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문제 정의
- coli의 사람에 대한 직접적인 유해성 등에 대한 연구는 미비한 실정이다. 이에 본 연구에서는 동물로부터 분리된 용혈성 E. coli의 항생제 내성 경향과 이들이 생산하는 toxin의 전이 여부를 파악하고자 하였으며, 동물로부터 분리된 균주의 사람에 대한 직접적인 유해성 여부를 파악하기 위하여 사람 유래 세포주(human cell line)에 대한 부착능을 확인 W였다.
제안 방법
- PCR을 이용하여 enterotoxins (ST와 LT)과 verotoxins ("VT와 VTe) 유전자들을 검출하였다. 시험에 사용된 프라이머는 Table 1과 같다.
- 4)를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에서 배양시켰다. 동물에서 분리된 용혈성 E. coli (1X108 cells)를 T-24 세포와 Caco-2 세포(2X" cells)에 첨가하여 3WC의 5% CO2 항온기에서 1시간 반응시켰다. 인산완충용액으로 세척하여 부착되지 않은 박테리아를 제거한 후 메탄올로 고정하여 그람염색 후 광학현미경으로 세포에 부착 된 세균의 수를 계수하였다.
- 1997년과 1998년 사이에 설사 증상을 나타내는 돼지의 분변으로부터 E. coli 총 56균주를 분리하여 이들에 대한 용혈성 E. coli 검출 시험을 수행하였다.
- 25-128 |ig/ml 농도로 함유된 Muller-Hinton (MH) 한천배지에 CFU를 접종 하였다. 37℃ 항온기에 18 시간 배양 후 10개 이하의 집락이 형성된 농도를 MIC로 결정하였다. 결과의 정확성을 위하여 참조 균주인 E.
- 용혈성을 확인하기 위하여 한천 혈액 배지(Trypticase Soy Agar with 5% sheep blood, BBL, USA)에 각각의 균주를 계대 배 양하였다. 37℃ 항온기에서 18시간 배양한 후, 용혈성 (hemolysis) 여부를 판독하였다.
- 5-Lactamase의 생산 여부를 확인하기 위해 대수기의 세균을 초음파 파쇄기로 파쇄한 crude extract에 g-lactamase의 기질로 작용하는 nitrocefln 용액 (500 μg/ml)을 떨어뜨려 색깔의 변화로 β-lactamase의 생산 여부를 확인하였다.
- 0)에 놓고, Mini IEF 111 apparatus (Bio-Rad, Richmond, CA, USA)를 이용하여 100 V에서 15분, 200 V에서 15분, 450 V에서 1시간 전기영동 하였다. Gel에 nitrocefin 용액 (500μg/ml)을 떨어뜨려 ^-lactamase의 위치를 확인하였고, 이를 pl 표지 단백질의 pl를 사용하여 작성한 회귀곡선과 비교하여 pl 를 결정하였다.
- O (Ol~O169)와 H (H1~H51)의 항혈청(Denka Seiken, Tokyo, Japan)을 이용하여 응집 반응 형성 여부로 O와 H의 혈청형을 결 정하였다.
- 반응조건은 95℃에서 denaturation 10분, denaturation (95 ℃ 1분), annealing (ST와 LT, 52℃ 1 분; VT, 57℃ 1 분; VTe, 47℃ 1 분), extension (72℃ 1 분)의 과정을 30회 반복한 후 마지막으로 extension을 72℃에서 10분간 시행하였다. PCR 증폭 산물은 전기 영동하여 생산된 DNA 절편의 크기를 확인하였다.
- eLactamase의 pl를 측정하기 위해 IEF를 실시하였다. 대수기의 세균을 초음파 파쇄기로 파쇄한 crude extract를 ampholite gel (pH 3.
- 37℃ 항온기에 18 시간 배양 후 10개 이하의 집락이 형성된 농도를 MIC로 결정하였다. 결과의 정확성을 위하여 참조 균주인 E. coli ATCC 25922의 감수성을 동시에 측정하였다.
