선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 감국에 존재하는 항충치활성 물질 및 glucosyltransferase 저해 효과에 대한 정보를 얻고자 본 연구를 시도하였다. 감국 ethanol 추출물의 항충치활성을 S.
- 본 연구에서는 오랫동안 생약재로 사용되어오고 있는 감국의 용매 분획추출물에 대해 항미생물활성 및 glucosyltransferase 활성저해 효과를 검토하고, 활성물질에 대해 column chromatography, HPLQ 등의 기기를 이용하여 활성물질을 분리하였다.
제안 방법
- HPLC는 먼저 시료를 Sep-pak(Ci8 type과 silica type)으로전처리하고 filter(GELMAN Acrodisc LC 13 PVDF, 0.2/Zm) 로 여과한 후, Radial-Pak Cis column(0.8xl0.0cm)과 CLC-ODS column(0.46 x 25cm)은 분당 각각 1.0mL와 0.5mL로 용출분획 하여 항미생물활성 및 GTase 억제 효과를 검정하였다.
- Sephadex LH-20 column chromatography는 Sephadex LH-20(25-100mesh, Pharmacia사)을 methanol- chloroform(4:l, v/v) 용매계로 히여 column(bed volumn 250mD에 충진하고 동 용매계로 용출분획 하였다.
- Sephadex LH-20 column chromatography에서 얻어진 활성획분에 대하여 TLC를 행한 결과, 5개의 band로 분리되어 각각의 band를 분취흐}고 용출된 획분에 대하여 Sreptococcus mutant 검정 미생물로하여 감국 100g에 상당하는 추출물로항미생물 활성을 검정하였다. TLC 상에서 가장 활성이 높은 획분은 Rf 0.
- 시도하였다. TLC 상에서 얻어진 활성획분에 대하여Radial-Pak Cis column을 사용한 reverse pha*의 HPLC로분획하였다. 항충치활성은 감국 200g에 상당하는 추출물로 항 충치 활성을 검정한 결과 retention time이 7.
- Thin layer chromatography (TLC)는 시료를 methanol : chlorofonn(l:l, v/v) 용매계로 plate(Kiesegel 60 F254, 20 x 20cm, LOmm, Merck사)에 banding한 후, UV 및 육안에 의해 확인된 분리양상에 따라 절취하고, methanol: chloroform (1:1, v/v) 용매계로 용출분획하였다.
- 감국 3.4kg에 ethanol 15 L를 가하여 상온에서 24시간 동안 침지 시키고 glass filter(G3)로 여과하여 여액과 잔사를 얻었고, 이 잔사를 ethanol로 2회 반복하여 추출 . 여과하였다.
- 감국 추출물의 항미생물활성을 검색하기 위해서 Streptococcus mutans 와 구강에서 분리한 세균 등에 대해 건조 감국 0.2g, 1.0g에 상당하는 ethanol 추출물로 항미생물활성을 경시적으로 측정하고 관찰한 결과는YTable 1>에 나타냈다. 감국 0.
- 시험관을 30° 기울인 상태로 효소액을 37P에서 24시간 동안 반응시키고, vortexing 하여 glucan을 분산시킨 다음 spectrophotometer(HP 8452, Hewlett Parkard, USA)로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구의 경우 시료 대신에 멸균수를 첨가하였으며, 흡광도를 측정하여 다음 식에 따라 저해율을 구하였다.
- 먼저 silica gel adsorption chromatography는 silica gel(120g, 70-230 mesh, column chromatography용, Merck사)을 ethylacetate로 slurry를 만들어 column에 충진시키고, ethylacetate-methanol 용매계를 이동상으로 하여 methanol 농도를 0~100% 씩 증가시키는 step-wise 방법으로 용출분획 하였다.
- 중성획분 (ethylacetate-soluble neutral fraction) 그리고 수상획분을 분리하였다. 산성 및 중성획분에 존재하는 항미생물 활성물질은 silica gel adsorption chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography 그리고 HPLO를 이용하여 분리정제를 실시하였다.
- 상기의 silicagel adsorption chromatography에서 얻어진활성획분(2.5g)을 methanol: chloroform 용매계의 Sephadex LH-20의 gel filtration (bed volumn 200mL)으로 분획하고 Sreptococcus mutanse- 검정미생물로 하여 감국 70g에 상당하는 추출물로 항미생물활성을 검정하였다. Sephadex LH-20 column의 bed volumn에 대한 elution volumn의 비 (Ve/Vt)가 0.
- 14mL을 첨가하여 최종 부피를 1mL 되도록 조정하였다. 시험관을 30° 기울인 상태로 효소액을 37P에서 24시간 동안 반응시키고, vortexing 하여 glucan을 분산시킨 다음 spectrophotometer(HP 8452, Hewlett Parkard, USA)로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구의 경우 시료 대신에 멸균수를 첨가하였으며, 흡광도를 측정하여 다음 식에 따라 저해율을 구하였다.
