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문제 정의
- 그외 생리활성 연구로는 항염증, 진경작용, 혈당강하작용, 혈청 콜레스테롤치 저하작용, 혈압 강하작용, 항산화작용 및 HIV protease 저해 활성 등이 보고되고 있다. 본 연구에서는 알코올과 NSAID 로 위염을 유발한 동물 모델을 만든 후 이 실험동물에 대한 해당근의 위염에 대한 free radical scavenging 기구와 관련됨 효소의 활성에 미치는 영향을 검색하였다.
- 이에 본 실험에서는 항산화효과가 있는 것으로 알려진 해 당근을 대상으로 위염의 실험동물 모델을 사용하여 항궤양효과 및 위액분비량을 조사하였던바 메탄올 및 부탄올 분획에서 항궤양효과가 뚜렷한 것을 확인하고서 위 조직에서의 활성산소 소거능에 어떠한 영향을 주는가를 관찰하였다. 활성산소는 생체 내외인성 요인에 의한 친전자성 물질로 생체 내에서 독작용, 노화, 발암 및 면역 억제작용을 유발하는 원인 물질로 병태 생리학적 현상이나 조직의 손상 정도를 나타내는 지표로서 세포막의 투과성을 항진시킬 뿐만 아니라 전반적인 세포독성을 초래하여 세포기능을 저하시키며 세포괴사나 노화현상에 관여하여 이에 따른 여러 가지 질환의 병리현상을 유발하는 물질이다.
제안 방법
- Glutathione의 함량측정-위장조직 중 Glutathione(GSH) 의 함량측정은 Griffith의 방법⑸에 준하여 조직마쇄액 일정량에 4% sulfosalicylic acid를 가하여 제단백한 후 얻은 상징 액 일정 량에 5, 5'-dithiobis 2-nitro benzoic acid, 3 mM NADPH, 50 units glutathione reductase를 함유한 0.1 mM sodium phosphate buifer(pH7.5) 일정량을 넣고 반응시켜 생성된 p-nitrothiophenol의 흡광도를 파장 412nm에서 측정하여 농도를 산정하였다. GSH 함량은 조직 1 g당 함유되어있는 GSH의 양을 |imole로 나타내었다.
- 기초위액 분비에 대한 실험 - 체중 약 220 g의 웅성 흰쥐를 24시간 절식시킨 뒤 ether 마취하에 유문결찰하고 위액 분비량을 Dai의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉 흰쥐를 ether 마취하에 개복하고 유문부를 결찰한 즉시 검 체를 십이지장 내로 주입하고 봉합한 후 4시간 후에 ether로 치사 시켜 위를 적출하고 저류된 위액을 채취하였다.
- 동물 모델의 제작 - 위장장애군은 ethyl alcohol 4mkg 과 sodium salicylate 200mg/kg을 매일 동일한 시간에 1일 1회 14일간 강제 경구 투여하여 위장장애를 유발한 후 7일간 생리식염수를 동일 조건으로 공급하며 자연치유로 인한 실험 오차를 배제하였으며 , 해당근 각분획을 용시조제하여 100, 200mg/kg 되게 하여 1일 1회 경구투여 하였다. 정상 동물은 21일간 생리식염수를 투여하였다.
- 4)를 가하여 빙 냉 상태 에서 glass teflon homogenizer로 마쇄하였다. 이 마쇄 균질액을 600xg 에서 10분간 원심분리하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 다음 10, 000,]서 20분간 원심분리흐}여 mitocondrial fraction 을 얻고 SOD 활성 측정 시료로 하였으며 이것을 15, OOOXg 에서 1시간 동안 초원심분리하여 상징액을 얻은 후 GPx, 의 활성 측정원으로 사용하였다. 상기의 모든 조작은 0-4℃ 에서 실시하였다.
- 해 당근 2 kg을 세절하여 5시간씩 환류하에 3회 추출하였고 진공 농축기로 농축하였으며 이를 동결건조하여 메탄올 추출물 98 얻었다. 이 중 메탄올 추출물 98 이용하여 증류수에 현탁시키고 클로로포름으로 5회 분획하였고, 잔류의 수층에 대하여 다시 에틸아세테이트로 5회 분힉하였으며, 계속적으로 수층에 대하여 부탄올로 5회 분획하였다. 각 유기층 분획을 농축하여 클로로포름 분획 30 g, 에틸아세테이트 분획 26 g 및 부탄올 분획 29 g을 얻었다.