- coli 한 균주 (CCARM 1334)를 내성 수여자로 사용하였다. 내성 공여자와 수여자를 각각 brain heart infusion (BHI, Difco) 액체배지에 접종 하여 하룻밤 진탕 배양하였다. 공여자 배양액 50 ㎕와 수여자 배양액 450 ㎕를 새 BHI 액체배지 4.
- eLactamase의 pl를 측정하기 위해 IEF를 실시하였다. 대수기의 세균을 초음파 파쇄기로 파쇄한 crude extract를 ampholite gel (pH 3.0~ 10.0)에 놓고, Mini IEF 111 apparatus (Bio-Rad, Richmond, CA, USA)를 이용하여 100 V에서 15분, 200 V에서 15분, 450 V에서 1시간 전기영동 하였다. Gel에 nitrocefin 용액 (500μg/ml)을 떨어뜨려 ^-lactamase의 위치를 확인하였고, 이를 pl 표지 단백질의 pl를 사용하여 작성한 회귀곡선과 비교하여 pl 를 결정하였다.
- 동물로부터 분리된 균주가 사람에 직접 부착하여 위해성을 가할 수 있는지 확인하기 위해 사람 방광 유래 세포주인 T-24 세포 와 사람 장내표피 유래 세포주인 Caco-2 세포에 대한 부착능을 실험하였다. T-24 세포는 열로 불활화시킨 10% fetal bovine serum (FBS), 2 g의 sodium bicarbonate/L, antibiotic-antimycotic (pH 7.
- 세균이 접종된 배지는 37℃ 항온기에 18시간 배양 한 후 각 항생제 디스크 주위에 생긴 성장 억제환의 크기를 측정하여 NCCLS 기준에 따라 내성 여부를 확인하였다. 또한 clavulanic acid의 p-lactamase 억제 효과에 의한 억제대의 확장 현상이 5 mm 이상으로 관찰되면 ESBL 생산 양성으로 판정하였다. 결과의 정확성을 위하여 참조 균주 E.
- 45 wn nitrocellulose 여 과지 (Milipore, Bedford, MA)에 부착시킨 다음 37℃ 항온기에서 3시간 배양하였다. 배양된 여과지를 1ml의 새 BHI 액체배지에 넣어 진탕한 후 100)11를 취해, norfloxacin과 kanamycin0] 함유 된 MacConkey 한천배지에 각각 접종하였다. 37℃ 항온기에서 18시간 배양한 후 transconjugants를 선별하였다.
- 5로 탁도를 맞춘 세균현탁액을 면봉으로 MH 한천 배지에 고르게 접종한 후, 일정한 간격을 두고 cefotaxime (30 Iμg), cefotaxime과 clavulanic acid (cefotaxime 30과 clavulanic acid 10 μg), ceftazidime (301μg), ceftazidime과 clavulanic acid (cefotaxime 30 μg과 clavulanic acid 10μg)이 함유된 디스크를 올려놓았다. 세균이 접종된 배지는 37℃ 항온기에 18시간 배양 한 후 각 항생제 디스크 주위에 생긴 성장 억제환의 크기를 측정하여 NCCLS 기준에 따라 내성 여부를 확인하였다. 또한 clavulanic acid의 p-lactamase 억제 효과에 의한 억제대의 확장 현상이 5 mm 이상으로 관찰되면 ESBL 생산 양성으로 판정하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 순수 배양 된 집락을 멸균된 0.85% NaCl 용액에 McFarland nephelometer No. 0.5로 탁도를 맞춘 후 시험 항생제가 각각 0.25-128 |ig/ml 농도로 함유된 Muller-Hinton (MH) 한천배지에 CFU를 접종 하였다. 37℃ 항온기에 18 시간 배양 후 10개 이하의 집락이 형성된 농도를 MIC로 결정하였다.
