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문제 정의
- 미생물 유래의 중합화효소(microbial transglutaminase, MTGase)를 이용하면 식품 단백질의 기능 특성을 향상시키는 것이 가능하다. 본 연구에서는 MTGase를 이용, 동물성 단백질인 p-casein 및 식물성 단백질인 US globulin의 동종 혹은 이종간을 bio- hybrid시킴으로써 단백질의 기능 특성을 향상시키고자 하였다.
- 그러나 단백질의 기능 특성 중 겔화 이외의 기능에 대해서는 아직 연구가 미흡하고, 또한 동종단백질(homologous protein)에 대한 연구가 주를 이루고 있으나, 이종간의 단백질 (heterologous protein)에 대해서는 연구가 거의 되어 있지 않다(21).이에 본 연구에서는 동물과 식물 유래의 각종 식품 단백질 (soy glycinin, BSA, & casein, p-lactoglobulin 등)을 적절히 조합하여 이종간의 단백질에 MTGase를 작용시켜 생성된 중합체를 가지고 SDS-PAGE에 의한 반응성(susceptibility) 분석, oil droplet size 분포 분석, emulsion stability, SEM에 의한 emulsion 상태 분석 및 구조분석 등의 기능 특성을 연구하였기에 그 결과를 보고한다.
제안 방법
- 수중유적형 (oil-in-water) emulsion은 17%(Wv)의 com oi"을 0.02% sodium azidelNaNJ와 MTGase로 반응시킨 0.5% 혹은 1%의 기질 단백질을 함유한 0.1 M Tris-HCl(pH 7.0)에 첨가시켜 조제하였다. 즉 효소 반응시킨 단백질 용액과 com oil을 혼합하여 균질기 (Physcotron NS-50, Japan)를 사용하여 25℃, 22, 000 rpm에서 3분간 균질화시킨 후, Ultrasonic Generator US 150 (Nihonseiki, Japan)를 사용하여 lOpiA에서 2분간 초음파 처리를 하여 emulsion을 조제하였다.
- 각 emulsion 시료 200 ㎕와 glutaral dehyde 200 ㎕를 혼합하여 조제하였으며, 시료 건조는 Critical Ion Diyer(Hitachi HCP-2, Japan)를, 코팅은 Ion Sputter(Hitachi E-1030, Japa묘)를 이용하였다. Emulsion의 초기 시료의 모습과 7일 후의 emulsion 시료의 모습을 상호 비교하여 시일이 경과함에 따라 안정성에 어떠한 영향을 미치는지주사형 전자현미경으로 분석하였다.
- 이들 식물성 단백질인 IIS globulin 과 동물성 단백질인 g-casein의 이종간 conjugation 이외에 다른 단백질을 가지고 susceptibility에 대한 연구를 진행하였지만, 구상단백질인 a-lactalbumin, p-lactoglobulin, ovalbumin, BSA 등의 동물성 단백질과 IIS globulin의 반량체인 7S globulin(conglycinin, Mw 180,000)이나 gluten의 경우, 동종 간의 conjugation 은 환원제(dithiothreitol, 2-mercaptoethanol, glutathione 둥) 처리 나 가열에 의한 denaturation 등의 방법을 통해서 반응성을 높일 수는 있었으나, 이종간의 반응성은 중요하게 나타나지 않았다. 따라서 기질 단백질은 US globulin과 ^casein의 반응 조건을 가지고 동종 혹은 이종간의 conjugation에 의한 단백질의 기능 특성을 위한 조건으로 이용하였다.
- 0) 완충용액을 이용하여 3TC에서 정해진 시간만큼 MTGase로 반응시켰다. 반응 종료 시는 10 mM NEM(N-ethylmaleimide)을 첨가시킴으로써 MTGase 효소 반응을 정지시켰다.
- 본 연구에서도 이들의 방법을 이용하여 유적사이즈뿐안 아니라 공학적인 빙.법에 의해서 계산된 유적의 수를 경시적으로 분석하여 유화안정성을 판정하였다. 즉, 초기의 유적의 수(N)를 t시간 후의 유적의 수(N)로 나눈 값에 In 값을 취한 값으로 데이터를 나타내었으며, In 간 후의 값이 초기 값에 가까우면 가까울수록 유화 안정성은 뛰어나며, 초기 값에서 멀어지면 멀어질수록 유화 안정성은 좋지 않은 것으로 판정할 수 있다.
