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문제 정의
- 1,2) 한편, 저자 등은 A549 (인체유래 비소세포폐암주) 등 5종의 인체유래 암세포주를 대상으로 하여 시험관 내 (in Vitro) 세포증식저해효과를 지표로 하여 300 여종의 생약재 추출물들의 항암효능을 검색하여 본 결과 육두구(Myristicae Semen)의 MeOH 추출물이 농도 의존적으로 비교적 양호한 항암효과를 보여주고 있음을 알 수 있었다. 이에 저자등은 육두구의 methanol 추출물을 상법에 따라 용매분획을 실시하고 얻은 각 분획물에 대한 세포독성을 측정한 후, 유의성 있는 활성 을 나타낸 ethylacetate분획을 각종 chromatography를 통하여 정제한 결과 최종적으로 6종의 활성성분을 분리하였으며 본보에서는 이들 항암활성성분의 이화학적 성상 및 기기분석 자료를 통한 화학구조의 규명 및 각 화합물들의 인체 유래 암세포주에 대한 시험관 내 (in vitro) 세포증식저해효과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 사용하였다. 선광도는 JASCO DIP-4 digital polarimeter를 사용하였고, low resolution MS (70 eV)는 JEOL사의 JMS- DX 303 mass spectrometer를 사용하였으며, column packing 용 silica gel은 Kiesel gel 60 (Merck)를 사용하였고, TLC plate는 Kiesel gel 60F254 (Merck)을 사용하였다. 발색 시 약은 10% H2SO4을 사용하였으며 UV는 254 nm, 365 nm에서 확인하였다.
- 발색 시 약은 10% H2SO4을 사용하였으며 UV는 254 nm, 365 nm에서 확인하였다. 세포독성 실험은 sulforhodamin B(SRB) bioassay 방법을 응용하여 수행하였다.3) 실험에 사용한 암세포주들은 A549 (non small cell lung carcinoma), SK-OV-3 (ademon- carcinoma, ovary malignant ascites), SK-MEL-2 (malignant melanoma, metastasis to skin of thigh), XF-498 (central nerve system tumor) 및 HCT-15 (colon adenocarcinoma)이며 모두 human origin tumor cell line들로써, 미국 국립암연구소(NCI)로부터 분양받아 한국화학연구원에서 계대배양 중인 것을 사용하였다.
- 대하여 농도 의존적으로 양호한 세포증식 저해효과를 나티내었다. 육두구(肉苣蔻, Myristicae Semen)의 MeOH 추출물을 활성유도 분획법 (Bioactivity-directed fractionation)에 따라 chromatography로 정제한 결과 safrole (1) 및 5종의 lignan 화합물을 활성성분으로 분리 정제하였다. 분리된 화합물들은 각각 물리화학적 성상과 기기 분석 (1H-NMR, 13C-NMR) 소견을 종합한 결과, machilin A (2), licarin B (3), macelignan (4), meso-dihydroguaiaretic acid (5), myristargenol A (6)로 확인 동정되었다.
- 화합물의 분리 - EA 분획 128 g을 silica gel column chromatography (n-hexane : EA = 20:l, 10:1, 5:1, 1:1)를 실시하여 9개의 분획 (Ml~M9)으로 나누었으며, 이중 M2 (4g)분획을 silica gel column chromatography (n-hexane :EA)를 반복하여 미황색 유상물질 1.23g (화합물 1)을 얻었다. 한편 M4 (36 g)분획은 silica gel column chromatography (n-hexane:EA = 20:l, 10:1, 5:1, 1:1)를 통하여 재차 4개의 소분획 (M41 ~M44)으로 나누었다.
대상 데이터
- 세포독성 실험은 sulforhodamin B(SRB) bioassay 방법을 응용하여 수행하였다.3) 실험에 사용한 암세포주들은 A549 (non small cell lung carcinoma), SK-OV-3 (ademon- carcinoma, ovary malignant ascites), SK-MEL-2 (malignant melanoma, metastasis to skin of thigh), XF-498 (central nerve system tumor) 및 HCT-15 (colon adenocarcinoma)이며 모두 human origin tumor cell line들로써, 미국 국립암연구소(NCI)로부터 분양받아 한국화학연구원에서 계대배양 중인 것을 사용하였다.