- 이상의 정제과정에서 어느 정도 정제가 이루어졌기에 HPLQ 분석을 시도하였다. TLC 상에서 얻어진 활성획분에 대하여Radial-Pak Cis column을 사용한 reverse pha*의 HPLC로분획하였다.
- 0g 에 상당하는 량으로 조제하여 멸균된 filter paper discCToyo, 8 mm, Japan)에 흡수시킨 후, 용매를 완전히 휘발시키고 시험용 평판배지 위에 놓아 밀착시켰다. 이어 0.85% 멸균 식염수로 시료를 배지 위에 확산시켜, 37℃의 배양기에서 24시간 배양한 다음 disc 주변의 저해환의 직경(mm)을 측정하였다.
- 항미생물활성 시험용 평판 배지의 조제는 멸균된 배지에 균주를 0.05%씩 접종하여 20mL씩 petri dish에 부어 응고시켰다. 화합물의 항미생물 검색은 한천 배지 확산법(disk plate method)으로 측정하였다.
대상 데이터
- 사용하였다.-각-phenol솽훠홥물을-sigma 사재 품; BHI 배자는 Difco Co, (Detroit Michigan, USA) 제품을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 균주는 충치관련 균주로 Streptococcus mutansATCC 25175와본 실험실에서 분리한 충치균 SM 5, M 6, SM12, SM 23 등 5가지 균주를 brain heart infusion(BHI, Difco, USA) bmth에 접종하여 37P에서 3회 계대배양하여 사용하였다.-각-phenol솽훠홥물을-sigma 사재 품; BHI 배자는 Difco Co, (Detroit Michigan, USA) 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용된 감국은 전라남도 지역에서 생산하는 것으로 화순군 소재의 전남생약농업협동조합에서 판매하는 건재를 사용 호였다.
이론/모형
- GTase의 활성은 Endo 등27)의 방법에 따라 조효소액을 제조하고 sucrose를 기질로 하여 생성된 불용성 glucan을 분광광도법으로 측정하였다. 즉 시험관에 기질용액(sucrose 12.
- 감국의 ethanol 추출물은 Kim 등28)의 방법에 의하여 ethylacetate와 buffer용액을 이용하여, ethyl acetate 가용 산성획분(ethyl acetate-soluble acidic fraction), ethylacetate 가용 중성획분 (ethylacetate-soluble neutral fraction) 그리고 수상획분을 분리하였다. 산성 및 중성획분에 존재하는 항미생물 활성물질은 silica gel adsorption chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography 그리고 HPLO를 이용하여 분리정제를 실시하였다.
- 05%씩 접종하여 20mL씩 petri dish에 부어 응고시켰다. 화합물의 항미생물 검색은 한천 배지 확산법(disk plate method)으로 측정하였다. 즉, 추출물을 0.
성능/효과
- 0g에 상당하는 ethanol 추출물로 항미생물활성을 경시적으로 측정하고 관찰한 결과는YTable 1>에 나타냈다. 감국 0.2g 싱당의 추출물에서는 Streptococcus mutans와 구강에서 분리된 SM 5 및 SM 23에 대해 증식억제 효과를 나타냈다 감국 1.0g 상당의 추출물에서도 구강에서 분리된 SM 6와 SM 12 등을 제외한 Streptococcus muians와 구강에서 분리된 SM 5 및 SM 23에서 증식억제효과가 뚜렷하게 나타났다. 이들 3 균주에 대한 증식억제 효과는 배양 5일까지 지속되는 것을 관찰할 수 있어 감국 ethanol 추출물이 충치균 및 구강세균에 대하여 강한 증식억제효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- 감국 3.4kg을 ethan이로 추출하고 용매분획하여 얻어진 수용액획분, 산성획분, 중성획분에 대하여 감국 4.0g에 상당하는 추출물로 항충치활성을 검정한 결과, 중성획분에서 높은 활성을 나타냈다. 감국추출물의 용매분획의 결과로 보아 감국에 존재하는 항충치물질은 중성물질이며 methanol 용매계에 잘 이행하는 것으로 보아 어느 정도 극성을 갖는 물질로 판단되었다.
- mutanse 2종의 구강세균에 대하여 활성이 높게 나타났다. 감국 ethanol 추출물의 농도에 따라 GTase 저해효과는 78.4~92.3%의 범위로 나타나 농도가 증가할 수록활성도 함께 증가하는 경향을 나타냈다. 감국을 ethanol로 추출, 용매분획하여 얻어진 활성성분을 silica gel adsorption chromatography, Sephadex LH-20 chromatography, TLC 그리고 HPLC 등의 방법으로 분석한 결과, 감국에 존재하는 항충치활성 물질은 약간의 극성을 띠는 중성물질로 분자량이 200-400정도 되는 저분자 물질인 것으로 확인되었다.