- 법의 하나로서 Reddy and Fogler 의 방법(27)을 종종 이용하기도 한다. 본 연구에서도 이들의 방법을 이용하여 유적사이즈뿐안 아니라 공학적인 빙.법에 의해서 계산된 유적의 수를 경시적으로 분석하여 유화안정성을 판정하였다.
- 이종간의 반응성을 조사하기 위하여 동물성 단백질인 BSA,a-lactalbumin, J3-Iactoglobulin, p-casein 등과 식물성 단백질인 glycinin, conglycinin, gluten 등의 단백질을 0.5-2% 농도로 3 mM DTT(dithiothreitol)^ 존재 하에 0.1 M Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액을 이용하여 3TC에서 정해진 시간만큼 MTGase로 반응시켰다. 반응 종료 시는 10 mM NEM(N-ethylmaleimide)을 첨가시킴으로써 MTGase 효소 반응을 정지시켰다.
- 즉, SDS-PAGE에 의한 susceptibility 확인, particle size 분석 및 Reddy and Fogler 방법에 의한 유화안정성 (emulsion stability) 실험, 그리고 유화 안정성에 영향을 주는 bio-hybrid된 단백질이 어떤 형태로서 안정성에 영향을 미치는지주사형 전자현미경(SEM)을 이용하여 유적(oil droplet)에 결합된 단백질을 고배율로 분석하였다. SDS-PAGE에 의해 동종 혹은 이종의 단백질 간 의 가교 결합이 형성되었으며, 특히 이종간의 결합은 그 밴드가 약하게 형성되었으며 oligomer의 형태를 나타내었다.
대상 데이터
- Acetone powder로부터 IIS globulin(glycinin)의 정제도를 높이기 위해 이온 칼럼인 DEAE-Toyopearl 650M을 이용하였다.
- Streptoverticillium mobaraense로부터 분리 정제된 중합화 효소인 MTGase는 아지노모토의 Kumazawa 박사로부터 제공받아 실험에 사용하였으며 specific activity는 2.88 units/mg이었다. 사용된 기질 중 하나인 (3-casein은 Sigma사(C-6905, St.
- 대두콩의 한 품종인 Shimtsurunoko(22)는 일본 교또 대학으로 부터 제공받았으며, 보존하면서 쓸 목적으로 Thanh 등(23)의 방법에 따라 처리하여 Fig. 1에 나타낸 바와 같이 acetone powder 를 제조하여 냉동실에 보관하면서 실험에 사용하였다. Acetone powder로부터 IIS globulin(glycinin)의 추출 방법은 Fig.
- 2에 나타내었다. 또한 glycinin을 추출 후 정제도를 더욱 높이기 위해 이온 칼럼인 DEAE-Toyopearl 650 M을 이용하여 7S globulin (conglycinin, IIS globulin의 반량체)를 거의 완전히 제거시켜 실험에 사용하였다 (Fig. 4의 IIS globulin 전기영동 band 참조).
- 88 units/mg이었다. 사용된 기질 중 하나인 (3-casein은 Sigma사(C-6905, St. Louis,USA)의 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 유적의 평균 입자사-이즈 분석은 Particle Size Analyzer(Horiba LA-500, Japan)를 이용하여 분석하였다. 측정에 앞서 emulsion 은 기기의 필요한 입자수밀도를 맞추기 위하여 0.
이론/모형
- MTGase의 activity는 Folk(24)의 방법에 의하여 assay 하였으며, 0.25 mL의 최종 반응 혼합액에는 0.13 M Tris-acetate buffer (pH 7.0)에 20 mM CBZ-L-Gln- Gly, 67 mM hydroxylamine,3.3 mM CaCl2, 0.7 mM EDTA를 포함한다. 효소용액은 3TC에서 10분간 반응시킨 후, 반응액에 15% trichloroacetic acid, 0.
- SDS-polyacrylamide gel은 Laemmli(26)의 방법을 이용하였으며, SDS와 환원제인 2-ME(2-mercaptoethanol)로 반응액을 dena turation 시킨 후, stacking gel이 4.5%, separating gel이 10%인 homogeneous polyacrylamide slab g이을 이용하여 전개하였다.
- 기질 단백질의 농도는 Lowry 등(25)의 방법과 protein assay kit를 사용하여 단백질을 정량하였다.
