내부기생봉의 일종인 프루텔고치별(Cotesia plutellae)이 배추좀나방(Plutellae xylostella)을 대상으로 생물적 방제제로 이용되고 있다. 이 기생봉은 생식기관에 폴리드나바이러스를 공생시키고, 이 바이러스의 존재는 기생봉의 성공적 기생에 필수적이다. 본 연구는 암컷 프루텔고치벌 성장에 따라 플리드나바이러스의 복제시기를 결정하였으며, 또한 교미나 기주 요인에 따른 암컷의 생식 능력을 분석하였다. 기생봉은 $25^{\circ}C$ 발육조건에서 용화 2일째 겹눈과 날개와 같은 성충조직을 발달시키기 시작했으며, 5일째에는 촉각을 포함한 모든 성충조직이 발달되어 우화 직전 단계의 모습을 보였다. 프루텔고치벌 폴리드나바이러스에 대한 다클론성항체에 의한 면역블로팅 분석은 용화 4일째에서 바이러스 복제를 확인할 수 있었다. 바이러스 입자들은 용화 5일째 산란관 내부에서 투과전자현미경으로 관찰되었다. 우화후 난소소관의 길이는 변하지 않았지만, 독샘과 난소받침의 크기는 증가했다. 교미한 암컷은 $25^{\circ}C$에서 약 8일관 생존하였으며, 초기 4일동안 집중된($60\%$ 이상) 산란을 보였다. 미교미 암컷은 교미한 암컷에 비해 낮은 산란을 보였으며, 이 미수정난은 모두 수컷으로 발육하였다. 프루텔고치벌은 배추좀나방과 미국흰불나방(Hyphantria cunea)모두를 기생시킬 수 있었다. 그러나 배추좀나방에서 더 빠르고, 높은 기생율을 보였다.
내부기생봉의 일종인 프루텔고치별(Cotesia plutellae)이 배추좀나방(Plutellae xylostella)을 대상으로 생물적 방제제로 이용되고 있다. 이 기생봉은 생식기관에 폴리드나바이러스를 공생시키고, 이 바이러스의 존재는 기생봉의 성공적 기생에 필수적이다. 본 연구는 암컷 프루텔고치벌 성장에 따라 플리드나바이러스의 복제시기를 결정하였으며, 또한 교미나 기주 요인에 따른 암컷의 생식 능력을 분석하였다. 기생봉은 $25^{\circ}C$ 발육조건에서 용화 2일째 겹눈과 날개와 같은 성충조직을 발달시키기 시작했으며, 5일째에는 촉각을 포함한 모든 성충조직이 발달되어 우화 직전 단계의 모습을 보였다. 프루텔고치벌 폴리드나바이러스에 대한 다클론성항체에 의한 면역블로팅 분석은 용화 4일째에서 바이러스 복제를 확인할 수 있었다. 바이러스 입자들은 용화 5일째 산란관 내부에서 투과전자현미경으로 관찰되었다. 우화후 난소소관의 길이는 변하지 않았지만, 독샘과 난소받침의 크기는 증가했다. 교미한 암컷은 $25^{\circ}C$에서 약 8일관 생존하였으며, 초기 4일동안 집중된($60\%$ 이상) 산란을 보였다. 미교미 암컷은 교미한 암컷에 비해 낮은 산란을 보였으며, 이 미수정난은 모두 수컷으로 발육하였다. 프루텔고치벌은 배추좀나방과 미국흰불나방(Hyphantria cunea)모두를 기생시킬 수 있었다. 그러나 배추좀나방에서 더 빠르고, 높은 기생율을 보였다.
An endoparasitoid wasp, Cotesia plutellae, has been used for a biological control agent against the diamondback moth, Plutellae xylostella. It has a symbiotic polydnavirus in their reproductive tract, which is required for its successful parasitization. Here, we measured a specific replication time ...
An endoparasitoid wasp, Cotesia plutellae, has been used for a biological control agent against the diamondback moth, Plutellae xylostella. It has a symbiotic polydnavirus in their reproductive tract, which is required for its successful parasitization. Here, we measured a specific replication time of the polydnavirus during female development of C. plutellae. We, also, analyzed the reproductive potentials of female C. plutellae under mating or different host conditions. At $25^{\circ}C$, pupal C. plutellae began to develop adult tissues such as compound eyes and wings since day 2. At day 5, all adult tissues including antennae were developed and were ready to emerge. With polyclonal antibody raised against C. plutellae polydnavirus, an immunobloting could confirm virus replication at day 4 during pupal stage. Virus particles could be visualized by transmission electron microscope in the oviduct lumen of day 5 pupae. After adult eclosion, venom gland and ovarian calyx increased in size, though ovarioles did not. Mated females layed large number of eggs (over $60\%$) at first 4 days during their mean longevity of ca. 8 days at $25^{\circ}C$. Unmated females showed less active ovipositional behavior, where all the eggs developed into males. C. Plutellae parasitized both P. xylostella and fall webworm, Hyphantria cunea. However, C. Plutellae developed faster and showed higher successful paarasitization in P. xylostella than in H. cunea.
