[논문]한국인 대장암 환자에서 Midkine 유전자의 단일 염기 다형성에 관한 연구

최재구; 한상만; 남윤형; 박상범; 장원철

doi:10.5012/jkcs.2005.49.2.167

문제 정의

또한 RFLP 산물을 DNA 단편 크기에 기초한 DHPLC법을 이용하면 DNA 단편 이 클수록 컬럼 표면과의 상호작 용이 강해져 소수성(hydrophobicity)이 커지기 때문에 극성 용매를 흘려주면 작은 단편이 먼저 분리되고 큰 단편은 나중에 분리되어 RFLP 산물을 쉽 게 분리할 수 있다.q 본 연구에서는 대장암 환자 조직에서 PCR-RFLP한 후 전기영동법을 이용한 분리 방법과 DNA 단편 크 기 에 기초한 DHPLC 방법을 이용해 MK 유전자의 인 트론 3번의 62번째 염기의 G/T transversion을 검출하 여 돌연변이 검출법의 효율성을 평가하고자 한다. 또 한 MK 유전자의 분자 생물학적 접근을 통해 질병 유 전자 진단 및 치료에 관한 연구에 기초 자료를 제공 하고자 한다.
q 본 연구에서는 대장암 환자 조직에서 PCR-RFLP한 후 전기영동법을 이용한 분리 방법과 DNA 단편 크 기 에 기초한 DHPLC 방법을 이용해 MK 유전자의 인 트론 3번의 62번째 염기의 G/T transversion을 검출하 여 돌연변이 검출법의 효율성을 평가하고자 한다. 또 한 MK 유전자의 분자 생물학적 접근을 통해 질병 유 전자 진단 및 치료에 관한 연구에 기초 자료를 제공 하고자 한다.

제안 방법

'm 대장암에서 MK 유전자의 돌연변이를 검출하기 위 해 PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fiagment length polymorphism)을 한 후 전기영동법을 이용한 분석 방법과 RFLP를 한 후 염기 서열의 크기에 기초한 DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography) 분석법을 이용했다.
컬럼의 재현성과 완충용액 이동 상의 상태를 확인하기 위해 size standard(Trangenomic, USA)를 5 卩L씩 3번 주입하여 분석하였다. 이 후 RFLP 산물을 컬럼 오븐 온도 50。(：에서 이동상의 속도를 0.75 mL/min로 하여 5 卩L 주입 해 WAVEMAKERTM software(7aWe 2)에 의해 정해진 gradient 조건으로 분 석하였고 UV 검출기로 260 nm에서 검출하였다.
2 mL 반응 시험 관에 RFLP 반응 용액 10 卩L을 넣 고 제한효소 반응 온도인 37。(：에서 3시간, 제한효소 가 비활성 되는 온도인 65。(：에서 20분 동안 반응시 켜 PCR 산물을 절단하였다. 2%(w/v) 아가로스 겔을 이용하여 전기영동장치로 RFLP 산물을 분석하였다. RFLP 산물 10 皿와 6X BPB(bromophenol blue) 2 從를 혼합하여 11 叫씩 주입한 후 100 V에서 25분 동안 전 기영동하였다.
75개의 대장암과 75개의 정상 조직을 대상으로 genomic DNA를 추출하여 PCR을 이용해 분석 하고자 하는 부위의 DNA 단편을 증폭하고, PCR 산물을 일반 적으로 행하는 RF나를 한 후 겔 전기 영동으로 확인하 는 방법과 RFLP 후 염기 서열 크기에 기초한 DHPLC 방법으로 확인하는 새로운 방법으로 MK 성장 인자의 인트론 3번의 62번째 염기가 G에서 T로 치환되는 단 일 염기 다형성을 검출하였다. 그 결과 RFLP 후 겔 전 기영동법과 크기에 기초한 DHPLC로 검출한 방법 모 두 75개의 대장암 조직에서 21개(28%), 75개의 정상 조직에서 5개(6.
DHPLC는 WAVE® SYSTEM (Transgenomic, USA)를 사 용해 돌연변이를 검출하였다.
RFLP■而ze Based DHPLC 방법에 의한 단일 염기 다형성 검출 PCR 산물을 정제 과정을 거치지 않고 곧바로 RFLP 한 후 크기 에 기초한 DHPLC 방법으로 단일 염기 다 형성을 검출하였다. 컬럼의 재현성과 완충용액 이동 상의 상태를 확인하기 위해 size standard(Trangenomic, USA)를 5 卩L씩 3번 주입하여 분석하였다.
대장암 환자와 정상인 조직에서 Genomic DNA를 추출하여 PCR을 통해 원하는 부위를 증폭하고 RFLP 를 한 후 전기영동법과 크기에 기초한 DHPLC법에 의해 MK 유전자 인트론 3번의 62번째 염기에서 일 어나는 G/T transversion을 검출하였다.
우선 컬럼의 재현성과 이동상 완충용액의 상태를 확인하기 위해서 size standard를 5 卩L씩 3번 주입하 여 분석하였다. 그 후제한효소로처 리하지 않은 357bp PCR 산물을 5 卩L 주입하여 단일 피크로 나오는지 확 인하고, 75개의 대 장암 RFLP 산물을 5 卩L씩 주입하 여 분석한 결과 21개(28%)의 RFLP 산물에서 3개의 피크로 나타나는 G/T genotype과 54개(72%)의 RFLP 산물에서 2개의 피크로 나타나는 G/G genotype을 검 출하였다.
RFLP 산물 10 皿와 6X BPB(bromophenol blue) 2 從를 혼합하여 11 叫씩 주입한 후 100 V에서 25분 동안 전 기영동하였다. 이 후겔을분리하여 EtBrfEthidium Bromide) 로 15분간 염색하는 stain 과정과 DNA와 결합하지 못 한 EtBr을 증류수로 제 거 하는 destain 과정을 거쳐 UV transilluminator로 RFLP 여부를 확인하였다.
RFLP■而ze Based DHPLC 방법에 의한 단일 염기 다형성 검출 PCR 산물을 정제 과정을 거치지 않고 곧바로 RFLP 한 후 크기 에 기초한 DHPLC 방법으로 단일 염기 다 형성을 검출하였다. 컬럼의 재현성과 완충용액 이동 상의 상태를 확인하기 위해 size standard(Trangenomic, USA)를 5 卩L씩 3번 주입하여 분석하였다. 이 후 RFLP 산물을 컬럼 오븐 온도 50。(：에서 이동상의 속도를 0.