- 7 이하가 되도록 희석하였다. 탁도 스펙트라(turbidity spectra)는 분광광도계를 이용하여 400nm에서 7O0nm까지 기록하였고, emulsion 안정성은 Reddy and Fogler(27)의 방법에 따라 계산하였다.
성능/효과
- IIS globulin + -casein의 경우는 native가 0.2, MTGase 반응 시 간 5분이 0.28, 15분이 0.4로 P-casein 보다는 약간 높은 값을 나타내었지만 안정성은 비교적 좋은 것으로 판단되었다. Table 1의 유적사이즈 분석에 의한 결과와 Reddy and Fogler의 방법(27)에 의한 결과(Fig.
- 즉, 단백질이 거의 덩어리로 뭉쳐 있는 모습을 볼 수가 있었으며, 이러한 이유로 emulsion의 안정성이 낮은 것을 확인할 수 있었다. MTGase를 11S에 5분간 반응시킨 경우, 1, 000배의 배율로 분석한 결과, 초기(C) 및 7일(D) 후의 emulsion은 모두 큰 덩어리를 형성하고 있어서 안정성이 거의 없는 것으로 나타났다. 이 결과는 유적사이즈 분포에서 나타난 결과와 매우 잘 일치하는 결과이다.
- 이러한 결과에서 유추가가능한 것은 IIS globulin은 emulsion을 만들면 곧 aggregation 이 일어나는 것을 알 수 있었는데, [3-casein과의 일부가 crosslinking됨으로써 aggregation을 방지해주고 유화 안정성을 높여주는 것을 알 수 있었다. SDS-PAGE 결과에서 보여주는 바와 같이 |3-casein은 분자량이 약 30,000 정도(실제는 24,000)로 분자량이 아주 큰 ns와 상호 결합함으로써 11S의 aggregation의 원인이 되는 소수성 결합(hyd2phobic bond)을 빙해함으로써 안정성을 높여주는 것으로 추정되었다
- 이량체(dimer)의 부분을 보게 되면 11S globulin의 경우 아주 약한 band를 나타낸 반면, β-casein의 경우는 선명한 band를 볼 수 있으나 적은 양의 단백질 band를 나타내었다. 그러나 두 단백질 간의 반응성은 IIS globulin과 Pcasein 각각의 반응량보다 많은 양의 dimer 및 oligomer를 형성하고 있는 것으로 확인이 되었다. 이dimer나 oligomer의 경우, 이종간의 conjugation 뿐만이 아니고, 동종 간에도 conjugation0] 일어난 것으로 판단되었다.
- 57 um로 native보다는 약간 큰 입자크기를 나타내었지만, 층 분리나 안정성에는 변화가 거의 없었다. 따라서 이 결과로부터 IIS globulin의 유화 불안정성은 β-casein과 MTGase에 의해 일부가 이종간의 cross-linking 됨으로 인해 안정성이 부가된 것으로 판단되었다. 이러한 결과에서 유추가가능한 것은 IIS globulin은 emulsion을 만들면 곧 aggregation 이 일어나는 것을 알 수 있었는데, [3-casein과의 일부가 crosslinking됨으로써 aggregation을 방지해주고 유화 안정성을 높여주는 것을 알 수 있었다.
- SDS-PAGE에 의해 동종 혹은 이종의 단백질 간 의 가교 결합이 형성되었으며, 특히 이종간의 결합은 그 밴드가 약하게 형성되었으며 oligomer의 형태를 나타내었다. 또한 유화안정성은 동종 간에서는 β-casein이 우수하였으며, glycinin은 안정성이 거의 없는 것으로 나타났다. 그러나, 두 단백질 이종간의 안정성은 glycinin보다 더 우수하였다.
- 66 jimS. 매우 컸으며, MTGase# 5분간 반응시킨 11S의 경우는 22.87 um, 15분 반웅시킨 것은 43.88 um로 aggregation이 매우 심하게 나타나는 것올 알 수 있었다.이는 Fig.