An endoparasitoid wasp, Cotesia plutellae, has been used for a biological control agent against the diamondback moth, Plutellae xylostella. It has a symbiotic polydnavirus in their reproductive tract, which is required for its successful parasitization. Here, we measured a specific replication time of the polydnavirus during female development of C. plutellae. We, also, analyzed the reproductive potentials of female C. plutellae under mating or different host conditions. At $25^{\circ}C$, pupal C. plutellae began to develop adult tissues such as compound eyes and wings since day 2. At day 5, all adult tissues including antennae were developed and were ready to emerge. With polyclonal antibody raised against C. plutellae polydnavirus, an immunobloting could confirm virus replication at day 4 during pupal stage. Virus particles could be visualized by transmission electron microscope in the oviduct lumen of day 5 pupae. After adult eclosion, venom gland and ovarian calyx increased in size, though ovarioles did not. Mated females layed large number of eggs (over $60\%$) at first 4 days during their mean longevity of ca. 8 days at $25^{\circ}C$. Unmated females showed less active ovipositional behavior, where all the eggs developed into males. C. Plutellae parasitized both P. xylostella and fall webworm, Hyphantria cunea. However, C. Plutellae developed faster and showed higher successful paarasitization in P. xylostella than in H. cunea.
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문제 정의
본 연구는 프루텔고치벌의 성공적 기생에 중요한 폴리드나바이러스의 복제시기를 결정하는데 목표를 가겼고, 또한 이후 암컷의 산란 습성을 교미와 기주에 따라 조사하였다.
이는 프루텔고치벌에서는 비록 용 시기에 폴리드나바이러스 복제 가 유도되지만, 다른 기생봉에서 보는 바와 같이 성충 초기까지는 복제 속도가 증가할 수 있다는 것으로 해석된다(Webb, 1998). 본 연구의 조직별 구조 크기 성장 관찰자료를 살펴보면 초기 성충 시기에 바이러스 복제 관련 구조가 증가하는 점에서도 이를 뒷받침하고 있다. 또한 여러 번의 기생(산란) 후 소모된 산란관 내 바이러스는 복제를 통해 빠르게 보충된다는 점에서(Strand # 以, 1992) 바이러스 복제와 기주의 산란 습성과는 밀접한 관계가 있는 것으로 여겨진다.
가설 설정
용 시기에 탈피호르몬의 분비 신호에 따라 폴리드나 바이러스 복제 관련 유전자의 발현이 비롯되고 바이러스 복제를 유도한다는 가설은 이들 유전자의 유용성에 비춰 매우 흥미를 갖게 한다. 일부 폴리드나바이 러스의 유전자 전체 서열이 밝혀지면서, 이 바이러스 유래의 다양한 유전자 기능 군이 보고되고 있다.
이는 프루텔고치벌은 기주 조건에 따라 발육 속도를 조절할 수 있다는 점이다. 즉, 기주의 발육 관련 호르몬의 영향에 기생봉이 노출되어 있고, 이에 따라 기생봉의 발육 속도가 조절될 수 있다는 가설이다. 이러한 관계는 다른 고치벌류인 Diachasmi- morpha longgicaudata6^ ^-| 찾아볼 수 있다.
제안 방법
폴리드나바이러스를 관찰하기 위해 투과전자 현미 경을 이용하였다. 5일째 번데기 암컷으로부터 생식기관을 적출하고, 실내온도 2시간 동안 3% glutaralde- hyde가 포함된 0.2 M 인산 완충용액(pH 7.0)에서 고정되었으며, 이후 2%의 OsC>4에서 2시간 동안 다시 후고 정 처리되고, 0.1% aqueous urany] acetate에 12시간 이상 노출시켰다. 탈수 처리는 에타놀 농도별 (30-100%)로 30분씩 6단계에서 실시되었다.
우화된 암수 모두에게 50% 설탕물이 공급되고, 24시간 동안 상기의 일반 사육 조건에서 교미하게 했다. 배추좀나방 2령 충 시기에 교미 된 암수를 투입시켜 상기의 사육조 건에서 24시간 기생시켰다. 이때 배추좀나방과 암컷 고치벌의 비율은 3:1로 맞추었다.
