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문제 정의
- , 2004)가 보고되어 있으나 보다 다양한 반응계에서의 비교연구는 이루어져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 두 종의 박하가 여러 가지 in vitro 반응계에서 어떠한 항산화 작용을 나타내는 지를 비교 검토하여 보다 우수한 새로운 천연 항산화제 후보 소재를 발굴하고자 하였다.
제안 방법
- 2. DPPH 라디칼에 대한 소거 활성 : Bloi (1958>의 방법에 준해 조제한 1.5xl(LM DPPH 용액 2.971me에 일정 농도의 박하 추출물 0.03 me을 가해 혼합하고 일정 시간 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조로서 시료 대신 용매를 사용하여 동일한 과정으로 수행한 반응액에 대해 흡광도를 측정하고 시료의 흡광도를 대조의 흡광도에 대한 백분율로 하여 소거능 (%)을 산출하였다.
- 03 业로 반응액을 조성하여 40℃의 암소에서 반응시켰다. 24시간 후 이 반응액 0.1 业 을 취해 75% ethanol 2.7 mC, 30% ammonium thiocyanate 용액 0.1 m& 3.5% HC1 에 녹인 0.02 M ferrous chloride 0.1 와 혼합한 후 500 흡광도를 측정하여 산화 정도를 관찰하였고 결과는 시료 대신 용매를 사용한 대조군의 흡광도에 대한 저해율(%)로서 나타내었다.
- 3.저밀도 지단백 (low density lipoprotein, LDL)의 산화에 대한 저해 활성 : Miller et al. (1996)의 방법을 변형하여 다음과 같이 실험하였다. 50~100 me의 protein을 함유하도록 human LDL을 조제한 후, 일정 농도의 박하 추출물 0.
- (1972)의 방법에 의해 다음과 같이 실험하였다. 4가지 추출물을 최종반응 농도가 5, 10, 50, 100, 200“g/me 이되도록 조제한 후 각각 0.5 成 씩 취해 0.1 M Tris-HCl 완충용액 (pH 8.5) 0.11成, 100 gM PMS 0.21戒 과 함께 560nm에서 흡광도 측정하여 이때의 흡광도를 S»로 하고, 계속하여 500 |1M NBT 0.2 및 500 gM NADH 0.4 me를 가 한 후 560nm에서 측정된 흡광도를 &으로 한 후 결과 산출에 사용하였다. 또한 대조로서 시료 대신 용매를 사용하여 동일한 과정으로 실험하여 Co 및 C를 얻었고 각 흡광도를 [(C-Co-(S-So))/(C-Co)]xlOO에 대입하여 Superoxide 소거능 (%)을 산출하였다.
- 4 me를 가 한 후 560nm에서 측정된 흡광도를 &으로 한 후 결과 산출에 사용하였다. 또한 대조로서 시료 대신 용매를 사용하여 동일한 과정으로 실험하여 Co 및 C를 얻었고 각 흡광도를 [(C-Co-(S-So))/(C-Co)]xlOO에 대입하여 Superoxide 소거능 (%)을 산출하였다.
- 약용자원시험 포장에서 지상부를 채취한 후 세척, 동결건조, 분쇄하여 추출물 조제에 사용하였다. 메탄올 추출물은 분쇄된 각 건조 시료를 accelerated solvent extraction (ASE apparatus)를이용하여 50℃에서 5분간 메탄올로 2회 반복 추출하고 이를 여과, 감압 농축하여 조제하였고, 물 추출물은 동일 용량의 증류수로 상온에서 24시간 진탕 추출한 후 여과하는 과정을 2 회 반복 한 후 동결건조하여 조제하였으며 각 추출물의 수득량을 측정하였다.
- 67% TBA 용액 1 me를가하고 95℃에서 15분간 가열, 냉각을 순차적으로 행하였다. 얻어진 반응액을 3, 000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후 분리된 상 등액 중에 함유된 malondialdehyde (MDA)의 양을 540nm 에서 측정하여 대조군에 대한 저해율(%)로서 결과를 나타내었다.