- 사진에서 IIS globulin과 B-casein은 유적의 입자에 고르게 분산, 결합되어 일정한 형태의 emulsion을 나타내고 있는 것을 알 수 있었다, C와 D는 MTGase를 5분간 반응시킨 결과로서 30, 000배의 고배율로 분석한 것이다. 사진에서 보는 바와 같이 유적의 표면에 단백질이 고르게 분산되어 있었으며, IIS globulin 혹은 p-casein^] 동종 혹은 이종간 cn)ss-linkin흥되어 유적간 교량 역할을 함으로써 유화 안정성을 나타내는 것으로 판단되었다. E와 F는 MTGase 를 15분간 반응시킨 emulsion의 초기와 7일 후유적입자 표면을 20, 000배의 고배율로 분석한 결과이다.
- E와 F는 MTGase 를 15분간 반응시킨 emulsion의 초기와 7일 후유적입자 표면을 20, 000배의 고배율로 분석한 결과이다. 유적의 표면에 단백질이 고르게 분산되어 있었으며, 이들 단백질이 유화 안정성에 영향을 주는 중요한 구실을 하는 것으로 생각되었다. Fig.
- 15 정도의 값을 나타내었다. 이들값으로 추정해 볼 때 안정성은 매우 좋은 것으로 인정되었다.
- 따라서 이 결과로부터 IIS globulin의 유화 불안정성은 β-casein과 MTGase에 의해 일부가 이종간의 cross-linking 됨으로 인해 안정성이 부가된 것으로 판단되었다. 이러한 결과에서 유추가가능한 것은 IIS globulin은 emulsion을 만들면 곧 aggregation 이 일어나는 것을 알 수 있었는데, [3-casein과의 일부가 crosslinking됨으로써 aggregation을 방지해주고 유화 안정성을 높여주는 것을 알 수 있었다. SDS-PAGE 결과에서 보여주는 바와 같이 |3-casein은 분자량이 약 30,000 정도(실제는 24,000)로 분자량이 아주 큰 ns와 상호 결합함으로써 11S의 aggregation의 원인이 되는 소수성 결합(hyd2phobic bond)을 빙해함으로써 안정성을 높여주는 것으로 추정되었다
- 그러나, 두 단백질 이종간의 안정성은 glycinin보다 더 우수하였다. 전자현미경 사진에서는 유적에 bio-hybrid된 단백질이 고르게 분포될수록 안정성이 더 우수한 것으로 판단되었다.
- 그러나 IIS globulin을 p- casein과 혼합하여 유화시킬 경우, 안정성을 크게 향상시킬 수 있다는 결과를 가져왔다. 즉, IIS globulin 단독으로는 유화 안 정성이 없었으나 이종의 단백질을 부가하여 native 혹은 MTGase 를 반응시킴으로써 유화 안정성을 크게 향상시킬 수 있었다는 것은 매우 중요한 결과인 것으로 평가되었다.
- 43 um의 유적사이즈 값을 나타내어 안정성이 매우 우수하였다, IIS globulin과 p~casein을 동일농도로 혼합하여 최종 농도 1%로 MTGase 반응시킨 경우 는 native의 경우보다는 7일 후 약간 큰 입자크기를 나타내었 지만 유화안정성은 우수한 것으로 나타내었다. 즉, native의 경 우는 1.5um에서 7일 후 1.59 um로 거의 변화가 없었으며, 효 소반웅 5분 후는 151 um에서 1.62 um로, 15분간의 반응시간에 서는 1.46 um에서 1.57 um로 native보다는 약간 큰 입자크기를 나타내었지만, 층 분리나 안정성에는 변화가 거의 없었다. 따라서 이 결과로부터 IIS globulin의 유화 불안정성은 β-casein과 MTGase에 의해 일부가 이종간의 cross-linking 됨으로 인해 안정성이 부가된 것으로 판단되었다.
- 치즈 단 백질인 casein의 경우는 native와 MTGase에 의해 5분, 15분 반응시킨 결과, 초기의 유적사이즈에 비해 7일 후 그다지 크게 형성되지 않은 결과를 나타내어 유화 안정성은 Liu and Damodaran (29)의 결과와 비슷하게 본 연구에서도 매우 우수한 것을 알 수 있었다.즉, native의 경우는 초기와 7일 후의 값이 각각 1.46 um, 1.50um를 나타내었고, 효소 반응 5분의 경우는 초기와 7일 후의 값이 1,43 um과 1.48 um, 그리고 15분 반응시킨 경우는 각각 L41 um과 1.43 um의 유적사이즈 값을 나타내어 안정성이 매우 우수하였다, IIS globulin과 p~casein을 동일농도로 혼합하여 최종 농도 1%로 MTGase 반응시킨 경우 는 native의 경우보다는 7일 후 약간 큰 입자크기를 나타내었 지만 유화안정성은 우수한 것으로 나타내었다. 즉, native의 경 우는 1.