- 치사시킨 후 위를 적출하였다. 적출한 위를 2% formalin 수용액으로 10분간 침적하여 위를 가볍게 고정한 다음 대만 부를 절개하여 선위부에 발생한 손상의 길이 (mm)를 측정하여 손상지수로 하였다.
- 정상 동물은 21일간 생리식염수를 투여하였다.
- Dai의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉 흰쥐를 ether 마취하에 개복하고 유문부를 결찰한 즉시 검 체를 십이지장 내로 주입하고 봉합한 후 4시간 후에 ether로 치사 시켜 위를 적출하고 저류된 위액을 채취하였다. 채취한 위액은 3000rpm에서 10분간 원심분리한 후 위액량(mZ), pH, 산도(jXgeq/mZ) 및 총산분비량 (|Xgeq/m4 h)를 측정하였다.
- 지질과산화 함량에 미치는 영향 - Alcohol-salicylate로 위궤양을 유도한 실험동물에 해당근 분획을 투여하고서 위장조직의 지질과산화 함량은 측정한 결과가 Fig. 1이다. 정상군에 비하여 위궤양을 유도한 군에서 약 2.
- 즉 흰쥐를 ether 마취하에 개복하고 유문부를 결찰한 즉시 검 체를 십이지장 내로 주입하고 봉합한 후 4시간 후에 ether로 치사 시켜 위를 적출하고 저류된 위액을 채취하였다. 채취한 위액은 3000rpm에서 10분간 원심분리한 후 위액량(mZ), pH, 산도(jXgeq/mZ) 및 총산분비량 (|Xgeq/m4 h)를 측정하였다. 산도 및 종산분비 량은 phenolphthalein 지 시 약을 사용하여 0.
- 해 당근 2 kg을 세절하여 5시간씩 환류하에 3회 추출하였고 진공 농축기로 농축하였으며 이를 동결건조하여 메탄올 추출물 98 얻었다. 이 중 메탄올 추출물 98 이용하여 증류수에 현탁시키고 클로로포름으로 5회 분획하였고, 잔류의 수층에 대하여 다시 에틸아세테이트로 5회 분힉하였으며, 계속적으로 수층에 대하여 부탄올로 5회 분획하였다.
- 효소원의 제조 - 실험동물을 마취 개복한 후 위를 적출, 절개하여 내용물을 제거하고 빙냉 생리 식염수로 세척, 여지로 압박, 이물질을 제거한 후 냉소의 빙판 위에서 가위로세절하고 조직 1 g당 4배량의 0.1 M KP buffer (potassium phosphate buffer pH 7.4)를 가하여 빙 냉 상태 에서 glass teflon homogenizer로 마쇄하였다. 이 마쇄 균질액을 600xg 에서 10분간 원심분리하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 다음 10, 000,]서 20분간 원심분리흐}여 mitocondrial fraction 을 얻고 SOD 활성 측정 시료로 하였으며 이것을 15, OOOXg 에서 1시간 동안 초원심분리하여 상징액을 얻은 후 GPx, 의 활성 측정원으로 사용하였다.
대상 데이터
- 시약 및 기기 - Bovine serum albumin, NADPH, GSH (reduced & oxydized form of glutathione), SDS(sodium dodecyl sulfate), sodium salicylate, TCA (trichloro acetic acid), EDTA, DTNB(5, 5'-dithiobis-2-nitro benzoic acid), sulfosalicylic acid, GR(glutathione reductase), triethano lamine, cytochrome C, KH2PO4, K2HPO4, absolute ethanol등은 Sigma 사로부터 구입했으며 해당근의 추출물은 상지대학교 식물자원학과 박희준 교수에서 제공받았다. 실험에 사용한 기 기로는 UV spectrophotometer (Shimadzhu UV- 120), refrigerated centrifuge(Hanil supro 22K), ultracentri- fiige(Hitachi 70P-72) 둥을 사용하였다.
- 식물재료 및 추출 - 강원도 원주시 소재 천일약업사(대표 : 황인구)에서 구입한 해당화 뿌리를 상지대학교 자원 식물학과 임상철 교수에게서 감정을 받아 실험에 사용하였다. 해 당근 2 kg을 세절하여 5시간씩 환류하에 3회 추출하였고 진공 농축기로 농축하였으며 이를 동결건조하여 메탄올 추출물 98 얻었다.
- 실험동물 - 대한 BioLin에서 분양받은 체중 150 - 250 g 의 Sprague-Dawley계 웅성 흰쥐를 22±2℃에서 2주간 이상 사육하여 적응시킨 뒤 실험에 사용하였으며, 동물실 내의 명암은 12시간씩으로 자동조절시켰고, 고형사료 및 물은 충분히 공급하였다.