대상 데이터

전 기영동의 agarose는 QA-Agarose™(Q-bio gene, USA) 을 이용하였다. DHPLC의 이동상으로 triethylammonium acetate(TEAA)(Transgenomic, USA)와 acetonitrile(ACN) (Merck, USA)을 사용하였다.
RFLP-겔 전기영동법에 의한 단일 염기 다형성 검출 RFLP 할 때 제한효소는 Bmel8 I을 이용하였고 제 한 부위는 5, gAgacc 3'이며 반응은 MyGene 32 thermal block(Bioneer, Korea)에서 이루어졌다.
polymerase(GeNet Bio, Korea)을' 사'용하였다.
본 연구에서는 단국대학교 병원에서 대장암으로 진 단 받고 수술 받은 환자의 조직 75개와 정상 조직 75 개를 대상으로 하였다.

이론/모형

DNA의 증폭은 GeneAmp® PCR System 2700(Applied Biosystems, USA)을 사용하였고, PCR 증폭물 확인은 Mupid-a(Advance, Japan) 전기영동장치를 이용하였다.

성능/효과

2005, Vol. 49, No. 2 본 연구를 통하여 RFLP 산물을 겔 전기 영 동법으로 확인하는 일반적인 방법보다 크기에 기초한 DHPLC 법으로 확인하는 새로운 방법 이 정제 과정을 거치지 않으므로 시간과 노동력이 절약되며 전 분석 과정이 자동화되어 있기 때문에 실험자의 숙련도에 관계없 이 결과의 재 현성 이 우수하다는 장점을 가지고 있다.
RFLP를 한 후 아가로스 겔 전기 영동법으로 확인한 결과 75개의 대장암조직 중21개(28%)의 G/Ttransversion 을 검출하였으며, 75개의 정상 조직 중 5개(6.7%)의 G/T transversion을 검출하였다(Eg. 1). Fig.
3%)의 G/G genotype을 검 출하였다. 결과의 정 확성을 판단하기 위해 size standard 피크와 RFLP산물을 분석한 피크를 합쳐본 결과 RFLP 산물을 분석한 피크가 정확한 위치에서 나타남을 확 인할 수 있었다(尸该. 2). 또한 이와 같은 결과는 RFLP겔 전기영동법으로 분석한 결과와 동일함을 보였다.
75개의 대장암과 75개의 정상 조직을 대상으로 genomic DNA를 추출하여 PCR을 이용해 분석 하고자 하는 부위의 DNA 단편을 증폭하고, PCR 산물을 일반 적으로 행하는 RF나를 한 후 겔 전기 영동으로 확인하 는 방법과 RFLP 후 염기 서열 크기에 기초한 DHPLC 방법으로 확인하는 새로운 방법으로 MK 성장 인자의 인트론 3번의 62번째 염기가 G에서 T로 치환되는 단 일 염기 다형성을 검출하였다. 그 결과 RFLP 후 겔 전 기영동법과 크기에 기초한 DHPLC로 검출한 방법 모 두 75개의 대장암 조직에서 21개(28%), 75개의 정상 조직에서 5개(6.7%)의 단일 염기 다형성을검출하였다. 2005, Vol.
우선 컬럼의 재현성과 이동상 완충용액의 상태를 확인하기 위해서 size standard를 5 卩L씩 3번 주입하 여 분석하였다. 그 후제한효소로처 리하지 않은 357bp PCR 산물을 5 卩L 주입하여 단일 피크로 나오는지 확 인하고, 75개의 대 장암 RFLP 산물을 5 卩L씩 주입하 여 분석한 결과 21개(28%)의 RFLP 산물에서 3개의 피크로 나타나는 G/T genotype과 54개(72%)의 RFLP 산물에서 2개의 피크로 나타나는 G/G genotype을 검 출하였다. 또한 75개의 정 상 RFLP산물에 서 5개 (6.

후속연구

MK 성장 인자의 단일 염기 다형성은 대장암뿐만 아니라 여러 종류의 인체암에서 발생하기 때문에 환 자의 예후 관찰에 있어서 보다 빠르고 정확한 단일 염기 다형성 검출 도구로 DHPLC 분석 방법 이 상당 히 유용할 것으로 생각되며 향후 primer extension과 같은 새로운 단일 염기 다형성 검출 방법에 DHPLC 를 도입하여 겔 상에서 판단하기 힘든 하나의 염기 크기 차이도 빠르고 정확하게 검출할 수 있는 방법을 모색해야 할 것이다.

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