- (1993)의 방법에 따라 다음과 같이 실험하였다. 일정 농도의 박하 추출물을 각각 100 me를 취해 2% Na2CO3 용액 2mC을 혼합하고 2분 후 50% Folin-Ciocalteau reagent 0.1를 첨가하였으며 상온에서 30분간 방치한 후 750nm에서 측정된 흡광도를 tannic acid를 표준 물질로 사용한 검량 선식에 대입하여 추출물에 대한 총 페놀 함량(%)을 산출하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 PMS (phenazine methosulfate)를 비롯한 분석 용 시약은 Sigma Co. (USA) 제품을, DMSO (dimethy-Isulfbxide)를 포함한 용매는 특급을, 시료 추출에는 ASE-300 (Dionex Co, USA)을 사용하였고, linoleic acid 산화 저해 실험에는 shaking incubator (DS-310R, Dasol, Korea)를, 흡광도 측정에는 UV-visible spectrophotometer (Cary 300, Varian, Australia)를 사용하였다.
- 는 2004년 6월 농촌진흥청작물과학원. 약용자원시험 포장에서 지상부를 채취한 후 세척, 동결건조, 분쇄하여 추출물 조제에 사용하였다. 메탄올 추출물은 분쇄된 각 건조 시료를 accelerated solvent extraction (ASE apparatus)를이용하여 50℃에서 5분간 메탄올로 2회 반복 추출하고 이를 여과, 감압 농축하여 조제하였고, 물 추출물은 동일 용량의 증류수로 상온에서 24시간 진탕 추출한 후 여과하는 과정을 2 회 반복 한 후 동결건조하여 조제하였으며 각 추출물의 수득량을 측정하였다.
데이터처리
- +Values with superscript within the same column are significantly different at p v 0.05 by Duncan's multiple range test.
- 박하 추출물에 대해 수행된 항산화 실험의 유의성은 SAS (statistical analysis systems) program을 이용하여 p<0.05의 수준에서 one way ANOVA test 중 Duncan, s multiple range test로 검정하였다.
이론/모형
- 1. Superoxide 라디칼 소거능 : M. viridis, M. piperita의 메탄올 추출물 및 물 추출물의 superoxide 라디칼에 대한 소거 활성은 Nishikimi et al. (1972)의 방법에 의해 다음과 같이 실험하였다. 4가지 추출물을 최종반응 농도가 5, 10, 50, 100, 200“g/me 이되도록 조제한 후 각각 0.
- 페놀계 항산화제들은 연쇄반응에서 alkylperoxy radical이나 alkylradical에 수소를 공여함으로서 그 radical을 제거하여 산화를 억제하는 것으로 보고되어 있는 바(Labuza, 1973), 박하의 항산화 활성에 영향을 미치는 페놀화합물의 양을 비교하기 위해 Kim et al. (1993)의 방법에 따라 다음과 같이 실험하였다. 일정 농도의 박하 추출물을 각각 100 me를 취해 2% Na2CO3 용액 2mC을 혼합하고 2분 후 50% Folin-Ciocalteau reagent 0.
성능/효과
- 1. Superoxide 라디칼에 대한 박하의 소거능은 M. viridis가 M. piperita 보다 우수하였으며 특히 물 주줄 물은 대조물질인 ascorbic acid보다 우수하였다.
- 1~100姒成의농도에서 M. viridis의 메탄올 추출물은 65.86~77.59%의 LDL 산화 저해능을, M. piperita의 메탄올 추출물은 50~75.45%의 LDL 산화저해능을 나타내었으며 M. viridis의 물 추출물은 37.69-87.21%, M. piperita의 물 추출물은 18.45~87.69%의 LDL 산화저해능을 보여 M. viridis가 M. piperita 보다 우수한 LDL 산화 저해능을 나타낸 것을 알 수 있었다 (Fig. 3). 그리고 M.
- 2. DPPH 라디칼에 대한 소거능은 메탄올 추출물 및 물 추출물 모두에서 M. viridis가 M. piperita보다 우수하였으며 특히 M. viridis의 메탄올 주줄물은 롤a-tocopherol과 비슷한 수준이었다.
- 3.사람의 저밀도지단백질의 산화에 대한 박하의 저해 활성을 분석한 결과는 M. viridis:가 M. piperita 보다 우수하였으며 M. viridis의 모든 추출물(65.889-77.59%, 37.69%~ 87.21%)은 a-tocopherol (28.37%~66.54%)보다 월등하게 우수하였다.
- 4. Linoleic acid의 산화에 대한 저해 효과는 M. viridis가 M. piperitaSJe 높았으며 a-tocopherol의 활성에 근접하는 수준이었다.