- Ampicillin과 cephalothin에 내성이면서 g-lactamase를 생산하는 균주의 ESBL 생산 여부를 확인하기 위해 NCCLS 지침에 따라 double disk synergy 시험법을 수행하였다. 순수 배양된 집락을 백금침으로 채취한 후, 0.85% NaCl 용액에 McFarland nephelometer No. 0.5로 탁도를 맞춘 세균현탁액을 면봉으로 MH 한천 배지에 고르게 접종한 후, 일정한 간격을 두고 cefotaxime (30 Iμg), cefotaxime과 clavulanic acid (cefotaxime 30과 clavulanic acid 10 μg), ceftazidime (301μg), ceftazidime과 clavulanic acid (cefotaxime 30 μg과 clavulanic acid 10μg)이 함유된 디스크를 올려놓았다. 세균이 접종된 배지는 37℃ 항온기에 18시간 배양 한 후 각 항생제 디스크 주위에 생긴 성장 억제환의 크기를 측정하여 NCCLS 기준에 따라 내성 여부를 확인하였다.
- 37℃ 항온기에서 18시간 배양한 후 transconjugants를 선별하였다. 유전자 전달을 확인을 위하여 transconjugants의 toxin 유전자는 PCR로 확인하 였고, 내성은 항생제 한천 희석법을 사용하여 항생제 내성 전달 여부를 확인하였다.
- Filter mating 방법에 따라 유전자 전달 시험을 실시한 결과로부터 2개의 transconjugants를 얻었다. 이들의 항생제 내성 유전 자 전이 현상을 확인하기 위해 항생제 억제 최소농도를 실험한 결과는 Table 4와 같고, toxin 유전자 전이는 PCR과 전기영동을 이용하여 확인하였다(Fig. 2). 특히 내성 수여자로부터 내성 공여 자로의 역전달 현상을 배제하기 위하여, 내성 수여자는 플라스미드가 아닌 염색체에 의해 내성이 매개되어 쉽게 전달되지 않는 특징을 가진 퀴놀론계 항생제인 norfloxacin에 내성을 가진 균주를 선별하였다.
- 인산완충용액으로 세척하여 부착되지 않은 박테리아를 제거한 후 메탄올로 고정하여 그람염색 후 광학현미경으로 세포에 부착 된 세균의 수를 계수하였다. 이때 무작위로 20 필드를 선정하고 각 필드의 세포에 부착된 세균의 수를 계수하고, 이들을 평균하여 필드당 부착된 세균의 수를 계산하였다. 이때 필드당 부착된 세균의 수가 100개를 넘는 경우 강한 부착성을 가진 것으로 판 단하였다.
- coli (1X108 cells)를 T-24 세포와 Caco-2 세포(2X" cells)에 첨가하여 3WC의 5% CO2 항온기에서 1시간 반응시켰다. 인산완충용액으로 세척하여 부착되지 않은 박테리아를 제거한 후 메탄올로 고정하여 그람염색 후 광학현미경으로 세포에 부착 된 세균의 수를 계수하였다. 이때 무작위로 20 필드를 선정하고 각 필드의 세포에 부착된 세균의 수를 계수하고, 이들을 평균하여 필드당 부착된 세균의 수를 계산하였다.
- PCR 반응조건은 95℃에서 denaturation 10분, denaturation (95℃ 1분), annealing (56℃ 1분), extension (72 ℃ 1분)의 과정을 30회 반복한 후 마지막으로 extension을 72℃ 에서 10분간 시행하였다. 증폭된 산물 5 μ1를 1% agarose gel에 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr)로 염색하여 생산된 DNA 단편의 크기를 확인하였다.
대상 데이터
- 내 성 공여자로는 설사 증상을 나타내는 돼지에서 분리된 독소를 생산하는 균주를 사용하였고, 내성 수여자는 사람에서 분리된 p- lactamase를 생산하는 균주를 사용하였다. Norfloxacin에 감수성이면서 kanamycin에 내성인 두 균주(CCARM 1197, 1211)를 내성공여자로 하고, norfloxacin에 내성이면서 kanamycin에 감수 성인 0-lactamase를 생산하는 임상 분리 E. coli 한 균주 (CCARM 1334)를 내성 수여자로 사용하였다. 내성 공여자와 수여자를 각각 brain heart infusion (BHI, Difco) 액체배지에 접종 하여 하룻밤 진탕 배양하였다.
- 또한 clavulanic acid의 p-lactamase 억제 효과에 의한 억제대의 확장 현상이 5 mm 이상으로 관찰되면 ESBL 생산 양성으로 판정하였다. 결과의 정확성을 위하여 참조 균주 E. coli ATCC 25922를 동시에 시험하였다.
