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문제 정의
- Jung 등7)은또한 해당근 euscaphic acid 및 tormentic acid가 진통소염작용을 나타낸다고 하였다. 그러나 해당근으로 고지방식이로 유도된 지방간과 고지혈에 대한 유효성에 대한 연구는 없었으므로 본 연구에서는 이의 유효물질을 찾고자 연구를 수행하였다.
- 비만 흰쥐에 대한 해당근 시료가 미치는 영향을 알아보기 위해 실험하였다. 즉, 고지방 식이 흰쥐에 시료들을 4주간 투여하고서 활성산소 해독계인 total SOD, GPx, catalase 활성을 측정하였다.
제안 방법
- - 검액을 제조하기 위해 메탄올 추출물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 분리 화합물 kaji-ichigoside F1; rosamultin, euscaphic acid 와 tormentic acid를 10% Tween 80에 용해한 후 생리식염수로 희석하여 실험동물에 경구투여하였다. 투여용량은 투여 직전 체중의 변화에 따라 산출하였다.
- - 식이성 비만(diet-induced obesity)을 유도하기 위하여 예비실험 을 실시 하였다. 정상식 이와 고지 방식 이를 Table I에 리스트하였다.
- - 추출, 분획 및 분리는 전보에 따라 수행하여 해당근의 MeOH 추출물, CHCq 분획, EtOAc 분획을 얻었으며 , EtOAc 분획을 컬럼 크로마토그래피를 반복수행 하여 kaji-ichigoside Fp rosamultin, euscaphic acid,tormentic acid를 얻어서 실험에 사용하였다. 여기서 분리 물질은 표준품과 융점, 선광도, co-TLC에서 비교동정한 후 사용하였다.
- Gao 둥의 방법 13)에 준하여 0.2 M potassium phosphate buffer (200 μM cytochrome C, 100 μM EDTA 함유 pH 8.6) 1.0 mH 효소액 0.2 m/를 가하여 ice bath상에서 20분간 방치하고 test에는 alkaline dimethyl sulfoxide (DMSO) 용액 0.5 m/, blank에는 non-alkaline DMSO 용액 0.5 m/를 각각 가하고 37℃에서 30분간 반응시키고 파장 550 nm 에서 감소되는 cytochrome C의 흡광도를 측정하였다. SOD 1 unit는 측정계에서 생성되는 superoxide dismutase에 의해 50% 저해될 경우의 반응액 중의 검체량 (1D50)을 나타내었다.
- 1 mM EDTA-2Na] 200를넣고 vortex에서 잘 혼합한 다음, 37℃ water bath에서 40 분간 정치한다. 반응액에 시 약 C(300mg of sulfanilic acid/ 5.0 mg N-1 -naphthyl-ethylenediamine in 500 ml of 16.7% acetic acid) 2.0 m/를 넣어 잘 혼합하여 실온에서 20분 동안 정치한 다음 550nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검량 선에 준하여 혈청 중의 superoxide dismutase 활성을 측정하였다.
- 본 실험의 사육환경은 온도 22±3℃, 상대습도 50+10°, 조명시간 12시간(07:00-19:00)로 설정하였다. 사료는 실험동물용 고형사료를, 음용수는 상수도를 자유 섭취시켰다.
- 본 연구에서는 6주간 고지방 식이한 고지혈증 실험동물에 해 당근의 분획 및 각 성분을 4주간 투여하고서 체중의 측정, 혈액 및 간장 중의 지질의 함량측정 및 혈액 중 항산화 효소 활성의 측정, 간조직 항산화활성 등을 측정하였다. 해 당근 메탄올 추출물과 그 에틸아세테이트 분획물은 고지방식이 체중을 감소시켰으므로 해당근이 비만에 유효한 것으로 나타났으며, 그 분획물에 활성성분이 존재하는 것으로 나타났다.