- 식물자원학과 박희준 교수에서 제공받았다. 실험에 사용한 기 기로는 UV spectrophotometer (Shimadzhu UV- 120), refrigerated centrifuge(Hanil supro 22K), ultracentri- fiige(Hitachi 70P-72) 둥을 사용하였다.
- 각 유기층 분획을 농축하여 클로로포름 분획 30 g, 에틸아세테이트 분획 26 g 및 부탄올 분획 29 g을 얻었다. 이 중 메탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획과 부탄올 분획을 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 결과는 평균치±표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 이용하였다.
이론/모형
- Glutathione peroxidase(GPx)의 활성측정- Glutathione peroxidase의 활성측정은 Paglia 등의 방법 쎄 준하여 일정량의 0.1 M Tris-HCl buffer(pH7.2) 용액에 기질인 H2O2, 1 mM GSH, 0.2 mM NADPH 및 효소원을 첨가하여, 5분간 반응시키는 동안에 생성되는 산화형 Glutathione(GSSG) 를 환원시키는데 소비된 NADPH의 함량을 340nm에서 측정하여 그 활성을 산정하였다. 효소의 활성은 1분당 1mg의단백질이 산화시킨 NADPH 양을 nmole로 나타내었다.
- Superoxide dismutase(SOD)의 활성 측정 Superoxide dismutase 활성 측정은 Martin의 방법 에 준하여 실시하였다. 효소원 제조 방법에 따라 분리된 cytosolic fraction에 EtOH-CHCl3(5:3) 혼액 0.
- 단백질정량 및 통게처리 - 단백질의 정량은 Lowry 등의 방법6에 준하여 bovine serum albumin을 표준품으로 하 여행하였다. 본 실험에서 얻어진 결과는 평균치±표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 이용하였다.
- 위장손상 정도의 측정 - 흰쥐를 24시간 절식시킨 뒤 Mizu 등H)방법에 따라 실험 마지막날 실험동물을 이산화탄소 개스로 치사시킨 후 위를 적출하였다. 적출한 위를 2% formalin 수용액으로 10분간 침적하여 위를 가볍게 고정한 다음 대만 부를 절개하여 선위부에 발생한 손상의 길이 (mm)를 측정하여 손상지수로 하였다.
성능/효과
- Alcohol-salicylate 위손상에 대한 효과 - 해당근 각 분획(메탄올 추출물 부탄올 분획물, 에틸아세테이트 분획물)의 alcohol-salicylate 위손상에 대한 항위염작용을 관찰한 결과로 정상군의 위손상지수가 74.5이던 것이 해당근의 메탄올 및 부탄올 분획의 투여로 유의성 있는 위손상의 억제 효과가 dose dependent하게 나타났으며 에틸아세테이트 분획의 투여에서는 다소 감소하는 경향은 있었으나 통계적으로 유의성이 없었다(Table I).
- 있다. Alcohol-salicylate로 위장장애를 유발한 동물모델에서 위장장애를 유발한 후 해당근 추출물을 투여하여 치료효과를 측정한 결과 위장장애군에서 낮아진 GSH 함량이 해당근 분획물(메탄올 추출물, 부탄올 분획물)의 투여군에서 유의성 있게 증가되었다(Table HI).
- Alcohol-salicylate로 유도한 위궤양 실험동물에 해당근 각 분획을 투여하고서 항궤양효과를 관찰 하였던 바, 해당근 메탄올 및 부탄올 분획의 투여로 위궤양지수가 대조군에 비하여 현저히 억제되었으며 위액분비량 및 총산도도 유의성 있게 감소되었다. 위궤양의 형성으로 위장의 지질과 산화의 함량이 현저히 증가되던 것이 해당근의 투여로 감소되었으며 이는 위장의 superoxide dismutase 및 glutathione peroxidase의 활성이 alcohol-salicylate의 투여로 현저히 증가 되던 것이 해당근의 분획중 메탄올 및 부탄올 분획의 투여로 현저히 감소되었다.
- 감소되었다. 위궤양의 형성으로 위장의 지질과 산화의 함량이 현저히 증가되던 것이 해당근의 투여로 감소되었으며 이는 위장의 superoxide dismutase 및 glutathione peroxidase의 활성이 alcohol-salicylate의 투여로 현저히 증가 되던 것이 해당근의 분획중 메탄올 및 부탄올 분획의 투여로 현저히 감소되었다. 한편 해당근 에칠아세테이트 분획의 투여에서는 대조군과 별다른 영향이 없었다.