- 기기 및 시약 - NMR은 Bracked AM-300과 AMX 500 을 사용하였다. 선광도는 JASCO DIP-4 digital polarimeter를 사용하였고, low resolution MS (70 eV)는 JEOL사의 JMS- DX 303 mass spectrometer를 사용하였으며, column packing 용 silica gel은 Kiesel gel 60 (Merck)를 사용하였고, TLC plate는 Kiesel gel 60F254 (Merck)을 사용하였다.
- 선광도는 JASCO DIP-4 digital polarimeter를 사용하였고, low resolution MS (70 eV)는 JEOL사의 JMS- DX 303 mass spectrometer를 사용하였으며, column packing 용 silica gel은 Kiesel gel 60 (Merck)를 사용하였고, TLC plate는 Kiesel gel 60F254 (Merck)을 사용하였다. 발색 시 약은 10% H2SO4을 사용하였으며 UV는 254 nm, 365 nm에서 확인하였다. 세포독성 실험은 sulforhodamin B(SRB) bioassay 방법을 응용하여 수행하였다.
- 실험재료 - 본 실험에 사용된 생약재 육두구 (Myrsticae Semen)는 2003년 10월에 시중 건재상에서 구입하여 국민대학교 김영균 교수의 감정 후 실험에 사용하였으며 표품은 한국화학연구원 (표본번호 KR0197-2003)에 보관되어 있다.
성능/효과
- 한방에서는 주로 위경, 대장경에 작용한다고 알려져 있으며 미량에서는 입맛을 돋우고 건위작용을 나타내며 비위가 허하여 설사할 때, 소화가 안되며 헛배가 부르고 아플 때, 토할 때 등에 쓰인다.1,2) 한편, 저자 등은 A549 (인체유래 비소세포폐암주) 등 5종의 인체유래 암세포주를 대상으로 하여 시험관 내 (in Vitro) 세포증식저해효과를 지표로 하여 300 여종의 생약재 추출물들의 항암효능을 검색하여 본 결과 육두구(Myristicae Semen)의 MeOH 추출물이 농도 의존적으로 비교적 양호한 항암효과를 보여주고 있음을 알 수 있었다. 이에 저자등은 육두구의 methanol 추출물을 상법에 따라 용매분획을 실시하고 얻은 각 분획물에 대한 세포독성을 측정한 후, 유의성 있는 활성 을 나타낸 ethylacetate분획을 각종 chromatography를 통하여 정제한 결과 최종적으로 6종의 활성성분을 분리하였으며 본보에서는 이들 항암활성성분의 이화학적 성상 및 기기분석 자료를 통한 화학구조의 규명 및 각 화합물들의 인체 유래 암세포주에 대한 시험관 내 (in vitro) 세포증식저해효과를 보고하고자 한다.
- 13C-NMR spectrum에서 모두 10개의 carbon signal만이 나타나고 있어 화합물 5 역시 화합물 2와 마찬가지로 분자내 대칭구조를 가진 meso 화합물로 추정할 수 있었으며 1H-NMR 과 13C-NMR data를 문헌11,12)값과 비교하여 본 결과 mesodihydroguaiaretic acid와 일치함을 알 수 있었다.
- 86에서 관찰되었다. 13C-NMR spectrum에서는 총 20개의 carbon signal이 관찰되었으며 각각의 signal을 문헌6,7,8)치와 비교하여 본 결과 화합물 3은 licarin B로 동정할 수 있었다.
- 4) 화합물 2는 미황색 oiP상 물질로서 EI-MS (M+, 326), 1H-NMR과 13C-NMR data를 통해 이 화합물의 분자식은 추정할 수 있었다. 한편 13C-NMR spectrum 에서는 모두 10개의 carbon signal만이 나타나고 있어 화합물 2는 분자내 대칭구조를 가진 meso 화합물로 추정할 수 있었으며 1H-NMR과 13C-NMR data를 문헌5)과 비교분석한 결과 machilin A [(2RS, 3SR)-2,3-dimethyl-l,4-dipiperonyl- butarme]로 동정되었다.