- 본 실험의 사육환경은 온도 22±3℃, 상대습도 50+10°, 조명시간 12시간(07:00-19:00)로 설정하였다. 사료는 실험동물용 고형사료를, 음용수는 상수도를 자유 섭취시켰다. 실험시간 전 24시간 동안 물만 주고 절식하였다.
- HQ?의 환원되는 정도를 파장 240nm에서 흡광도의 변화를 읽고 분자흡광계수 0.041 mM-1cm-1을 이용하여 활성도를 산정하였다. 효소활성의 단위는 1분당 1 mg protein이 분해하는 hydrogen peroxide의 양을 μmole로 표시하였다.
- 실험하였다. 즉, 고지방 식이 흰쥐에 시료들을 4주간 투여하고서 활성산소 해독계인 total SOD, GPx, catalase 활성을 측정하였다. 이들 효소들은 활성산소종을 소거시키는데 작용하는 효소들이다.
- kit(AM 157S-K, Asan)를 사용하여 실험하였다. 즉, 빙 냉 상에서 효소시약(lipoprotein lipase 10800U, glycerol kinase 5.4U, peroxidase 135000U, L-a-glycerol phosphooxidase 160U 함유)을 효소시약 용해액 [N, N-bis(2-hydroxyethyl)2- aminoethane sulfonic acid 0.427 g/dl 함유]에 용해한 후 시료 20ml에 조제한 효소시액 3.0ml을 첨가한 후 37℃에서 10분간 incubatiori하여 시약 blank를 대조로 파장 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 검량선에 준해 혈중 함량은 mg/dl로 표시하였다.
- )를 사용하여 실험하였다. 즉, 빙냉상에서 효소시약(Phospholipase 3.9U, choline oxidase 5., 6U, peroxidase 3.6U, 4-aminoan- tipyrine 0.3252 mg 함유)을 효소시약 용해액 |his(hydroxy- methyl)-aminomethane 6.057 mg 함유]에 용해한 후 시료 20 ml에 조제한 효소시액 3.0 ml을 첨가한 후 37℃에서 20 분간 인큐베이션하여 시약 blank를 대조로 파장 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 검량선에 준해 그 함량을 mg/ dl로 표시하였다.
- 즉, 빙냉상에서 효소시약(cholesterol esterase 20.5 U/ 1, cholesterol oxidase 10.7 U/l, sodium hydroxide 1.81 g/1함유)을 용해한 후 시료 20ml에 조제한 효소시액을 첨가한 후 37℃에서 5분간 incubation하여 시 약 bla^k를 대조로 500mn에서 흡광도를 측정하였다. 표준검 량선에 준해 혈중함량은 mg/dl로 표시하였다.
- 산출하였다. 지방조직의 무게는 복강 및 고환 부위 의지 방을 채취하여 산출하였다.
- 대조군은 동일량의상기 용매를 사용하였다. 투여용량과 기간은 예비실험을 행한 후 본 실험에 효과가 있다고 생각되는 해당근 메탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획은 200mg/kg-fi:, euscaphic acid 와 tormentic acid는 30mg/kg을 경구로 4주간 투여하였다.
대상 데이터
- - 본실험에 사용된 SPF Sprague Dawley (SD) 계 흰쥐를 (주)BioLink (충북 음성)로부터 웅성 횐쥐를 1주일간 검역과 순화 및 사육을 거쳐 건강한 동물반을 실험에 사용하였다. 본 실험의 사육환경은 온도 22±3℃, 상대습도 50+10°, 조명시간 12시간(07:00-19:00)로 설정하였다.
