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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 생육 시기별로 채취한 피자두의 아세 톤 추출물의 세포독성효과를 조사하였고, 특히 인간 유래 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주를 사용하여 피자두의 유방 암세포의 세포주기에 미치는 영향과 세포사 관련 조절 단백질의 발현 양상을 분석함으로써 피자두의 유방암 억제 기전을 살펴보았다.
- 본 연구에서는 생육 시기별로 피자두를 수확한 후 피자두의 아세톤 추출물을 이용하여 인간 유래 간암, 위암, 자궁암, 백혈 암 및 유방암 세포주에 대한 세포독성효과를 조사하였고, 특히 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주를 사용하여 피자두의 유방암 세포의 세포주기에 미치는 영향과 세포사 관련 조절 단백질의 발현 양상을 분석함으로써 피자두의 유방암 억제 기전을 살펴보았다. 인간 유래의 암세포 주를 이용하여 피자두 추출물의 성장 저해 효과를 측정한 결과, 농도 의존적으로 모든 암 세포주에 대해 성장 저해 효과를 보였으며, 특히 피자두 14의 미숙과 추출물에서 높은 성장 저해 효과를 보였다.
제안 방법
- 배양 후 상등액을 제거하고 각 well에 생성된 foimazan 결정을 DMSO에 용해시켜 microplate readere. 550nm에서 측정한 흡광도로부터 다음과 같이 cytotoxicity를 구하여 세포 성장 억제 효과의 지표로 하였다.
- MDA-MB-231 세포주를 well 당 2X 104의 세포 수가 되도록 분주하고 24시간 배양한 후 피자두 1의 추출물을 첨가하여 6시간 배양하였다. PBS로 세척한 후 4% paraformaldehydee- 첨가하여 30분간 세포를 고정시킨 후 PBS로 2회 세척하여 DAPI solution의 최종 농도가 1 μg/mL이 되도록 세포에 첨가하여 암실에서 30분 동안 반응시켰다.
- Cell cycle을 분석하기 위하여 MDA-MB-231 세포주(3X105 cells)에 피자두 추출물을 첨가하고 PBS로 세척한 후 에탄올을 가하여 세포를 고정시켰다’ RNase를 함유한 sodium citrate buffer# 첨가하여 세포 내의 RNA를 제거하였다. Propidium iodide 용액으로 DNA를 염색하고자 37C에서 3(분간 반응시킨 후 FACS 분석을 통하여 세포주기 분석을 하였다.
- Western blotting: 전기영동을 하여 분리한 단백질은 immo- bilon-P transfer membTane(Millipore, Bedford, MA, USA) 과 transfer buffer(20% methanol, 25 mM Tris-Hcl, 192 mM glycine)# 사용하여 180 mA에서 90분간 전이시켰다. 계속하여 특정 단백질에 대한 항체와 그에 대한 이차 항체를 반응시키고 TTBS으로 세척한 후 마지막에 증류수로 세척하고 membrane에 ECL(enhanced chemiluminoesence) 용액을 도포하고, X-ray film에 노출하여 현상한 후 film 상의 band 농도를 관찰하였다.
- Caspase-3 activity: Caspase 3는 'Yama, Apopain 등으로 불 리우는 유전자로써 과발현될 경우 apoptosis가 유도되고(29), caspase-3 activity inhibitor를 사용하면 apoptosis가 억제되는 둥 apoptosis에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(30). 따라서 피자두 추출물이 유도하는 apoptosis 과정의 신호 전달 기전을 알아보고자 caspase-3의 활성을 관찰하였다(Fig. 6). MDA-MB- 231 세포주에 피자두의 미숙과 추출물을 10, 50, 100|ig/mI月 농도로 첨가하여 cspase-3의 활성을 측정한 결과 농도 의존적으로 그 활성이 증가되는 것을 알 수 있었다.
- 세포 배양용 6-well plate에 MDA-MB-231 세포주를 1><1。6 cells로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 피자두 추출물을 첨가하여 6시간 간격으로 PBS에 부유시킨 세포를 0.4% trypan blue와 동량으로 섞어 염색한 후 hemocytometer를 사용하여 살아있는 세포의 수를 측정하였다.
- PBS로 세척한 후 4% paraformaldehydee- 첨가하여 30분간 세포를 고정시킨 후 PBS로 2회 세척하여 DAPI solution의 최종 농도가 1 μg/mL이 되도록 세포에 첨가하여 암실에서 30분 동안 반응시켰다. 염색 용액을 제거한 후 PBS로 세척하고 372nni에서 형광현미경을 이용하여 200배의 배율로 세포핵의 형태 변화를 관찰하였다.