- Filter mating 방법에 따라 유전자 전달시험을 실시하였다. 내 성 공여자로는 설사 증상을 나타내는 돼지에서 분리된 독소를 생산하는 균주를 사용하였고, 내성 수여자는 사람에서 분리된 p- lactamase를 생산하는 균주를 사용하였다. Norfloxacin에 감수성이면서 kanamycin에 내성인 두 균주(CCARM 1197, 1211)를 내성공여자로 하고, norfloxacin에 내성이면서 kanamycin에 감수 성인 0-lactamase를 생산하는 임상 분리 E.
- p-Lactamase 유전자를 검출하기 위하여 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 사용된 프라이머 (primer)는 IEF 결과에 따라 AmpC에 특이적인 프라이 머 5'- CTACGGTCT GGCTGCTA-3와 5'TGGAGCAAGAGGCGGTA- 3를 사용하였다 (26). PCR 반응조건은 95℃에서 denaturation 10분, denaturation (95℃ 1분), annealing (56℃ 1분), extension (72 ℃ 1분)의 과정을 30회 반복한 후 마지막으로 extension을 72℃ 에서 10분간 시행하였다.
- 설사 증상을 나타내는 돼지의 분변에서 분리된 E. coli 56 균주를 혈액한천배지에 접종하여 용혈성을 확인한 결과, 총 38 균주(67.8%)가 용혈성을 나타내어 이들을 실험 대상으로 하였다.
- National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (25) 기준에 따라서 항생제 한천 희석법으로 항생제 최소억제농도(MIC)를 측정하였다. 시험 항생제로는 ampicillin, cephalothin, aztreonam, gentamicin, amikacin, neomycin, kanamycin, norfloxacin, tetracycline, chloramphenicol, trimethoprim을 사용 하였고, chloramphenicol (Acros, NJ, USA)을 제외한 모든 항생 제는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 순수 배양 된 집락을 멸균된 0.
- 용혈성을 확인하기 위하여 한천 혈액 배지(Trypticase Soy Agar with 5% sheep blood, BBL, USA)에 각각의 균주를 계대 배 양하였다. 37℃ 항온기에서 18시간 배양한 후, 용혈성 (hemolysis) 여부를 판독하였다.
- 2). 특히 내성 수여자로부터 내성 공여 자로의 역전달 현상을 배제하기 위하여, 내성 수여자는 플라스미드가 아닌 염색체에 의해 내성이 매개되어 쉽게 전달되지 않는 특징을 가진 퀴놀론계 항생제인 norfloxacin에 내성을 가진 균주를 선별하였다. 결과에서와 같이 TC1197에서는 동물에서 분리된 균주에서 생산되는 독소인 ST 유전자가 내성 수여자로 사용하였던 사람으로부터 분리된 균주로 전달되는 것을 확인할 수 있었다.
이론/모형
- Ampicillin과 cephalothin에 내성이면서 g-lactamase를 생산하는 균주의 ESBL 생산 여부를 확인하기 위해 NCCLS 지침에 따라 double disk synergy 시험법을 수행하였다. 순수 배양된 집락을 백금침으로 채취한 후, 0.
- Filter mating 방법에 따라 유전자 전달시험을 실시하였다. 내 성 공여자로는 설사 증상을 나타내는 돼지에서 분리된 독소를 생산하는 균주를 사용하였고, 내성 수여자는 사람에서 분리된 p- lactamase를 생산하는 균주를 사용하였다.
- National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (25) 기준에 따라서 항생제 한천 희석법으로 항생제 최소억제농도(MIC)를 측정하였다. 시험 항생제로는 ampicillin, cephalothin, aztreonam, gentamicin, amikacin, neomycin, kanamycin, norfloxacin, tetracycline, chloramphenicol, trimethoprim을 사용 하였고, chloramphenicol (Acros, NJ, USA)을 제외한 모든 항생 제는 Sigma (St.