- 一 cytochrome C, pyrogallol, NADPH, NADP 및 bovine serum albumin은 Sigma제, NaN3, deoxyribose, ferrous ammonium sulfate, sodium dodecyl sulfate, thiobarbituric acid, hydroxylamine, hypoxanthine은 Aldrich제, reduced glutathione, oxidized 이utathione은 Fluka제, 또한 kit 시약 중 total cholesterol 및 triglyceride^ 영동제약, 인지질측정용 kit는 Itron(Japan)을 사용하였다. 실험에 사용한 기구는 생화학 분석장비 (Hitachi 7600-110), 혈액분석 기 (Coulter GEN-S), UXcspectrophotometer(Shimadzu, UV-440), refrigerated centrifuge(Beckman J4-41), ultra- centrifuge(Hitachi, 65-P7), Electrothermal digital melting point apparatus, MB-100 FT-IR spectrometer(Bomen), Brucker-AM 300 spectrometer, Rudolph Autopol III auto- metic polarimeter 및 cold laboratory chamber(Korean manhattan, KMC-8514) 등이었다.
- 투여용량은 투여 직전 체중의 변화에 따라 산출하였다. 대조군은 동일량의상기 용매를 사용하였다. 투여용량과 기간은 예비실험을 행한 후 본 실험에 효과가 있다고 생각되는 해당근 메탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획은 200mg/kg-fi:, euscaphic acid 와 tormentic acid는 30mg/kg을 경구로 4주간 투여하였다.
- 실험에 사용한 기구는 생화학 분석장비 (Hitachi 7600-110), 혈액분석 기 (Coulter GEN-S), UXcspectrophotometer(Shimadzu, UV-440), refrigerated centrifuge(Beckman J4-41), ultra- centrifuge(Hitachi, 65-P7), Electrothermal digital melting point apparatus, MB-100 FT-IR spectrometer(Bomen), Brucker-AM 300 spectrometer, Rudolph Autopol III auto- metic polarimeter 및 cold laboratory chamber(Korean manhattan, KMC-8514) 등이었다.
- 그러므로, 저자 들은 해당근이 한국의 민간에서 당뇨병에 효과가 크다고 알려져 있기 때문에 고지방식이에 따르는 비만 및 고지혈에 유익할 것이라는 기대 하에 해당근 추출물과 분획물로 고지방식이 흰쥐에 대한 항고지혈 실험을 한 결과 해당근 메탄올 추출물과 그 에틸아세 테 이트 추출물이 효과가 있었으므로, 에 틸아세테 이트 분획물을 silica gel column chromatorgraphy로 물질을 분리한 결과 kaji-ichigoside F1, rosamultin, euscaphic acid,tormentic acid가 얻어졌으며, 이들의 물리화학적 실험 결과 각 화합물들이 동정되었다. 이들 4 화합물들에 대한 예비실험결과 kaji-cihigoside F과 rosamultin은 효과가 없었으며, 나머지 2 화합물인 euscaphic acid와 rosamultin은 유의성있는 효과를 나타내었으므로 이들 2 분리된 물질과 해당화 메탄올 추출물 및 에틸아세테이트 추출물을 본 실험을 위해실험재료로 사용하였다.
데이터처리
- V)을 표준품으로 하여 측정하였다. 본 실험에서 얻어진 결과는 평균치 ± 표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test로 그 유의성을 나타내었다.
이론/모형
- Berenice 등의 방법''에 준해 hydrogen peroxide, 이utathione 및 NADPH가 함유된 0.1 mM Tris bufifer(pH 7.2)중에서 효소액을 가하여 파장 340nm에서 홉광도를 측정하고 표준검량선에 준하여 활성도를 산정하였다. 효소 활성의 단위는 1분간 1 μM NADPH를 산화시키는 효소의 양으로 정의하였다.
- - Ajit 등의 방법9)에 준하여 조제된 kit(AM 157S-K, Asan)를 사용하여 실험하였다. 즉, 빙 냉 상에서 효소시약(lipoprotein lipase 10800U, glycerol kinase 5.
- - Richmond 등의 효소법8) 에 의하여 조제된 kit(AM 202-K, Asan)를 사용하여 실험하였다. 즉, 빙냉상에서 효소시약(cholesterol esterase 20.