- 세포주 배양: 본 실험에 사용된 암세포 주는 모두 6종이며 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 사용하였다. 인간 유래 간암 세포주인 Hep G2, 위암세 포주인 KatoHI, 자궁암세포주인 Hela 및 혈액암 세포주인 U937, 호르몬 의존성 유방암 세포주인 MCF 7과 호르몬 비의존성 유방암 세포주인 MDA-MB-231 을 사용하여 암세포의 성장 저해 효과를 살펴보았다. 이들 세포들은 RPMI-1640배지 및 MEM 배지에 10% FBS와 1% antibiotic- antimycotice- 첨가하여 37。。5% CO2 배양기에서 2-3일에 한 번씩 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 피자두 1의 추출물이 농도별, 시간별로 MDA-MB-231 세포 주의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 tiypan blue 염색으로 생존 및 사멸 세포 수를 계수하여 확인하였다. 피자두 추출물을 처리하지 않은 대조군과 각 농도별로 처리한 군에서 24시간 경과 후 생존 세포 수는 Fig.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 피자두는 경북 김천 지역의 자두 농장에서 2002년 6월부터 미숙과를 채취하여 완숙 과에 이르기까지 8단계의 자두를 수확하였다(Table 1). 이때 가장 먼저 채취한 미숙 피자두를 피자두 1이라 명명하였고, 마지막에 채취한 완숙 피자두를 피자두 8이라 명명하였다.
- 세포주 배양: 본 실험에 사용된 암세포 주는 모두 6종이며 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 사용하였다. 인간 유래 간암 세포주인 Hep G2, 위암세 포주인 KatoHI, 자궁암세포주인 Hela 및 혈액암 세포주인 U937, 호르몬 의존성 유방암 세포주인 MCF 7과 호르몬 비의존성 유방암 세포주인 MDA-MB-231 을 사용하여 암세포의 성장 저해 효과를 살펴보았다.
이론/모형
- 세포독성 측정: 시료의 cytotoxicity를 측정하기 위하여 Green 둥(16)의 방법에 따라 MTT assay를 실시하였다. 먼저 배양한 세포를 1X104 cells/well의 농도로 96-well microtiter plate의 각 well에 200|1L씩 분주하고 24시간 배양하였다’ 멸균 증류수에 녹인 각 시료를 membrane filter(0.
성능/효과
- 인간 유래의 간암 세포 Hep G2와 위암 세포 Kato DI, 자궁경 부암세포 Hela, 백 혈암 세포인 U937 및 호르몬 의존성 유방암 세포인 MCF 7, 호르몬 비의존성 유방암세포인 MDA-MB-231에 대한 피자두 추출물의 성장 저해 효과를 살펴본 결과, 피자 두 추출물은 농도 의존적으로 모든 암세포 주에 대해 성장 저 해 효과를 보였으며 특히 미숙과 추출물에서 높은 성장 저해 효과를 보였다. Hep G2에 대한 피자두 추출물의 성장 저해 효과를 살펴본 결과(Table 3), 피자두 1의 추출물은 1 mg/mL의 농도에서 77%의 비교적 높은 저해 효과를 보였으며, 2mg/mL의 농도에서도 87%의 높은 저해 효과를 보였다. 그리고 피자 두 2, 3의 추출물의 경우는 2m%mL 이상의 농도에서 85% 정도의 저해 효과를, 피자두 4의 추출물은 24mg/mL의 농도에서 7079%의 저해 효과를 보였으나, 피자두 5-8의 추출물은 가장 높은 농도인 4mg/mL에서도 55-72% 정도의 비교적 낮은 생육 저해 효과를 보였다.
- 6). MDA-MB- 231 세포주에 피자두의 미숙과 추출물을 10, 50, 100|ig/mI月 농도로 첨가하여 cspase-3의 활성을 측정한 결과 농도 의존적으로 그 활성이 증가되는 것을 알 수 있었다. 피자두 추출물 무 첨가 구를 1로 보았을 때 농도별로 각각 5.
- 세포주 기와 관련된 apoptosis 유도는 Sub G1 phase에서 전형적으로 나타나게 된다(25). MDA-MB-231 cells의 농도에 따른 세포 사멸 분석 결과 피자두 추출물을 100|丄g/mLg 농도로 처리하였을 때 세포사멸이 진행된 세포는 66.97%였고, 40(mg/mL에서는 83.91%, 800|ig/mL에서는 90.63%로 그 비율이 증가하였다(Fig. 4A). 시간별 세포 사멸은 피자두 추출물의 처리 6시간 후, 세포사멸이 진행된 세포는 78.