- [3-Lactaniase를 생산하는 균주 중에서 ESBL을 생산하는 균주가 존재하는지 확인하기 위해 double disk synergy 시험법을 실시하였다. Disks는 cefotaxime, cefotaxime과 clavulanic acid, ceftazidime, ceftazidime과 clavulanic acid가 사용되었다.
- p-Lactamase 유전자를 검출하기 위하여 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 사용된 프라이머 (primer)는 IEF 결과에 따라 AmpC에 특이적인 프라이 머 5'- CTACGGTCT GGCTGCTA-3와 5'TGGAGCAAGAGGCGGTA- 3를 사용하였다 (26).
성능/효과
- 모든 균주는 aztreonam, amikacin, norfloxacin에 대해 감수성이었다 (Table 2). 4개 이상의 항생제에 대해 내성을 가지는 다제내성 (multiple drug resistance, MDR)을 보인 균주는 38 균주 증 21 균주(55.3%)인 것으로 나타났다. 또한 aminoglycosidee] 항생제 에 대해서는 17%가 gentamicin에 내성을 나타내었고, 각각 14%가 neomycin과 kanamyciri에 대충H 내성을 나타냈다.
- Disks는 cefotaxime, cefotaxime과 clavulanic acid, ceftazidime, ceftazidime과 clavulanic acid가 사용되었다. NCCLS 지침에 따라 결과를 확인하였을 때, 38 균주 중에서 ESBL를 생산하는 균주는 없는 것으로 확인되었다.
- cli에서 주로 분비되는 enterotoxins (ST와 LT과 verotoxins (VT와 VTe) 유전자의 존재 여부를 Table 1에 열거된 프라이머를 사용하여 확인한 결과는 Table 3에 정리되어 있다. ST가 가장 많은 34 균주(89.5%)에서 나타났고, 그 다음으로 VT와 VTe가 각각 18 균주(47.4%), 그리고 LT가 12 균주(31.6%)에서 나타났다. 이들 중에서 8 균주 (21.
- g-Lactamase의 발색 기질로 작용하는 nitrocefin을 각 균주의 파쇄액에 처리한 결과, 38 균주 중 34 (89.5%) 균주가 양성 반응을 나타내어 대부분의 용혈성 E. coli가 β -lactamase 생산하는 것으로 나타났다. 이들의 ampicillin에 대한 최소억제농도는 16~128 μg/ml이상 이었고, cephalothin에 대한 최소 억제 농도는 4~32 μg/ml로 다양했다.
- coli의 O 혈청형은 총 14 종류로 매우 다양하게 나타났 다(Table 5). 가장 많은 것으로 나타난 O 혈청형은 각각 2 균주가 0-27, 0-63, 0114 이었고, 0-18, 0-78, 0-115, 0-125, O- 126, 0-127, 0-148, 0-153, 0-157, 0-158, 0-167이 각각 1 균주 씩이었다. 이들은 돼지의 설사 증상을 유발하는 것으로 알려져 있는 E.
- coli는 매우 다양한 O와 H 혈청형을 가지고 있음이 확인되었다. 각각 14 종류의 O 그룹과 6종류의 H 그룹이 발견되었으나, 이들 중 우세한 혈청형은 확 인되지 않았다. 이들 O와 H를 생산하는 유전자는 독소를 생산하는 유전자와 달리 염색체 상에 존재하기 때문에 이 결과는 돼지의 설사 증상에 관련된 E.
- 특히 내성 수여자로부터 내성 공여 자로의 역전달 현상을 배제하기 위하여, 내성 수여자는 플라스미드가 아닌 염색체에 의해 내성이 매개되어 쉽게 전달되지 않는 특징을 가진 퀴놀론계 항생제인 norfloxacin에 내성을 가진 균주를 선별하였다. 결과에서와 같이 TC1197에서는 동물에서 분리된 균주에서 생산되는 독소인 ST 유전자가 내성 수여자로 사용하였던 사람으로부터 분리된 균주로 전달되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 TC1211의 경우는 ST 유전자의 전달이 일어나지 않은 것으로 확인되었다.
- 3%)인 것으로 나타났다. 또한 aminoglycosidee] 항생제 에 대해서는 17%가 gentamicin에 내성을 나타내었고, 각각 14%가 neomycin과 kanamyciri에 대충H 내성을 나타냈다.