- - Ven Gent, C.M., and Roseleur 의 효소법 (10)에 의해 조제된 kit(Iatron Chem. Co.)를 사용하여 실험하였다. 즉, 빙냉상에서 효소시약(Phospholipase 3.
- - 단백질의 함량은 Lowry 등의 방법 *에 준하여 bovine serum albumin(Sigma, Fr. V)을 표준품으로 하여 측정하였다. 본 실험에서 얻어진 결과는 평균치 ± 표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test로 그 유의성을 나타내었다.
성능/효과
- - 고지방 식이 비만 흰쥐의 고지혈증 유발시 total cholesterol, LDL- cholesterol, HDL-cholesterol 농도가 매우 높게 증가하였다 (Table IV). 고지혈증의 유도로 total cholesterol, LDL-cholesterol 함량이 정상군에 비해 약 2배 정도 증가하던 것이 해당근 EtOAc 분획, euscaphic acid 및 tormentic acid의 투여로 현저히 감소하였으나 정상군 수준에는 미치지 못하였다.
- 20)유리기에 의한 생체내 손상을 측정하는 방법에 있어 단백질법은 지질과산화 측정법보다 예민한 방법으로 알려지고 있다.21)단백질 카르보닐의 생성은 지질의 과산화시에 생성되는 유리기들이 생체내 단백질과 반응한 결과이다. 당뇨성 동맥경화 환자의 동맥조직내 단백질 산화를 관찰한 결과 정상인에 비해 현저히 높은 것은 주목할만하다.
- 고지방 식이로 유발된 비만 흰쥐는 간장 조직 중에서도 total cholesterol, triglyceride 및 cholesterol이 약 2배 증가되어 있는 것으로 나타났다(Table IV). 시료의 투여로 이러한 간장조직 중의 total cholesterol, triglyceride 및 cholesterol의 함량이 현저히 감소하였으나 정상군에는 미치지 못하였다.
- 1에 나타내었다. 고지방식이 비만 유도군은 6주간 사육한 결과 정상군에 비해 체중이 현저히 증가하였다. 해당근 추출물과 분리 물질을 경구로 4주간 투여했을 때 2주 투여 때부터 체중이 감소하다 3주, 4주 투여함으로써 체중감소효과가 더욱 뚜렷하였다.
- 이들 성분들은 비만 흰쥐의 고지혈증을 개선하였으며, 간 조직 내 항산화계 효소 활성을 회복시킴으로써 비만 흰쥐의 지질대사의 정상화에 기여하였을 것으로 예측되었다. 궁극적로 euscaphic acid와 tomientic acid는 고지방 식이에 따르는 비만을 개선하는 해당근의 유효성분인 것으로 결론지을 수 있었다.
- 정상식 이와 고지 방식 이를 Table I에 리스트하였다. 그 결과 실험동물에 고지방 식이를 총 6주간 먹이면서 체중 및 혈중 지질을 측정한 결과, 고지방 식이를 섭취한 쥐의 체중이 기본식이를 섭취한 쥐에 비해서 약 130% 이상의 체중 증가를 보이고, 지방 조직과 혈중 지질의 수치도 높게 나타내어서 총 6주의 사육기간이 비만증 유도에 적절한 것으로 생각되었으며, 정상군으로서 기본 식이를 다른 한 그룹은 고지방 식이를 6주간 섭취케 하여 식이성 비만쥐를 유도하였으며, 이 기간 동안에 물을 임의로 음용하도록 하였다.