- Hep G2에 대한 피자두 추출물의 성장 저해 효과를 살펴본 결과(Table 3), 피자두 1의 추출물은 1 mg/mL의 농도에서 77%의 비교적 높은 저해 효과를 보였으며, 2mg/mL의 농도에서도 87%의 높은 저해 효과를 보였다. 그리고 피자 두 2, 3의 추출물의 경우는 2m%mL 이상의 농도에서 85% 정도의 저해 효과를, 피자두 4의 추출물은 24mg/mL의 농도에서 7079%의 저해 효과를 보였으나, 피자두 5-8의 추출물은 가장 높은 농도인 4mg/mL에서도 55-72% 정도의 비교적 낮은 생육 저해 효과를 보였다. 따라서 피자두 추출물 중 미숙과에서 간암 세포에 대한 높은 생육 저해 효과를 보였고, 피자두가 성숙될수록 저해 효과가 감소됨을 확인하였다.
- 피자두 2, 3, 4에서는 2mg/mL의 농도에서 90-96%의 높은 저해 효과를 확인하였고, 4mg/mL의 농도에서는 성숙과인 피자두 8을 제외한 모든 시료에서 90% 이상의 높은 생육 저해 효과를 보였다. 따라서 다른 암세포주 에 비해 호르몬 비의존성 유방암세포인 MDA-MB-231에 대한 피자두 추출물의 성장 저해 효과가 가장 높음을 알 수 있었다.
- 과일이 숙성될 때는 starch의 가수분해, chlorophyU 형질전환에 관여하는 chloroplasts가 chromoplasts로의 전환, carotenoid, anthocyanin 및 phenolic 화합물의 생성, 그리고 휘발성 화합물 등이 형성된다(18, 19). 따라서 성숙과는 미숙과에 비해 각종 유 기산 및 안토시안계 색소들이 많이 함유(20)되어 있어 미숙과에 비해 암세포 성장 저해 효과가 더 높을 것으로 생각되었으나, 오히려 성숙과의 암세포 성장 저해 효과가 감소되었다. 이는 암세포 성장 억제 효과를 가지는 페놀 화합물의 경우, 자두류의 미숙과가 완숙 과로 숙도가 진행됨에 따라 총 페놀 함량과 총산 함량이 점차 감소된다는 보고(21, 22)와 관련되는 것으로 보여진다.
- 그리고 피자 두 2, 3의 추출물의 경우는 2m%mL 이상의 농도에서 85% 정도의 저해 효과를, 피자두 4의 추출물은 24mg/mL의 농도에서 7079%의 저해 효과를 보였으나, 피자두 5-8의 추출물은 가장 높은 농도인 4mg/mL에서도 55-72% 정도의 비교적 낮은 생육 저해 효과를 보였다. 따라서 피자두 추출물 중 미숙과에서 간암 세포에 대한 높은 생육 저해 효과를 보였고, 피자두가 성숙될수록 저해 효과가 감소됨을 확인하였다.
- 따라서 피자두의 미숙과 추출물은 apoptosis를 유도하는 유전자인 Bcl-2 family에 영향을 미치는 것으로 보여지며, 순차적으 로 capase-3 활성을 촉진시켜 호르몬 비의 존성 유방암 MDA- MB-231 세포주의 apoptosis의 유도에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 앞으로 이들 활성 성분들의 규명과 인체실험과 더불어 피자두 미숙과에 대한 독성평가가 병행된다면 항암과 관련된 기능성 식품과 치료제 등의 개발에 있어 천연소재로서 피 자두 미숙과의 유용성을 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
- 4A). 시간별 세포 사멸은 피자두 추출물의 처리 6시간 후, 세포사멸이 진행된 세포는 78.91%이며, 24시간, 48시간에 각각 85.71%, 91.19%의 비율로 높게 나타났다(Fig. 4B). Nakagama 둥(26)은 genistein의 MDA-MB-231 세포주에 대한 apoptosis 유도를 보고하였고, 강 등(27)은 인삼추출물을 2mg/mL의 농도로 처리했을 때 세포주에서 76.
- 2와 같다. 시료 무 첨가 구에서는 역시 세포 수가 LOX]/ cells에서 1.5X106 cells로 증가하였으나 피자두 추출물 처리 구에서는 6시간이 지난 후 생존 세포 수는 절반가량 감소하는 현상을 보였고, 48시간이 지난 후 세포는 거의 사멸하였다.