(1997)은 암수의 비를 1:1로 제공하고, 배추좀나방 2, 3령을 매일 20마리씩 산란을 위해 공급하였다. 본 연구는 암수 비를 1 : 3으로 하여 교미를 더욱 유도하였고, 배추좀나방 2령 충을 매일 100마리 이상 공급하여 산란의 최적 조건을 제공하였다. 그래서 본 연구에서 보듯 우화 2일째에서는 일부 반복에서는 20개 이상의 산란을 기록하여 Oh et a/.
동일 고치벌 집단은 3회 이상 기생에 이용되지 않았다. 용화된 고치벌은 매일 수거하였으며, 일반 사육조건에서 일별 성충 조직 발달 분석에 이용하였다.
5% lead citrate에서 7분씩 이 중 염색되었다. 이후 투과전자현미경 (EM 109, Zeiss, Germany) 을 이용하여 관찰하였다.
1% aqueous urany] acetate에 12시간 이상 노출시켰다. 탈수 처리는 에타놀 농도별 (30-100%)로 30분씩 6단계에서 실시되었다. 이때 spurr resin (EMS, WA, USA)으로 70℃에서 18시간 동안 포매 처리되었다.
폴리드나바이러스를 관찰하기 위해 투과전자 현미 경을 이용하였다. 5일째 번데기 암컷으로부터 생식기관을 적출하고, 실내온도 2시간 동안 3% glutaralde- hyde가 포함된 0.
프루텔고치 벌의 폴리 드나바이 러스 복제 시기를 결정 하기 위해서 일별 발육된 고치벌 용에서 단백질을 추출하고, 이를 10% SDS-PAGE (sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis)에서 변성 전기영동 하였다. 분리된 단백질을 반건조상태로 nitrocellulose membrane으로 옮겼다(Moon and Kim, 2003).
분리된 단백질을 반건조상태로 nitrocellulose membrane으로 옮겼다(Moon and Kim, 2003). 프루텔고치벌 폴리드나바이러스 항체(1,000배 희석)와 결합 시킨 후 2차 항체의 alkaline phosphatase-f- 대상으로 nitro blue tetrazoIium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP, Sigma, USA)로 발색 반응시켰다
대상 데이터
Developmental period indicates time from oviposition to pupation. Each measurement consisted of 10 replications. Error bar indicates standard deviation.
xylostella larvae. Each measurement consisted of 5 replications. Error bar indicates standard deviation.
전 사육 기간 동안 온도 25±1 ℃, 상대습도 60±10%, 광주기 16:8h (L:D)의 조건에서 유지되었다. 미국흰불나방(H. cmlea) 유충은 누에 사료(한국 잠사협회, 청원)로 사육되었다. 일반적 사육조건은 배추좀나방과 동일하였다.
고치벌의 증식 기주로서 배추좀나방(R aVos伝〃a)을 이용하였다. 배추좀나방 유충은 배추잎으로 사육되었고, 성충은 10% 설탕물을 공급받았다. 전 사육 기간 동안 온도 25±1 ℃, 상대습도 60±10%, 광주기 16:8h (L:D)의 조건에서 유지되었다.
본 연구과제 수행은 농촌진흥청 바이오그린21 사업 과 한국과학재단의 지역대학 우수과학자지원프로그램 에서 지원받았다. 연구에 필요한 기자재는 농촌진흥청에서 지원하는 농학특성화대학 지원사업으로 확보되어 본 연구에 이용되었다.
프루텔고치벌은 안동에서 채집되어 실내 누대 사육된 집단(Bae and Kim, 2004)을 이용하였다. 우화된 암수 모두에게 50% 설탕물이 공급되고, 24시간 동안 상기의 일반 사육 조건에서 교미하게 했다.
데이터처리
고치벌 발육기 간, 조직 크기 및 산란 수 결과 분석은 SAS S로■그램 (SAS Institute, 1989)의 one-way ANOVA 분석 후 최소유의차 검정법으로 평균간 비교를 실시하였다.
이론/모형
고치벌 생식기관 관찰은 Kim and Kim (2004)의 방법으로 난소 소관, 독샘, 그리고 난소 받침의 크기를 각각 조사하였다. 이때 각 조직의 크기는 조직의 장축의 최대 길이를 측정한 것을 대표하였다.
성능/효과
4개를 나 타냈다. 교미 된 암컷은 암수 모두의 자손을 생성하는 반면, 미교미 암컷은 수컷 자손만 형성하는 생식 형태를 보였다.
그러나 미교미 암컷은, 약 13일까지 수명이 연장되었다. 교미 상태(암컷 1마 리: 수컷 3마리)의 암컷은 약 86개의 산란을 보였으며, 성충 우화 후 초기 4일까지 전체 60%의 산란이 이 뤄졌다(Fig. 3B). 교미 암컷의 일별 평균 산란 수는 12.