- CTable 2>와 같다. 감국 ethanol 추출물의 반응농도에 따라 GTase 저해효과는 78.4~92.3%로 나타나 농도가 증가할수록 활성도 함께 증가하는 경향을 나타냈다.
- 감국 ethanol 추출물의 항충치활성을 S. mutans 및 구강세균에 대해 검색한 결과, S. mutanse 2종의 구강세균에 대하여 활성이 높게 나타났다. 감국 ethanol 추출물의 농도에 따라 GTase 저해효과는 78.
- 3%의 범위로 나타나 농도가 증가할 수록활성도 함께 증가하는 경향을 나타냈다. 감국을 ethanol로 추출, 용매분획하여 얻어진 활성성분을 silica gel adsorption chromatography, Sephadex LH-20 chromatography, TLC 그리고 HPLC 등의 방법으로 분석한 결과, 감국에 존재하는 항충치활성 물질은 약간의 극성을 띠는 중성물질로 분자량이 200-400정도 되는 저분자 물질인 것으로 확인되었다.
- 0g에 상당하는 추출물로 항충치활성을 검정한 결과, 중성획분에서 높은 활성을 나타냈다. 감국추출물의 용매분획의 결과로 보아 감국에 존재하는 항충치물질은 중성물질이며 methanol 용매계에 잘 이행하는 것으로 보아 어느 정도 극성을 갖는 물질로 판단되었다.
- 08mg/mL에서 GTase 의 활성을 99% 정도 저해하였고, 츄잉검 등의 충치 예방물질로 이용되고 있는 mutastein도 상기의 농도하에서 99%의 저해 효과를 나타냈다고 보고하였다. 본 연구에서는 감국을 ethanee 추출한 것 만을 가지고 GTase 저해활성을 측정하였지만, 상기의 연구는 오배자와 적포도과피 추출물을 여과하고 Sephadex LH-20 column chromatography# 행한 후 얻어진 정제액을동결건조하여 분말형태의 것을 사용하여, 본 연구와의 검정 과정 및 농도에 차이가 있어 GTase의 활성 값을 정확히 비교하기는 어려우나, 본 연구결과를 분석하여 볼 때 감국 ethanol 추출물이 GTase 활정 저해에 대해 효과가 높다고 판단되었다.
- 용매분획에서 활성을 나타내는 중성획분(5아을 정제하고자 silica gel adsorption chromatography로 분획하고 Streptococcus muians를 검정미생물로 하여 감국 30g°fl 상당하는 추출물로 항미생물활성을 검정한 결과, ethylacetate내 methanol 농도가 10-30% 용출획분에서 활성이 인정되어 활성획분 2.5g을 얻었다.
- 0g 상당의 추출물에서도 구강에서 분리된 SM 6와 SM 12 등을 제외한 Streptococcus muians와 구강에서 분리된 SM 5 및 SM 23에서 증식억제효과가 뚜렷하게 나타났다. 이들 3 균주에 대한 증식억제 효과는 배양 5일까지 지속되는 것을 관찰할 수 있어 감국 ethanol 추출물이 충치균 및 구강세균에 대하여 강한 증식억제효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- 6mg을 얻었다. 이러한 결과로 TIQ상에서 컴국와항충차물찰의 분포양상은 단왈물질아 아나라 복수의 물질이 존재하는 것으로 판단되었다.
- 이상의 결과로 보아 감국에 존재하는 항충치물질은 약간의 극성을 띤 중성의 물질로 200-400정도의 분자량을 갖는 주요성분이 3종인 활성본체가 존재한다고 판단되며, 이들 물질에 의해 항충치활성이 발현되고 있다고 생각된다. 감국에 존재하는 항충치물질은 L6~4.
- TLC 상에서 얻어진 활성획분에 대하여Radial-Pak Cis column을 사용한 reverse pha*의 HPLC로분획하였다. 항충치활성은 감국 200g에 상당하는 추출물로 항 충치 활성을 검정한 결과 retention time이 7.1~12.4분에서 활성이 인정되어 활성획분 103.5mg을 얻었다.
후속연구
- 6). 따라서 이러한 충치발생균인 g mutant 성장을 억제할 수 있다면 충치 예방 및 그 발생 빈도의 감소효과가 있을 것으로 기대되어진다. 충치와 관련된 연구로는 GTase 합성저해제의 개발, 항균제재의 개발 등7-10)의 연구와 녹차, 오룡차, 황백, 후박피, flavonoids, 해조류 추출물인 funoran, 알로에 등1T)의 천연물을 이용한 항미생물 물질 개발 등이 보고되고 있다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.