- 육두구(肉苣蔻, Myristicae Semen)의 MeOH 추출물을 활성유도 분획법 (Bioactivity-directed fractionation)에 따라 chromatography로 정제한 결과 safrole (1) 및 5종의 lignan 화합물을 활성성분으로 분리 정제하였다. 분리된 화합물들은 각각 물리화학적 성상과 기기 분석 (1H-NMR, 13C-NMR) 소견을 종합한 결과, machilin A (2), licarin B (3), macelignan (4), meso-dihydroguaiaretic acid (5), myristargenol A (6)로 확인 동정되었다. 한편 분리된 화합물 (L6) 들을 각각 A549 (비소세포폐암주), SK-OV-3 (난소암주), SK-MEL-2 피부종양주), XF-498 (중추신경계종양 주) 및 HCT-15 (직장종양주) 등 5종의 human tumor cells에 대한 시험관내 세포증식저해 효과를 검색하여 본 결과대조 약제로 사용한 doxorubicin 에 버금가는 양호한 효과를 나타내었다.
- 04)가 새롭게 나타난 점을 제외하고는 전체적으로 유사한 pattern을 나타내고 있으므로 7번 혹은 7번 위치의 carbon에 hydroxy기가 치환되어 있음을 추측할 수 있었다. 한편 COSY, HMBC, HMQC 등 spectral data를 종합하여 본 결과 hydroxy peak (δ 4.04)와 결합하고 있는 carbon (δ 77.4)은 H-6, H-7, H-8 및 H-9와 각각 correlation을 보여주어 hydroxy기가 7번 위치에 치환되어 있음을 확인할 수 있었으며 spectral data를 문헌치와 정밀 비교분석하여 본 결과 화합물 6은 myristargenol A로 최종 확인할 수 있었다.13)
- 분리된 화합물들은 각각 물리화학적 성상과 기기 분석 (1H-NMR, 13C-NMR) 소견을 종합한 결과, machilin A (2), licarin B (3), macelignan (4), meso-dihydroguaiaretic acid (5), myristargenol A (6)로 확인 동정되었다. 한편 분리된 화합물 (L6) 들을 각각 A549 (비소세포폐암주), SK-OV-3 (난소암주), SK-MEL-2 피부종양주), XF-498 (중추신경계종양 주) 및 HCT-15 (직장종양주) 등 5종의 human tumor cells에 대한 시험관내 세포증식저해 효과를 검색하여 본 결과대조 약제로 사용한 doxorubicin 에 버금가는 양호한 효과를 나타내었다..
- 한편, 분리 정제된 각 화합물(1-6)를 각각 SRB 방법으로 A549 (비소세포폐암주), SK-OV-3 (난소암주), SK-MEL-2 (피부종양주), XF-498 (중추신경계종양주) 및 HCT-15 (직장종양주) 등 5종의 human tumor cells에 대한 시험관내 세포 증식저해 효과를 검색하여 본 결과 모든 화합물들이 각각의 암세포주에 대하여 농도의존적으로 우수한 세포증식저해 효과를 보여주었으며 특히 화합물 2-6의 경우에는 각각의 암세포주에 대한 ED50 (50% 세포증식저해 효과를 나타내는 농도) 치가 모두 5.0 ㎍/ml 이하의 수치를 나타내고 있어 우수한 항암제로의 개발 가능성을 시사하고 있다 (Table Ⅰ).
- 화합물 1 은 미황색 oil로 MS, 1H-NMR spectrum 및 l3C-NMR spectrum을 검토하고 표품과 비교한 결과 safrole로 동정하였다.4) 화합물 2는 미황색 oiP상 물질로서 EI-MS (M+, 326), 1H-NMR과 13C-NMR data를 통해 이 화합물의 분자식은 추정할 수 있었다.
- 화합물 4는 무색 결정으로 M+가 m/z 328(C20H24O4)에서 나타났으며 1H-MR과 13C-NMR data가 화합물 2의 그것들과 유사하였으나 화합물 2의 경우 5 5.82에서 2개의 methy lenedioxy 기가 관찰되고 있는 반면 화합물 4의 경우에는 하나의 methylenedioxy기 (δ 5.95)와 methoxy기(δ 3.87)가 따로따로 나타나고 있어 화합물 2의 두 개의 methylene- dioxy기 중 하나가 개열된 구조임을 추정할 수 있었으며 기타 1H- NMR과 13C-NMR data를 종합하여 문헌치와 비교하여 본 결과 화합물 4는 본 식물로부터 분리된 바 있는 macelignan 과 일치함을 알 수 있었다.9,10,11)
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