- 5.총 페놀 함량은 M. viridis (17.95% & 10.18%)가 M. piperita (15.44% & 9.19%)보다 높은 값을 나타내었으며 메탄올 추출물이 물 추출물보다 그 함량이 높았다.
- 6.추출물의 수율은 메탄올 추출물 및 물 추출물 모두에서 M. piperita (14.1% & 14.6%)가 M. viridis (13.3% & 13.5 %)보다 높게 나타나 항산화 활성 및 총 페놀 함량과는 상반되는 결과를 나타내었다.
- Superoxide 라디칼에 대한 박하의 소거능을 분석한 결과, 5~200/zg/mE의 농도에서 메탄올 주 줄물은 M. viridis 12-62.4%, M. piperitae} 15.01 ~30.21%를 나타내 M. viridis 가 M. piperita보다 우수한 효과를 나타내었으며 대조물질인 ascorbic acid의 -4.2~68.96%와 비교할 때 두 종의 박하 메탄올추줄물 모두 50 /zg/me 이하의 농도에서는 ascorbic acid 보다 우수한 superoxide 소거능을 나타내었으나 100ug/me 이상의 농도에서는 낮은 활성을 나타내 농도에 따 라 그 효능에 차이가 있는 것으로 확인되었다. 한편, 동일 농도에서 물 추출물은 M.
- 36%의 산화 저해 활성을 나타내었다. 그리고 2종 박하의 메탄올 추출물은 모두 5 “g/mC 이상의 농도에서 a-tocopherol의 linoleic acid 산화저해 능인 62.32~71.97%보다 우수하였고, 물 추출물은 50ug/me이상의 농도에서 a-tocopherol의 32.32-66.93% 와 비교할 때 우수한 효과를 나타냄으로써 저농도보다는 고농도에서 효과적으로 항산화 작용을 나타내는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 종합할 때, 박하는 a-tocopherol 정도로 우수한 linoleic acid 자동산화 저해 효과를 가지며 2종의 박하 중에는 M.
- 3). 그리고 M. viridis의 메탄올 추출물은 실험된 전 농도에서 대조물질 a-tocopherol의 28.37-66.54%보다 월등하게 우수한 효과를 나타낸 반면 M. piperita의 메탄올 추출물은 10ug/me 이상의 농도에서만 a-tocopherol보다 더 우수하였다. 한편, 물주줄물의 경우에는 전 실험 농도에서 M.
- 또한 2종의 박하로부터 얻어진 추출물의 수율을 측정한 결과, M. viridis의 메탄올 추출물 및 물 추출물은 각각 13.3% 및 13.5%였고, M. piperita의 메탄올 추출물 및 물 추출물은 각각 14.1% 및 14.6%로 나타나 수율에서는 M. piperita 에서 M. viridis 보다 좀 더 높은 수치를 나타내었는데 이는 Domian et al. (2003)이 보고한 M. piperita Frantsila (332 mg/g of dry weight) 및 M. spicata var. crispa (231 mg/g of dry weight)과 일치하는 결과이다 (Table 1).
- 박하 추출물의 DPPH 라디칼에 대한 소거능을 분석한 결과 (Fig. 2), 0.1 ~250//g/mE의 농도에서 M. viridis의 메탄올 추출물은 -0.83~90.36%, M. piperita의 메탄올 추출물은 -0.68~ 87.01 %의 소거능을 보였고, M. viridis의 물 추출물은 -1.28~ 77.49%, M. pipeF&a 물 추출물은 —0.02~ 11.79%의 소거 능을 나타내 메탄올과 물 추출물 모두에서 M. Widis가 M. viridis보다 더 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 나타내는 것을 알 수 있었으며 물 추출물보다는 메탄올 추출물이 높은 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 특히 M.
- 4에 나타내었다. 실험 결과 M. viridis의 메탄올 추출물은 0.01~100ug/me 의 농도에서 -2L1 ~81.86%의 활성을 나타내었고 M. piperita의 메탄올 추출물은 -7.52~81.32%의 활성을 보였으며, 물 추출물에서는 M. viridis가 4.11-83.7%, M. piperita가 -4.03- 81.36%의 산화 저해 활성을 나타내었다. 그리고 2종 박하의 메탄올 추출물은 모두 5 “g/mC 이상의 농도에서 a-tocopherol의 linoleic acid 산화저해 능인 62.