- 위암 세포주인 Kato HI에 대한 피자두 추출물의 생육 저해 효과를 살펴본 결과(Table 3), 피자두 1의 추출물은 2mg/mL의 농도에서 80% 이상의 저해율을 보였고 최고 농도인 4 mg/ mL에서 피자두 1-4의 추출물은 76-91%의 저해 효과를 보였으나 피자두 성숙과의 경우는 비교적 낮은 저해 효과를 보였다.
- 5와 같이 apoptosis를 유도하는 Bax의 단백질 발현은 농도에 비례하여 증가한 반면 apoptosis를 억제하는 Bcl-2 단백질은 농도에 비례하여 발현이 감소하였다. 이 결과 Bax 단백질 발현의 증가와 Bcl-2 단백질 발현의 감소는 피자두 추출물이 apoptosis를 유도함을 확인할 수 있었다.
- 6%의 세포사멸이 일어났음을 보고하였다. 이와 비교했을 때 피자두의 미숙과 추출물은 MDA- MB-231 유방암 세포에 대해서 높은 apoptosis 유도 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.
- 인간 유래의 간암 세포 Hep G2와 위암 세포 Kato DI, 자궁경 부암세포 Hela, 백 혈암 세포인 U937 및 호르몬 의존성 유방암 세포인 MCF 7, 호르몬 비의존성 유방암세포인 MDA-MB-231에 대한 피자두 추출물의 성장 저해 효과를 살펴본 결과, 피자 두 추출물은 농도 의존적으로 모든 암세포 주에 대해 성장 저 해 효과를 보였으며 특히 미숙과 추출물에서 높은 성장 저해 효과를 보였다. Hep G2에 대한 피자두 추출물의 성장 저해 효과를 살펴본 결과(Table 3), 피자두 1의 추출물은 1 mg/mL의 농도에서 77%의 비교적 높은 저해 효과를 보였으며, 2mg/mL의 농도에서도 87%의 높은 저해 효과를 보였다.
- 본 연구에서는 생육 시기별로 피자두를 수확한 후 피자두의 아세톤 추출물을 이용하여 인간 유래 간암, 위암, 자궁암, 백혈 암 및 유방암 세포주에 대한 세포독성효과를 조사하였고, 특히 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주를 사용하여 피자두의 유방암 세포의 세포주기에 미치는 영향과 세포사 관련 조절 단백질의 발현 양상을 분석함으로써 피자두의 유방암 억제 기전을 살펴보았다. 인간 유래의 암세포 주를 이용하여 피자두 추출물의 성장 저해 효과를 측정한 결과, 농도 의존적으로 모든 암 세포주에 대해 성장 저해 효과를 보였으며, 특히 피자두 14의 미숙과 추출물에서 높은 성장 저해 효과를 보였다. 특히 호르몬 비의존성 유방암세포인 MDA-MB-231에 대한 피자두 추출물의 성장 저해 효과는 4mg/mL의 농도의 모든 추출물에서 높은 효과를 보였으며, 피자두 1의 추출물에서는 97%의 높은 성장 저해 효과를 보였다.
- 자궁암 세포주인 Hela에 대한 피자두 추출물의 생육 저해 효과를 살펴보면(Table 3) 피자두 1의 추출물은 l-4m以mL의 농도에서 69-76% 정도의 비교적 낮은 저해 효과를 보였고 나머지 다른 추출물은 4mg/mL의 농도에서 약 18-76% 정도의 낮은 저해 효과를 보였으며, 백혈암 세포인 U937에 대해서는 피 자두 1의 추출물이 l-4mg/mL의 농도에서 65-89%의 생육 저 해 효과를 보여 자궁암 세포주에 비해 높은 생육 저해 효과를 보였으나 간암 및 위암 세포주에 비해 낮은 생육 저해 효과를 나타내었다(Table 4).
- 이때 가장 먼저 채취한 미숙 피자두를 피자두 1이라 명명하였고, 마지막에 채취한 완숙 피자두를 피자두 8이라 명명하였다. 최종 수확 204)일 전까지의 녹색을 띄는 피자두 14의 경우는 미숙과로, 최종 수확 2040일 전까지의 녹색/붉은색의 피자두 5-6은 중간숙과, 최종 수확 0-10일 전까지의 붉은색 피자두 7-8의 경우는 완숙 과로 구분하였다.