- A의 경우는 11S 단백질이 고르게 분포되어 있는 것처럼 보이지만 실제는 이미 단백질간의 회합(aggregation)이 일어나고 있는 것을 알 수 있었으며, 더욱 자세하게는 B(emulsion을 만든 후 7일 경과후)의 사진에서 알 수 있었다. 즉, 단백질이 거의 덩어리로 뭉쳐 있는 모습을 볼 수가 있었으며, 이러한 이유로 emulsion의 안정성이 낮은 것을 확인할 수 있었다. MTGase를 11S에 5분간 반응시킨 경우, 1, 000배의 배율로 분석한 결과, 초기(C) 및 7일(D) 후의 emulsion은 모두 큰 덩어리를 형성하고 있어서 안정성이 거의 없는 것으로 나타났다.
- 법에 의해서 계산된 유적의 수를 경시적으로 분석하여 유화안정성을 판정하였다. 즉, 초기의 유적의 수(N)를 t시간 후의 유적의 수(N)로 나눈 값에 In 값을 취한 값으로 데이터를 나타내었으며, In 간 후의 값이 초기 값에 가까우면 가까울수록 유화 안정성은 뛰어나며, 초기 값에서 멀어지면 멀어질수록 유화 안정성은 좋지 않은 것으로 판정할 수 있다. 즉, 값이 1 이내에 있을 경우는 유화안정성이 우수한 것으로 인정되며, 그 이상일 경우는 유화 안정성이 점점 나빠지는 경향을 띤다.
- C와 D는 MTGase 로 5분간 반응시킨 결과로서 20, 000배율로 분석한 결과이다. 초기와 7일 경과 후의 모습이 거의 비슷하였으며, 단백질이 유적표면에 결합되어 이웃하는 유적의 단백질과 회합 혹은 결합하여 안정한 상태를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 pvasein이 IIS globulin보다 더욱 안정한 기질인 것을 나타내 주는 것이며, Liu and Damodaran(29)의 결과와도 일치하는 것으로 나타났다.
- 이러한 결과의 추정은 SEM의 분석에 의해 확실히 알 수 있었다. 치즈 단 백질인 casein의 경우는 native와 MTGase에 의해 5분, 15분 반응시킨 결과, 초기의 유적사이즈에 비해 7일 후 그다지 크게 형성되지 않은 결과를 나타내어 유화 안정성은 Liu and Damodaran (29)의 결과와 비슷하게 본 연구에서도 매우 우수한 것을 알 수 있었다.즉, native의 경우는 초기와 7일 후의 값이 각각 1.
후속연구
- 현재까지 단백질에 대한 연구는 대개 단일 단백질에 대한 모델케이스로 연구가 많이 진행되어 왔으나 이와 같은 이종의 단백질을 가지고 연구한 모델 케이스는 거의 없었다. 따라서 식품 화학 및 식품가공학적인 관점에서 동, 식물성 단백질에 대한 연구가 이제부터 이종의 단백질에 대해서 계속해서 진행될 필요가 있다고 하겠다. 이러한 이유는 단일의 단백질이 나타내는 기능 특성은 한계가 있기 때문이다.
- 지금까지 hydrolase에 의한 단백질의 기능 특성이 많이 연구되어 왔지만, 향후 이종간 단백질의 중합화에 의한 기능 특성 연구가 계속해서 진행될 필요가 있다. 이것은 산업적으로 이용 가능한 기능 특성이 우수한 단백질을 개발함으로써 고부가가치를 창출할 수 있기 때문이며 꾸준한 연구가 기대된다.
- 이러한 이유는 단일의 단백질이 나타내는 기능 특성은 한계가 있기 때문이다. 지금까지 hydrolase에 의한 단백질의 기능 특성이 많이 연구되어 왔지만, 향후 이종간 단백질의 중합화에 의한 기능 특성 연구가 계속해서 진행될 필요가 있다. 이것은 산업적으로 이용 가능한 기능 특성이 우수한 단백질을 개발함으로써 고부가가치를 창출할 수 있기 때문이며 꾸준한 연구가 기대된다.
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