고, 그 조성은 Table 1과 같다. 배양온도는 항온조를 이용하여 25℃로 유지하였고, 충분하게 공기를 주입하기 위해 폭기장치로 수표면을 폭기시 키고, 조명은 형광등으로 하였으며, 빛의 강도는 약 10- 20/zE/m2/s (50 to lOOR-c)로 유지하였고, 명암주기 16:8(L:D) 의 광주기로 조절하였다. 배양액의 교환은 주 1회로 하고, 배양액 교환에 의한 상기 생물이 받을 충격을 줄이기 위해 배양액 교환은 2/3 이하로 하였다.
- Data point로 이루어진 Probit regression line draw는 ECso값과 그것의 정확도를 즉정하기 위해 사용된다. 본 프로그램을 사용하기 위해서는 대조군을 제외한 독성물질 노출농도의 수가 3개 이상 20개 이하이어야 하며, 적어도 두 가지 농도에서 0%보다 크고 100%보다 mortality 반응을 보여야 한다.
- 표준 48시간 독성조사법 (USEPA, 1989; OECD, 2000)과 TTBTC 독성조사법 두 가지를 행하였다. 실험에 사용하는 대상 생물이 어릴수록 독성물질에 민감함으로 태어난지 24시간 이내 인 C. dubia의 유생 (young juvenile)을 이용하여 독성실험을 행하였고, 실험기간 중에 먹이는 제공하지 않았다. 표준 48시간 독성조사법은 C.
- 위의 실험에서 대조군의 생존에 영향을 미치지 않는 적정 온도 범위와 접촉시간의 결과를 바탕으로 C. du버a를 각각 10마리씩 20mL의 같은 배양액과 함께 50mL의 비이커에 옮 긴 후 소정의 독성물질을 첨가하여 0-1.5시간 접촉 후 물벼룩 의 유영저해도를 살펴보고 움직이는 것과 움직이지 않는 개개의 C. d泌M의 개체수를 세었다. 여기서 생존여부의 기준은 시료가 든 비이커를 약하게 2-3회 회전시킨 다음 움직이는 것은 생존한 것으로 간주하며 그렇지 않은 것은 치사한 것으로 간주하였다.
- dubia를 온도를 올린 상태에서 독성 물질에 접촉하였을 적에 생존에 미치는 영향을 알아보았다. 즉, 50 mL 비 이 커 에 19mL의 배 양액 을 채 우고 water bath를 이용하여 배지의 온도를 소정의 온도로 올린 후, 각각의 비이 커에 C. dubia를 각각 10마리씩 넣고 독성물질에 노출시켰다. 대조군이 생존에 영향을 받지 않는 온도범위와 접촉시간을 알아보고자 온도를 35.
- 표준 48시간 독성조사법 (USEPA, 1989; OECD, 2000)과 TTBTC 독성조사법 두 가지를 행하였다. 실험에 사용하는 대상 생물이 어릴수록 독성물질에 민감함으로 태어난지 24시간 이내 인 C.
- dubia의 유생 (young juvenile)을 이용하여 독성실험을 행하였고, 실험기간 중에 먹이는 제공하지 않았다. 표준 48시간 독성조사법은 C. 出切k배양액에 C. dubia의 유생을 각각 10마리씩 넣고 독성실험을 행하였다. 정적인 독성실험에서 실험생물을 각 비이커에 넣어 48시간 유지시켰다.
대상 데이터
- 모든 시약의 제조에는 2차 증류수를 사용하였으며, 독성을 조사하기 위한 독성물질은 CdC12-2/3H2O, ZnSO4-7H2O, CuSO4'5H2O, KCN, PCP (pentachlorophenol), phenol 등으로 모두 Junsei Chemical Co. (日 本)의 특급시약을 사용하였다. 중금속류인 Cd, Zn, Cu 등은 100 ppm의 모액을 만들었고, 음이온인 CN의 경우는 1,000 ppm, 유기독성 인 PCP는 1,000 ppm, phenol의 경우는 2,000 ppp의 모액을 만들어 사용하였다.
- dubia를 독성실험대상물로 사용하였다. 배양액은 Park (2003)에 의거 하여 중수 (moderate hardwater)를 사용하였고, 그 조성은 Table 1과 같다. 배양온도는 항온조를 이용하여 25℃로 유지하였고, 충분하게 공기를 주입하기 위해 폭기장치로 수표면을 폭기시 키고, 조명은 형광등으로 하였으며, 빛의 강도는 약 10- 20/zE/m2/s (50 to lOOR-c)로 유지하였고, 명암주기 16:8(L:D) 의 광주기로 조절하였다.
- 본 실험에서는 중금속과 유기화합물에 민감한 C. dubia를 독성실험대상물로 사용하였다. 배양액은 Park (2003)에 의거 하여 중수 (moderate hardwater)를 사용하였고, 그 조성은 Table 1과 같다.
- (日 本)의 특급시약을 사용하였다. 중금속류인 Cd, Zn, Cu 등은 100 ppm의 모액을 만들었고, 음이온인 CN의 경우는 1,000 ppm, 유기독성 인 PCP는 1,000 ppm, phenol의 경우는 2,000 ppp의 모액을 만들어 사용하였다. 각 독성물질의 실험시 사용농도는 Table 2와 같이 조절하여 사용하였다.
데이터처리
- 여기서 생존여부의 기준은 시료가 든 비이커를 약하게 2-3회 회전시킨 다음 움직이는 것은 생존한 것으로 간주하며 그렇지 않은 것은 치사한 것으로 간주하였다. 실험 개체의 50%에 영향을 미치는 독성농도인 LC%은 실험자료를 이용하여 USEPA (1994)에 의해 개발된 컴퓨터 통계프로그램 (toxnal)을 사용하여 Ihr, 1.25 hr, 1.5시간 및 48시간 독성실험에서 각각의 LCso값을 구하였다.