- 또한 동물 분리 균주가 사람 세포에 직접 부착하여 유해성을 나타낼 수 있는지를 확인하기 위한 사람 유래 세포 부착 실험에서 16 균주(42.1%)가 T-24 방광 세포에 강한 부착능을 가진 것으로 나타났고, 17 균주(44.7%)가 Caco-2 장내 세포에 대해 강한 부착능을 가진 것으로 나타났으며, 특히 11 균주(28.9%)는 두 세포에 동시에 강한 부착능을 나타내었다.
- 2%) 순으로 나타났다. 모든 균주는 aztreonam, amikacin, norfloxacin에 대해 감수성이었다 (Table 2). 4개 이상의 항생제에 대해 내성을 가지는 다제내성 (multiple drug resistance, MDR)을 보인 균주는 38 균주 증 21 균주(55.
- coli가 매우 다양하다는(clonal diversity) 것을 보여주는 결과이다. 본 실험 결과에서 나타난 E. coli의 O-혈청형은 돼지의 설사 증상을 유발하는 것으로 알려져 있는 E. coli 중 ETEC (0-27, 0-78, 0-148), EIEC (0-167), EPEC (0-125, 0-126, 0-127), EHEC (0-157) 등 다양한 그룹에 해당되는 것으로 나타났다(24). 그러나 본 실험의 결과는 외국에서 사람의 질병에 관련된 것으로 보고되어 있는 혈청형인 0- 26, 0-91, 0-103, 0-111, 0-117, 0-118, 0-121, 0-128, 0-145, 0-146이나 돼지의 설사를 유발하는 것으로 보고 된 0-8, 0-9, 0-20, 0-101, 0-138, 0-141형은 없는 것으로 나타났다(3, 4, 13).
- 본 실험에서 38 균주의 용혈성 E. coli는 매우 다양한 O와 H 혈청형을 가지고 있음이 확인되었다. 각각 14 종류의 O 그룹과 6종류의 H 그룹이 발견되었으나, 이들 중 우세한 혈청형은 확 인되지 않았다.
- 이들 ETEC와 VTEC에 있어 중요한 병독성 요소(virulence factor)는 독소의 생산이다. 본 실험에서는 1997년과 1998년 사이에 국내에서 분리된 설사 증상을 나타내는 돼지의 분변으로부터 분리된 용혈성 E. coli 38 균주에 대해 ST, ET, VT, 그리고 VTe 를 생산하는 유전자를 PCR로 확인한 결과 ST가 가장 보편적인 것으로 나타났고, VT와 VTe, 그리고 LT의 순으로 나타났다. ST 가 가장 보편적인 것으로 나타난 결과는 Garabal 등(14)의 결과와 일치하는 것이다.
- 1%)가 분류되었고, 4 균 주에서는 H-, 18 균주에서는 H 타입이 결정되지 않았다(nontypable). 본 실험에서는 총 6종류의 H 혈청형이 확인되었는데, 4 균주가 H-4, 4 균주가 H-10, 3 균주가 각각 H-9와 H-40, 1 균주가 각각 H-19와 H-20이었다. H-7은 발견되지 않았고, O- 157을 나타내었던 한 균주는 H-19인 것으로 확인되었다.
- 본 실험의 대상 세균 38 균주 중 16 균주(42.1%)가 T-24 방 광 세포에 강한 부착능을 가졌으며, 17 균주(44.7%)는 Caco-2 장내 세포에 대해 강한 부착능을 가졌다(Table 7). 특히 11 균주 (28.
- coli의 치료에 주로 사용되는 broad-spectrum 항생제의 사용은 내성 균주의 증대를 야기시켜왔다(18). 본 연구 결과는 tetracycline (94.7%), ampicillin (71.0%), chloramphenicol (68.4%), trimethoprim (55.2%)에 대한 동물 분리 E. cM.의 내성 정도를 보여주고 있다.