- 인간 유래의 암세포 주를 이용하여 피자두 추출물의 성장 저해 효과를 측정한 결과, 농도 의존적으로 모든 암 세포주에 대해 성장 저해 효과를 보였으며, 특히 피자두 14의 미숙과 추출물에서 높은 성장 저해 효과를 보였다. 특히 호르몬 비의존성 유방암세포인 MDA-MB-231에 대한 피자두 추출물의 성장 저해 효과는 4mg/mL의 농도의 모든 추출물에서 높은 효과를 보였으며, 피자두 1의 추출물에서는 97%의 높은 성장 저해 효과를 보였다. MDA-MB-231 세포주에 피자두 미숙과 추출물을 처리했을 때 apoptosis를 유도하는 유전자인 Bcl- 2 family에 영향을 미치는 것으로 보여지며, 순차적으로 capase- 3 활성이 촉진되고, 이것에 의해 apoptosis가 유도되는 것으로 생각된다.
- 호르몬 의존성 유방암 세포인 MCF-7에 대한 피자두 추출물의 저해 효과(Table 4)는 4mg/mLe 농도에서도 미숙과인 피자 두 14의 경우에만 65% 정도의 저해율을 보였고 다른 추출물의 경우는 호르몬 의존성 유방암 세포주에 대한 저해 효과를 보이지 않았다’ 그러나 호르몬 비의존성 유방암 세포인 MDA- 桐-231에 대해서는 피자두 1의 추출물의 경우 Img/mL 농도에서 89%의 높은 저해율을 보였고 4mg/mL 농도에서는 97%의 저해 효과를 보여 모든 암세포주 중에서 가장 높은 생육 저해 효과를 나타내었다(Table 4). 피자두 2, 3, 4에서는 2mg/mL의 농도에서 90-96%의 높은 저해 효과를 확인하였고, 4mg/mL의 농도에서는 성숙과인 피자두 8을 제외한 모든 시료에서 90% 이상의 높은 생육 저해 효과를 보였다. 따라서 다른 암세포주 에 비해 호르몬 비의존성 유방암세포인 MDA-MB-231에 대한 피자두 추출물의 성장 저해 효과가 가장 높음을 알 수 있었다.
- 진행된 과정에서 두드러진 특징은 핵의 분할 및 세포질의 위축으로 apoptotic body가 생기고 마지막으로 대식세포에 함입된다고 한다(24). 피자두 추출물 무 첨가 구의 세포와 추출물을 첨가한 세포를 위상차 현미경으로 관찰한 결과 대조군의 세포핵은 둥글고 완전한 반면 시료를 처리하여 DAPI로 형광 염색한 세포핵의 모양은 위축되었거나 부정형으로 바뀌었고 전형적인 apoptosis 세포의 특징인 세포막의 수포화 현상을 보였다(Fig. 3).
- 5와 같다. 피자두의 추출물을 다양한 농도로 처리한 결과 Fig. 5와 같이 apoptosis를 유도하는 Bax의 단백질 발현은 농도에 비례하여 증가한 반면 apoptosis를 억제하는 Bcl-2 단백질은 농도에 비례하여 발현이 감소하였다. 이 결과 Bax 단백질 발현의 증가와 Bcl-2 단백질 발현의 감소는 피자두 추출물이 apoptosis를 유도함을 확인할 수 있었다.
- 호르몬 의존성 유방암 세포인 MCF-7에 대한 피자두 추출물의 저해 효과(Table 4)는 4mg/mLe 농도에서도 미숙과인 피자 두 14의 경우에만 65% 정도의 저해율을 보였고 다른 추출물의 경우는 호르몬 의존성 유방암 세포주에 대한 저해 효과를 보이지 않았다’ 그러나 호르몬 비의존성 유방암 세포인 MDA- 桐-231에 대해서는 피자두 1의 추출물의 경우 Img/mL 농도에서 89%의 높은 저해율을 보였고 4mg/mL 농도에서는 97%의 저해 효과를 보여 모든 암세포주 중에서 가장 높은 생육 저해 효과를 나타내었다(Table 4). 피자두 2, 3, 4에서는 2mg/mL의 농도에서 90-96%의 높은 저해 효과를 확인하였고, 4mg/mL의 농도에서는 성숙과인 피자두 8을 제외한 모든 시료에서 90% 이상의 높은 생육 저해 효과를 보였다.
후속연구
- 따라서 피자두의 미숙과 추출물은 apoptosis를 유도하는 유전자인 Bcl-2 family에 영향을 미치는 것으로 보여지며, 순차적으 로 capase-3 활성을 촉진시켜 호르몬 비의 존성 유방암 MDA- MB-231 세포주의 apoptosis의 유도에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 앞으로 이들 활성 성분들의 규명과 인체실험과 더불어 피자두 미숙과에 대한 독성평가가 병행된다면 항암과 관련된 기능성 식품과 치료제 등의 개발에 있어 천연소재로서 피 자두 미숙과의 유용성을 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
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