- 2이다. 위장장애 유발군에서는 정상군에 비해 약 73%의 활성감소를 나타내었으나 해당근 메탄올 및 부탄올 추출물 200mg/kg을 1주간 투여함으로써 통계적으로 유의성있게 증가하였으며 에틸아세테이트 분획의 투여에서는 유와성을 관찰할 수 없었다. 이 결과로 미루어 볼 때 위장장애 유발동물에 대한 해 당근의 치료효과는 항산화효소인 SOD 활성을 회복시킴으로써 위 손상으로 감소된 위장점막의 방어기능을 회복 시켜 위장장애를 치료하는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 위장장애 유발군에서는 정상군에 비해 약 73%의 활성감소를 나타내었으나 해당근 메탄올 및 부탄올 추출물 200mg/kg을 1주간 투여함으로써 통계적으로 유의성있게 증가하였으며 에틸아세테이트 분획의 투여에서는 유와성을 관찰할 수 없었다. 이 결과로 미루어 볼 때 위장장애 유발동물에 대한 해 당근의 치료효과는 항산화효소인 SOD 활성을 회복시킴으로써 위 손상으로 감소된 위장점막의 방어기능을 회복 시켜 위장장애를 치료하는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 3). 이러한 결과는 에칠아세테이트 분획의 투여에서는 별다른 영향이 없었으나 부탄올 분획의 투여에서 유의성 있게 증가됨을 관찰할 수 있었다.
- 1이다. 정상군에 비하여 위궤양을 유도한 군에서 약 2.5배정도 지질 과산화의 함량이 증가하던 것이 해당근 메탄올 및 부탄올의 투여로 용량의존적으로 현저히 감소되었으며 에칠아세테이트 분획의 투여에서는 200mg/kg의 투여에서 감소하는 경향을 보였다.
- 한종류이다. 정상대조군에 비해 alcohol-salicylate 로 위장장애를 유발한 동물모델에서는 GPx의 활성이 낮아졌으며 해당근 분획의 투여로 증가하는 경향을 나타내었다 (Fig. 3). 이러한 결과는 에칠아세테이트 분획의 투여에서는 별다른 영향이 없었으나 부탄올 분획의 투여에서 유의성 있게 증가됨을 관찰할 수 있었다.
- 또 catalase는 체내에서 지방의 자동 산화 및 유기물의 산화로 생기는 분해하여 무독화시키는 radical scavenging enzyme이며, glutathione peroxidase 역시 catalase와 같은 기능을 수행하는 효소로 glutathione을 기질로 하여 유리기를 물로 변환시켜 생성된 활성산소를 체외로 배설시킨다. 한편, 민간 의약 혹은 대체의학으로도 불리는 분야에서는 소화기계 질환 치료제로 고미 건위약, 방향성 건위제등 이외에 다른 약제를 찾고자 하는 일환으로 해당근을 계통분리한 분획을 대상으로 alcohol -salicylate를 사용, 위장장애 동물모델을 만들고 free radical scavenging enzyme을 중심으로 활성변화를 관찰한 결과, 해 당근의 메탄올 및 부탄올 분획이 위장 손상을 방지하고, 대표적인 free radical scavenging enzyme인 SOD의 활성을 높이며, 해독 작용을 나타내는 생체의 방어기전인 GSH의 함량을 높이는 것은 물론 GSH 의존성 항산화 효소들인 GPx 의 활성을 유의성있게 회복시킴으로써 위점막의 방어기전에 기여하는 것으로 나타났다. Free radical은 인체 내에서 일상적으로 만들어지며 대부분 질병상태에서 free radical 생성속도가 증가된다.
- 영향을 실험한 결과는 Table II이다. 해당근 각 분획을 십이지장에 투여시 위액 분비량이 대조군에 비하여 현저히 메탄올 추출물, 부탄올 분획물 및 에칠아세테이트 분획물의 순으로 현저히 억제되었으며, pH의 경우에는 유의성 있는 결과를 관찰할 수 없었다. 산도 및 총산배출량의 경우 대조군에 비하여 위액분비랑과 유사하게 억제됨을 관찰할 수 있었다.
후속연구
- Free radical에 의한 조직손상 기작은 상당히 밝혀져 있어서 항산화제의 치료목적 시용에 대한 근거를 제공하고 있다. 이에 항산화제 영양물질은 인체의 free radical 포집에 매우 중요하며 계속하여 해당근의 효과에 대한 연구 및 활성성분의 검색은 향후 있어야 하리라 본다.
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