- 연구이다. 그러므로, 저자 들은 해당근이 한국의 민간에서 당뇨병에 효과가 크다고 알려져 있기 때문에 고지방식이에 따르는 비만 및 고지혈에 유익할 것이라는 기대 하에 해당근 추출물과 분획물로 고지방식이 흰쥐에 대한 항고지혈 실험을 한 결과 해당근 메탄올 추출물과 그 에틸아세 테 이트 추출물이 효과가 있었으므로, 에 틸아세테 이트 분획물을 silica gel column chromatorgraphy로 물질을 분리한 결과 kaji-ichigoside F1, rosamultin, euscaphic acid,tormentic acid가 얻어졌으며, 이들의 물리화학적 실험 결과 각 화합물들이 동정되었다. 이들 4 화합물들에 대한 예비실험결과 kaji-cihigoside F과 rosamultin은 효과가 없었으며, 나머지 2 화합물인 euscaphic acid와 rosamultin은 유의성있는 효과를 나타내었으므로 이들 2 분리된 물질과 해당화 메탄올 추출물 및 에틸아세테이트 추출물을 본 실험을 위해실험재료로 사용하였다.
- 그리고 혈중 hydroxyl radical을 측정 한 결과 정상군은 2.56±0.09nmol/mg protein인데 비하여 고지방 식이 비만 쥐는 5.87 ±019 nmol/mg protein으로 2배 증가하였으며 시료 투여군은 이를 현저히 감소시켰다(Fig. 2B). 고지 방식이 비만 흰쥐는 혈중 SOD의 활성이 1.
- 혈청 HDL-cholesteerol 함량은 고지혈증군은 정상군보다 약 48% 감소하던 것이 시료의 투여로 증가하였다. 동맥경화지수를 계산하였을 대 고지방식이로 처리로 정상군에 비해 약 5배정도 현저히 증가하던 것이 해당근 성분의 투여로 감소하는 것으로 나타났다.
- 또한, 고지방식이로 유도된 고지혈증 흰쥐는 혈중 hydroxyl radical 생성과 SOD 활성이 현저히 증가하였으며, 해 당근 시료의 투여로 이들이 감소되었다. 혈액에서 과도하게 생성된 괴산화지 질은 혈중으로 방출되어 glutathione peroxidase glutathione reductase system 같은 효소계에 의해 분해될 때까지 혈중을 순환하며 혈관 벽에 상해를 입히게 된다.
- 3은 고지방 식이로 유도한 비만흰쥐의 항산화계 효소에 미치는 효과를 관찰한 결과이다. 비만쥐에서 SOD 활성이 정상군에 비하여 약 50% 감소하던 것이 EA와 TA의 투여로 상당히 회복되는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 GPx 및 catalase 의 활성에서도 유사한 경향으로 나타났다.
- 유발되었다(Table III). 시료를 4주간 투여한 군은 대조군에 비해 총지질이 함량이 크게 감소하였다. 중성지방은 총지방의 감소와 유사하게 관찰되었으나 인지질은 그 감소경향이 매우 약하게 나타났다.
- 해 당근 메탄올 추출물과 그 에틸아세테이트 분획물은 고지방식이 체중을 감소시켰으므로 해당근이 비만에 유효한 것으로 나타났으며, 그 분획물에 활성성분이 존재하는 것으로 나타났다. 에틸아세테이트 분획물에서 분리된 4종의 triterpenoid 중 kaji-ichigoside Ft, rosamultin, euscaphic acid, tormentic acid 중 euscaphic acid와 tormentic acid가 유의성 있는 체중감소 효과를 나타내었다. 또한 tormentic acid가 euscaphic acid보다 더 강한 효과를 나타내었다.
- acid와 같은 triterpenoid인 것으로 확인되었다. 이들 성분들은 비만 흰쥐의 고지혈증을 개선하였으며, 간 조직 내 항산화계 효소 활성을 회복시킴으로써 비만 흰쥐의 지질대사의 정상화에 기여하였을 것으로 예측되었다. 궁극적로 euscaphic acid와 tomientic acid는 고지방 식이에 따르는 비만을 개선하는 해당근의 유효성분인 것으로 결론지을 수 있었다.