- I). 이러한 결과를 종합할 때 M. viridis가 M. piperita보다 좀 더 우수한 superoxide 소거능을 나타내었으며 두 종 모두 메탄올로 추출한 경우보다 물로 추출한 경우가 우수한 superoxide 소거능을 가지며 물로 추출하였을 때 대조물질인 ascorbic acid 보다도 우수한 superoxide 소거능을 가지는 것을 알 수 있었다.
- piperita 모두 a-tocopherol보다 우수한 결과를 나타내었다. 이러한 결과를 종합할 때, M. piperita 보다는 M. viridise}, 그리고 메탄올 추출물보다는 물 추출물이 더욱 효과적으로 사람의 저밀도지단백질의 산화에 대해 저해 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다. 따라서 M.
- 93% 와 비교할 때 우수한 효과를 나타냄으로써 저농도보다는 고농도에서 효과적으로 항산화 작용을 나타내는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 종합할 때, 박하는 a-tocopherol 정도로 우수한 linoleic acid 자동산화 저해 효과를 가지며 2종의 박하 중에는 M. viridis:가 M. piperita보다 좀 더 우수한 것으로 판단되 었다.
- 이상과 같은 실험 결과를 종합하면 실험된 4가지 in vitro 항산화계에서의 활성과 총 페놀 함량에서 M. viridis (M. spicata)가 M.piperita보다 우수하였으며 따라서 M. viridis 는 보다 유용한 기능성 소재로 개발될 가능성이 높다고 사료된다.
- 이상의 실험 결과를 종합할 때, 실험된 박하중에서 M. viridise} M. piperita보다' 우수한 산업화 후보자원이라고 사료된다.
- 같다. 즉, M. viridis의 메탄올 추출물과 물 추출물 의총 페놀 함량이 각각 17.95%와 10.18%였고 M. piperita의 메탄올 추출물과 물 추출물의 총 페놀 함량이 각각 15.44% 및 9.19%으로 나타났으며 이러한 결과를 보면 메탄올 추출물 및 물 주줄물 모두 M. viridis가 M. piperita보다 대체적으로 높은 함량을 나타낸 것을 알 수 있었다. 그런데 이러한 결과는 Zheng과 Wang (2001)이 생시료 형태로 분석한 M.
- viridis보다 더 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 나타내는 것을 알 수 있었으며 물 추출물보다는 메탄올 추출물이 높은 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 특히 M. viridise\ 메탄올 추출물이 나타낸 DPPH 라디칼 소거능은 대조물질인 atocopherol의 DPPH 라디칼 소거능(4.86~91.63%)에 근접하는 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
- 96%와 비교할 때 두 종의 박하 메탄올추줄물 모두 50 /zg/me 이하의 농도에서는 ascorbic acid 보다 우수한 superoxide 소거능을 나타내었으나 100ug/me 이상의 농도에서는 낮은 활성을 나타내 농도에 따 라 그 효능에 차이가 있는 것으로 확인되었다. 한편, 동일 농도에서 물 추출물은 M. viridis7\ 10.13~89.36%, M. piperita가 0.8~74.79% 의 활성을 나타내 M. viridise] 좀 더 높은 효과를 나타내었으며 물 주줄 물은 대부분의 실험 농도에서 대조물질인 ascorbic acid보다 우수한 superoxide 소거능을 나타내는 것으로 확인되었다 (Fig. I). 이러한 결과를 종합할 때 M.
- piperita의 메탄올 추출물은 10ug/me 이상의 농도에서만 a-tocopherol보다 더 우수하였다. 한편, 물주줄물의 경우에는 전 실험 농도에서 M. viridis과 M. piperita 모두 a-tocopherol보다 우수한 결과를 나타내었다. 이러한 결과를 종합할 때, M.
후속연구
- viridise}, 그리고 메탄올 추출물보다는 물 추출물이 더욱 효과적으로 사람의 저밀도지단백질의 산화에 대해 저해 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다. 따라서 M. viridis는 동맥경화 발병의 주요 요인인 LDL 의 산화 (Gaut & Heinecke, 2001 : Gugliucci & Menini, 2002)를 효과적으로 저해함으로서 이와 관련된 순환기계 질환의 발병 또한 차단하는 데 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
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