프루텔고치벌은 배추좀나방뿐만 아니라 미국 흰 불 나방도 기생시킬 수 있었다. 두 기주에서 각각 프루텔고치벌의 기생율과 산란 이후 고치 형성까지의 기간을 비교한 결과, 배추좀나방 기주에서 2배 이상의 기생율 과 빠른 발육 속도를 보였다(Fig. 4).
프루텔고치벌은 우화 초기부터 기생이 가능했고, 교미는 이러한 기생 활동을 촉진시키는 결과를 초래했다. 또한 두 자 연기 주중 배추좀나방에 대해서 월등한 발육 속도 및 기생율을 보였다. 본 연구에서는 한 마 리의 프루텔고치벌 암컷이 약 86마리의 배추좀나방을 기생시킬 수 있다고 측정하였는데, 이는 Ohefa/.
다음으로 발육에 따른 바이러스 복제 활동의 변이에 관해서 고찰해 볼 수 있다. 본 연구는 용화 4일째보다는 5일째 더욱 많은 바이러스양을 검출할 수 있었다. 전자현미경 구조 관찰은 5일째 용 시기 보다는 우화 첫날의 성충이 산란관에 더욱 많은 바이러스 입자를 가지고 있다는 것을 보였다{미보고자료).
비록 폴리드나바이러스의 게 놈이 기주 기생봉의 게놈에 프로바이러스 형태로 자리하기 때문에 어떠한 기주 세포에서도 바이러스 복제가 이론적으로 가능하지만, 현재까지 알려진 기생 봉-폴리드나바이러스 복합체에서는 단지 특정 시기의 암컷 생식기관에서만 바이러스 복제가 주로 이뤄진다고 보고되고 있다(Norton and Vinson, 1983; Webb and Summers, 1992). 본 연구의 프루텔고치벌의 폴리드나 바이러스도 용 시기에 바이러스 복제가 시작되며, 우화 할 때는 산란관에 바이러스가 밀집되어 있는 모습을 보였다. 그러나 이러한 특이적 바이러스 복제 기작에 관해서 알려진 사실은 없다.
정확한 바이러스 복제시기 를 결정하기 위해 25℃에서 사육된 고치벌 용을 일별로 분리하였다. 용 표피를 제거하고 성충조직의 발달을 조사한 결과, 용화 2일째부터 뚜렷한 성충조직(예, 겹눈, 날개)의 발달을 볼 수 있었고, 용화 5일째에는 촉각까지 모든 성충조직의 발달을 마치고, 우화 직전 단계를 보여주었다(Fig. 1A). 이러한 일별 고치벌 용으로부터 단백질을 추출하여, 프루텔고치벌 폴리드나바 이러스 항체로 면역블로팅 분석을 실시한 결과, 35 kDa의 바이러스 표피 단백질 이(Kim and Kim, 2004) 성충조직의 암화가 일어나는 4일째 및 5일째 추출물로부터 확인되었다(Fig.
우화 첫째 날부터 프루텔고치벌은 대상 곤충을 기생시킬 수 있다는 것이 관찰되었다. 이는 용 시기부터 미리 난황축적과정이나 폴리드나바이러스 복제가 시 작되 었다는 것을 의미한다.
1A). 이러한 일별 고치벌 용으로부터 단백질을 추출하여, 프루텔고치벌 폴리드나바 이러스 항체로 면역블로팅 분석을 실시한 결과, 35 kDa의 바이러스 표피 단백질 이(Kim and Kim, 2004) 성충조직의 암화가 일어나는 4일째 및 5일째 추출물로부터 확인되었다(Fig. IB). 전자현미경으로 5일째 고치벌 용 산란관을 살펴보면 전형적 폴리드나바이러스 입자가 자리하고 있는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
본 연구는 용화 4일째보다는 5일째 더욱 많은 바이러스양을 검출할 수 있었다. 전자현미경 구조 관찰은 5일째 용 시기 보다는 우화 첫날의 성충이 산란관에 더욱 많은 바이러스 입자를 가지고 있다는 것을 보였다{미보고자료). 이는 프루텔고치벌에서는 비록 용 시기에 폴리드나바이러스 복제 가 유도되지만, 다른 기생봉에서 보는 바와 같이 성충 초기까지는 복제 속도가 증가할 수 있다는 것으로 해석된다(Webb, 1998).
IB). 전자현미경으로 5일째 고치벌 용 산란관을 살펴보면 전형적 폴리드나바이러스 입자가 자리하고 있는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1C).
참고문헌 (17)
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