이론/모형
- 본 실험에서는 통계분석을 위해 Probit method를 사용하였다. Probit method는 적어도 두 가지 농도에서 mortality가 실험에서 구해졌을 때 사용한다.
성능/효과
- 본 실험으로 얻은 결론은 표준 48시간 조사법으로 실험시 얻은 결과와 크게 차이가 없으며, 또한 기보고된 값의 범위에 포함됨을 알 수 있었다 (Cd = 40.1 eg/L, Cu=14.6"g/L, Zn =45.2 “g/L, PCP = 0.2 mg/L). 또한, TTBTC 독성조사법은 별도의 고가 장비나 비싼 시약을 요구치 않아 타 독성조사법에 비해 보다 경제적인 독성조사법으로 사료된다.
- 음이온 독성인 시안도 중금속의 경우와 유사하게 온도가 증가함에 따라 LC50이 감소하였으며, 1.5 hr 노출시켰을 때 48 hr 독성조사법 의 LC"인 0.290 ppm보다도 낮은 0.208 ppm 이 측정 되 었다 (Fig. 5). 유기독성 인 PCP와 Phenol도 중금속 독성 및 시안 독성과 마찬가지로 온도가 증가하면서 LC50이 감소하였다 (Fig.
- test, 무지 개송어를 이용한 96 시간 노출시험 범위에 포함됨을 알 수 있었다. 1.25-hr TTBTC법과 CerioFastWe 적어도 중금속 테 스트에서는 거의 유사한 민감도를 가짐을 알 수 있었다.
- 6(48 hr) ppb 이 었으며 , 카드뮴과 마찬가지로 노출 시간이 길어지면서 독성이 커졌다. 95% 신뢰구간을 비교하면 1.5 hr의 결과가 48 hr보다 민감하게 나타났으며, 1.25 hr의 결 과와도 많은 차이가 나지 않음을 알 수 있었다. 아연은 1.
- 법, 30분 Microtox법, 96시간 무지개송어 노출실험에 대한 카드뮴, 구 리, 아연 등 중금속과 음이온인 CN 및 유기독성물질인 pentachlorophenol (PCP)의 독성을 기보고된 결과와 비교한 것이 Table 3이다. TTBTC독성조사법, 1시간 CerioFAST™^ 은 측정된 독성물질에 대해 상당히 유사한 독성을 보였으며, 특히 음이온성 CN류에 매우 민감한 것으로 독성을 신속히 측정할 수 있어 최근 독성조사법으로 많이 이용되고 있는 Microtox법의 결과와 본 연구에서 수행한 TTBTC법의 결과를 비교하면, 온도증가를 이용한 TTBTC 독성조사법이 중금속인 경우 10-300배 민감함을 알 수 있으며, 음이온인 CN인 경우는 16배 민감하고, 유기독성 Phenol의 경우는 약 2배 가량 민감하 게 나타났다.
- TTBTC법의 서로 다른 접촉시간 특히, 1.25-hr에서 표준 48시간 급성독성조사법과 좋은 상관관계가 있음이 관찰되었 으며, 이것은 화학적인 발광을 이용한 Microtox법, Daphnia “zagg의 /^-galactosidase의 inhibition을 이용한 I.Q. test, 무지 개송어를 이용한 96 시간 노출시험 범위에 포함됨을 알 수 있었다. 1.
- 독성물질은 모두 노출시간이 증가함에 따라 LGo。] 감소하였으며, 1.5 hr의 노출시간에서는 표준 48시간 독성조사법의 결과와 비교하여 LCso값이 유사하거나 약간 낮았다.
- du버a가 치사되었다면 이것이 온도의 영향인지 독성물질의 영향인지 구별하기는 매우 곤란하다. 따라서 C. dubia가 온도변화에 따라 치사하는 정도를 조사한 결과 (Fig. 2), 35.5℃에서는 초기 100분까지는 사망한 개체가 없다가 110분이 경과하면서 서서 히 사멸하기 시작하였으며, 36.0P에서는 사멸시간이 조금 빨라져 40분부터 사멸하는 것을 관찰하였다. 온도를 더욱 올 리면 사멸하기 시작하는 시간이 더욱 빨라져 36.
- 0℃에서는 10분부터 사멸하기 시작하였으며, 이 온도에서는 약 40분이 경과하자 대부분 사멸하였다. 따라서 C. dubia가 온도에 대한 영향을 최대한 받으면서 대조군이 사멸하지 않는 온도 및 접촉시간 범위는 35.5℃에서 100분 이내로 결정하는 것이 좋을 것으로 판단되었다.
- 중금속 물질에 대한 전체적인 경향은 노출시간이 증가할수록 LGo이 감소하였고 노출시간이 1.5 hr일 때 표준 48시간 독성조사법의 결과값과 유사하게 나타났다.
- 5 hr)였다. 즉, 노출시간이 길어질수록 48시간 독성조사법의 결과와 유사하거나 더 민감하게 관찰되었다. 이때 48시간 독성조사법과 비교하여 Phenole 1.
후속연구
- 따라서 TTBTC독성조사법이 새로운 독성물질 스크리닝 방법으로 사용될 수 있는 가능성을 제시하였다. 또한 독성조사 법으로써 사용되기 위해서는 보다 다양한 종류의 독성물에 대한 시험이 이루어져야 할 것이며, 독성조사법에 가장 민감 한 외부조건인 온도의 정확한 제어가 이루어질 수 있도록 후속된 연구가 필요한 것으로 사료된다.
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