- 본 연구 결과에서는 이 균주들 간의 독성과 세포 부착능력, 그리고 항생제 내성간의 상호 연관성이 발견되지는 않았다. 하지만 두 가지 세포 모두에 강한 부착능을 가진 CCARM 1184, 1185, 1187, 1222 등의 4 균주는 항생제 내성도 강한 다제내성을 나타낸 균주였고, CCARM 1190, 1192, 1220, 122 등의 4 균주는 다 제내성인 동시에 3개 이상의 toxin을 생산하는 균주들로 이런 균들이 인체에 감염 되면 항생제 내성을 가진 동시에 독성을 나타내어 심각한 문제를 야기할 것으로 예상되며, 또한 이런 균주들로부터 독성과 내성이 인체 정상 세균총과 병원균에 전이될 가능성도 충분히 예상된다.
- 설사 증상을 나타내는 돼지로부터 분리된 용혈성 E. coli 38 균주의 항생제 최소억제농도(MIC)를 측정한 결과 높은 내성율을 나타내는 항생제는 tetracycline (94.7%), ampicillin (71.0%), chloramphenicol (68.4%), trimethoprim (55.2%) 순으로 나타났다. 모든 균주는 aztreonam, amikacin, norfloxacin에 대해 감수성이었다 (Table 2).
- 이를 확인하기 위해 AmpC에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한 결과, p-lactamase 양성균주는 모두 AmpC-like type의 β-lactamase를 가지고 있었다. 이들 AmpC-like type의 0-lactamase는 모두 플라스미드에 존재하는 것으로 확인되었다 (Fig. 1).
- 각각 14 종류의 O 그룹과 6종류의 H 그룹이 발견되었으나, 이들 중 우세한 혈청형은 확 인되지 않았다. 이들 O와 H를 생산하는 유전자는 독소를 생산하는 유전자와 달리 염색체 상에 존재하기 때문에 이 결과는 돼지의 설사 증상에 관련된 E. coli가 매우 다양하다는(clonal diversity) 것을 보여주는 결과이다. 본 실험 결과에서 나타난 E.
- 6%)에서 나타났다. 이들 중에서 8 균주 (21.0%)는 ST만 생산하였던 반면에, 12 균주(31.6%)는 LT와 ST 를 동시에 생산하였고, 13 균주(34.2%)는 ST, VT, VTe를 동시에 생산하였으며, 5 균주(13.2%)는 VT와 VTe를 동시에 생산하는 것으로 나타났다. 그러나 네 가지 독소를 동시에 생산하는 균주는 없는 것으로 나타났다.
- 이와 동시에 항생제 내성, 특히 transcon- jugants의 선별에 사용하였던 norflaxacin과 kanamycin에 대한 내성은 TC1197과 TC1211에서 각각 128 |ig/ml 이상과 128 pg/ml 로 높아진 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 내성 공여자로부터 내성 수여자에게로 독소 유전자뿐만 아니라 항생제 내성에 관련된 유전자의 전이가 있었음을 확인할 수 있었다.
- 추정되었다. 이를 확인하기 위해 AmpC에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한 결과, p-lactamase 양성균주는 모두 AmpC-like type의 β-lactamase를 가지고 있었다. 이들 AmpC-like type의 0-lactamase는 모두 플라스미드에 존재하는 것으로 확인되었다 (Fig.
- coli에서 독소를 생산하는 유전자가 다른 균주로 전달될 경우 매우 심각한 문제가 발생될 것으로 예측된다. 이에 독소를 생산하는 유전자가 다른 균주로 전달되는지 여부를 확인한 결과 플라스미드를 매개로 하여 전달되는 것으로 나타났다. 특히 사람으로부터 분리된 [3-lactamase를 생산하는 임상 균주에 전달 여부를 실험한 결과 얻어진 transconjugant로부터 항생제 내성뿐만 아니라 독소를 생산하는 능력이 전달되는 것으로 나타나, 이는 동물뿐만 아니라 사람에게도 매우 심각한 문제를 야기할 것으로 추측되었다.
- 그러나 TC1211의 경우는 ST 유전자의 전달이 일어나지 않은 것으로 확인되었다. 이와 동시에 항생제 내성, 특히 transcon- jugants의 선별에 사용하였던 norflaxacin과 kanamycin에 대한 내성은 TC1197과 TC1211에서 각각 128 |ig/ml 이상과 128 pg/ml 로 높아진 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 내성 공여자로부터 내성 수여자에게로 독소 유전자뿐만 아니라 항생제 내성에 관련된 유전자의 전이가 있었음을 확인할 수 있었다.