- 이상과 같이 해당근은 고지방식이로 유도된 비만을 감소시키는 효과가 있었으며 그 활성성분은 tomientic acid와 euscaphic acid와 같은 triterpenoid인 것으로 확인되었다. 이들 성분들은 비만 흰쥐의 고지혈증을 개선하였으며, 간 조직 내 항산화계 효소 활성을 회복시킴으로써 비만 흰쥐의 지질대사의 정상화에 기여하였을 것으로 예측되었다.
- 03 MDA nmol/ml of serum으로 약 2배 정도 증가되었다. 이에 비해 시료 투여군들은 각 시료를 4주간 투여함으로써 이러한 과산화지질을 크게 억제하는 것으로 나타났다. 그 활성의 크기는 MeOH ertract, EtOAc fraction, euscaphic acid, tormentic acid의 순으로 나타났다.
- 6mg/g으로 정상식이 군에 비해 약 2배 정도 증가하였다. 이에 시료를 4주간 투여 했을 때 EtOAc 분획, euscaphic acid, tormentic acid가 대조군에 비해 현저히 감소되었다. 이러한 결과는 부고환 주위 및 후복강 주위 조직의 지방함량 변화와 유사한 경향을 나타내었다.
- 첫째, 지방조직으로부터의 지방동원이나 간장 이외의 조직에서 lipoprotein 혹은 chylomicron triacylglycerol의 가수분해로 인해 상승한 혈장 유리지방산 수준과 관련이 있다. 결국, 유리지방산이 간장 내에 흡수되는데 혈청 lipoprotein 의 생산이 이의 유입정도를 따르지 못하면 간장 내에 중성지방의 축적이 일어나게 된다.
- 이러한 결과는 해당근중 존재하는 특이적인 triterpenoid가 유효성분인 것을 의미하며 배당체는 효과가 미약하였다. 한편, 해당근 추출물, 분획물 및 활성성분 euscaphic acid, tormentic acid 투여는 고지방식이의 결과 증가된 후복강내 지질 및 부고환 주위의 지방 중량이 감소시켰으므로 사용된 시료들이 지질대사에 관여하고 있음을 보였다.
- 해 당근 메탄올 추출물과 그 에틸아세테이트 분획물은 고지방식이 체중을 감소시켰으므로 해당근이 비만에 유효한 것으로 나타났으며, 그 분획물에 활성성분이 존재하는 것으로 나타났다. 에틸아세테이트 분획물에서 분리된 4종의 triterpenoid 중 kaji-ichigoside Ft, rosamultin, euscaphic acid, tormentic acid 중 euscaphic acid와 tormentic acid가 유의성 있는 체중감소 효과를 나타내었다.
- 7% 정도 억제되었다. 해당근에서 얻은 시료를 투여하였을 때 SOD 활성은 상당히 회복되는 것으로 나타났다(Fig. 2C).
- 고지혈증의 유도로 total cholesterol, LDL-cholesterol 함량이 정상군에 비해 약 2배 정도 증가하던 것이 해당근 EtOAc 분획, euscaphic acid 및 tormentic acid의 투여로 현저히 감소하였으나 정상군 수준에는 미치지 못하였다. 혈청 HDL-cholesteerol 함량은 고지혈증군은 정상군보다 약 48% 감소하던 것이 시료의 투여로 증가하였다. 동맥경화지수를 계산하였을 대 고지방식이로 처리로 정상군에 비해 약 5배정도 현저히 증가하던 것이 해당근 성분의 투여로 감소하는 것으로 나타났다.
후속연구
- 혈액에서 과도하게 생성된 괴산화지 질은 혈중으로 방출되어 glutathione peroxidase glutathione reductase system 같은 효소계에 의해 분해될 때까지 혈중을 순환하며 혈관 벽에 상해를 입히게 된다.19) 본 실험으로 해당근에서 분리된 EA와 1A는 고지방식이로 유도된 ·OH기와 같은 유리기를 감소시키는 것으로 나타난 바지 질과 산화에 따르는 조직손상을 예방할 것으로 추측된다.
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