- 3%)인 것으로 나타났다. 일반적으로 동물에 있어 질병 치료의 목적 외에 성장 촉진의 목적으로 사료에 항생제를 첨가하기 때문에 tetracycline이나 aminoglycoside계 항생제에 대한 내성이 높을 것으로 추측되었는데(2, 18), 본 결과에서 tetracycUne 외에도 aminoglycoside계 항생제인 gentamicin에 대해 내성을 나타낸 균주는 17% 이었고, neomycin과 kanamycin에 내성을 나타낸 균주는 각각 14%로 나타났다.
- 의 내성 정도를 보여주고 있다. 특히 4개 이상의 항생제에 대해 내성을 가지는 다제내성(multiple drug resistance, MDR)을 보인 균주는 38 균주 중 21 균주(55.3%)인 것으로 나타났다. 일반적으로 동물에 있어 질병 치료의 목적 외에 성장 촉진의 목적으로 사료에 항생제를 첨가하기 때문에 tetracycline이나 aminoglycoside계 항생제에 대한 내성이 높을 것으로 추측되었는데(2, 18), 본 결과에서 tetracycUne 외에도 aminoglycoside계 항생제인 gentamicin에 대해 내성을 나타낸 균주는 17% 이었고, neomycin과 kanamycin에 내성을 나타낸 균주는 각각 14%로 나타났다.
- 이에 독소를 생산하는 유전자가 다른 균주로 전달되는지 여부를 확인한 결과 플라스미드를 매개로 하여 전달되는 것으로 나타났다. 특히 사람으로부터 분리된 [3-lactamase를 생산하는 임상 균주에 전달 여부를 실험한 결과 얻어진 transconjugant로부터 항생제 내성뿐만 아니라 독소를 생산하는 능력이 전달되는 것으로 나타나, 이는 동물뿐만 아니라 사람에게도 매우 심각한 문제를 야기할 것으로 추측되었다.
- 본 연구 결과에서는 이 균주들 간의 독성과 세포 부착능력, 그리고 항생제 내성간의 상호 연관성이 발견되지는 않았다. 하지만 두 가지 세포 모두에 강한 부착능을 가진 CCARM 1184, 1185, 1187, 1222 등의 4 균주는 항생제 내성도 강한 다제내성을 나타낸 균주였고, CCARM 1190, 1192, 1220, 122 등의 4 균주는 다 제내성인 동시에 3개 이상의 toxin을 생산하는 균주들로 이런 균들이 인체에 감염 되면 항생제 내성을 가진 동시에 독성을 나타내어 심각한 문제를 야기할 것으로 예상되며, 또한 이런 균주들로부터 독성과 내성이 인체 정상 세균총과 병원균에 전이될 가능성도 충분히 예상된다. 따라서 이에 대한 돼지의 용혈성 E.
- 항혈청을 이용한 응집반응으로 혈청형을 분석한 결과, 단 17 균주(44.7%)에서만 혈청형이 분류되었고(serotyping), 나머지 균주에서는 타입이 결정되지 않았다(nontypable). 혈청형이 분류된 용 혈성 E.
후속연구
- coli의 혈청형이 외국에서 보고된 것과 차이가 있는 것으로, 이는 대부분의 병독성 특징들 (virulence traits)이 전이가 가능한 유전적 요소(transferable genetic elements)인 플라스미드나 트랜스포존에 의해 조절되기 때문에 기존에 알려진 보편적인 병원성 혈청형(pathogenic serotypes)을 가진 균주에서 기존과는 다른 희귀한 혈청형 (uncommon type)을 가진 균주로 바뀔 가능성이 있을 것으로 생각 된다(11). 아직까지 국내에서 설사 증상을 나타내는 돼지로부터 분리된 E. coli의 혈청형에 대한 병인론적 연구가 미비한 실정으로 이에 대해서는 더 많은 연구가 진행되어야 할 필요가 있는 것으로 생각된다.
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