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문제 정의
- , 2002). 이들 보고에 따라 활성이 큰 뽕나무버섯(Kim and Kim, 1999)과 할니송이 버섯(Kim and Kim, 2001), 쓴송이버섯(Kim, 2002)으로 부터 혈전용해효소를 분리 정제하고 그 특성을 발표하였 으며, 본 연구에서는 혈전 용해능이 큰 버섯으룬 알려진 민자주방망이버섯으로부터 혈전 용해 효소를 분리 정제하 고 그 특성을 연구하여 결과를 발표하고자 한다. 민자주 방망이버섯은 우리나라를 포함한 북반구 일대와 호주 등 에 분포하며 늦가을부터 초겨울에 걸쳐 잡목림이나 죽립 내 땅위에 나며 균륜을 만들며 맛과 향이 뛰어나 구미나 중국 등지에서 식용으로 널리 이용되고 있으며, 항종양 작용도 높은 것으로 알려져 있다.
제안 방법
- 5)를 사용하였고 기질로 N-Suc-Ala-Ala-Pro- Phe pNA을 사용하여 狞(3에서 혈전용해 효소와 반응하 는 가수분해 활성을 조사하였다. 즉 3mM의 기질 50剧 에 해당하는 buffer 925 "와 효소 25 雌 넣고 섞은 후 405 nm에서 홉광도 변화를 측정하였다.
- Fibrin plate 바버을 이용하여 온도 변화에 따른 효소의 활성도 변화를 측정하였디-, 에서 7研2까지 내양기의 온도를 변화시키며 효소를 점적한 plate을 넣고 3시간 후에 plate의 용해며적을 측징하여 효■순의 활성을 비교하였다.
- Haverkata-Trass의 fibrin plate법 (Haverkate and Tr기as, 1974)에 따라 2% gelatin용액에 녹인 0, 7%(w/v) fibrinogen 용액 10诚와 0.05 M barbital 완충용액(pH 7, 5)에 녹인 thrombin(100 NIH units) 50圍을 잘 섞은 후 이를 petri dish에 부어 fibrin막을 만들었다. 효소 용액을 20以씩 fibrin plate 위에 점적한 후 3甘。게서 8시간 방치하였다.
- 모든 정제 과정은 4°C에서 수행하였으며 정제 과정마다 혈전용해능과 단백질 농도를 측정하였다. 채집한 버섯을 20 mM Tris-HCl 왼충용액 (pH 8.
- 민자주방망이버섯으로부터 3 단계를 거처 혈전용해 효 소를 분리 정제히였다(Tahle I). 효全용액을 DEAE- celluiose관에 주입한 결과 활성을 갔는 대부분의 효소는 관에 붙지 않고 흘러 나왔다(Fig.
- 분리한 단백질의 순도와 분자량은 전기영동을 실시하여 결성하였으며 전기영동은 4.5%의 stacking gel과 12%의 separating ge로 이루어진 SDS-PAGE를 사용하였다. G시 은 Coomassie brilliant blue R-250로 염섹하였으며, 표준 단백질로는 phosphorylase b(94kDa), bovine serum albumin(BSA)(67 KDa), ovalbumin(43 KDa), carbonic anhydrase(30 KDa), soybean trypsin inhibitor(20, l K.
- 정제한 효소의 홮싱에 대한 금속 이온의 영향과 효소 저해제의 영향을 알아보기 위하여 2mM의 CaCk CoCL ZnCl2, CuSO4, MgCJ FeCI:, Hg(:l21 F.DTA, ], lO-phen- anthr이ine과 단백질 拦해효소 서해제인 PMSF(phenyl methyl sulfonyl fluoride), E-64와 0.4rr】M의 Pepstain A 를 같은 부피의 혈전용해효소 용액과 섞은 후 Hbrin plate 에 점적 하고 36% 배양기에서 &시간 후 용해되 면적을 측정하여 활성을 비교하였다.
- 효소에 의해 fibrin막이 용해되면 용해면적을 측정하여 상 대적인 활성을 측정하였다. 표준대조구로는 plasmin을 사 용하고 plasmin몰 연속적으로 희석하여 얻은 표준곡선에 따라 활성을 계산하였다.
- 활성 부분을 모아 PM 10 막을 사용하는 ultrafiltration (Amicon : a Grace company, Beverly, 니.S.A)에 의해 농 축시키고 이를 1.4 M ammonium sultateS 포함하는 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 완충 용액으로 포화된 Phenyl Sepharose column(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden; HiTrap Phenyl FF: 1 祖)에 흘려 보낸 후 1.4〜0M ammonium sulfate의 농도 기울기로 홀려주 고 활성부분은 모아 20 mM sodium phosphate 완충액 (pH 6.0)에 투석시킨 후 동일한 완충 용액으로 미리 평형 시킨 fast protein liquid chromatography(FPLC : Water corporation, Milford, U.S A)의 Mono S column(5.0X 100 mm)에 주입하였다. 이를 완충 용액 3 湖로 씻어 준 후 0-0.
- 효소 용액을 20以씩 fibrin plate 위에 점적한 후 3甘。게서 8시간 방치하였다. 효소에 의해 fibrin막이 용해되면 용해면적을 측정하여 상 대적인 활성을 측정하였다. 표준대조구로는 plasmin을 사 용하고 plasmin몰 연속적으로 희석하여 얻은 표준곡선에 따라 활성을 계산하였다.
- 효소의 활성에 미치는 pH의 영향은 완충용익으로 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 5.0〜7.5), 0-1 M Tris-HCl buffer(pH 8.0-9.5), 0.1 M carbonate-bicarbonate buffer (pH 10시0.5)를 사용하였고 기질로 N-Suc-Ala-Ala-Pro- Phe pNA을 사용하여 狞(3에서 혈전용해 효소와 반응하 는 가수분해 활성을 조사하였다. 즉 3mM의 기질 50剧 에 해당하는 buffer 925 "와 효소 25 雌 넣고 섞은 후 405 nm에서 홉광도 변화를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 버섯시료는 2。。4년 9월 오대산에서 채집하여 분류동정 후 시료로 사용하었다. 시약으로 사용 한 fibrinogen, plasmin(P 4895, 3 units), thrombin, bovine serum albumin, agarose, glycine, Sephadex (3-150오" protease inhibitor는 Sigma(St. Lousis, MO, U.S.A.) 제품 을, DEAE-cellulose는 Whatman(Maidstone England) 제 품올, LMW Electrophoresis calibration Kit는 Phamiacia (Little Chalfont Buckinghamshire, England) 제품을 사용 하였다.
- 본 실험에 사용한 버섯시료는 2。。4년 9월 오대산에서 채집하여 분류동정 후 시료로 사용하었다. 시약으로 사용 한 fibrinogen, plasmin(P 4895, 3 units), thrombin, bovine serum albumin, agarose, glycine, Sephadex (3-150오" protease inhibitor는 Sigma(St.
이론/모형
- 분리된 효소의 amino acid sequencing은 기초과학지원 연구소(서울)에 precise protein sequencing system(Applied Biosystem Model procise-491)올 사용하여 수행되었다.
- 효소의 단백 질 정 량은 Lowry 등 (Lowry and Rosenbrough, 1951)의 방법에 의하여 측정하였으며 bovine serum albumin을 사용한 표준곡선에 의하여 환산하였다.
성능/효과
- 2) 이를 다시 FPLC의 Mono S columrr을 이용하여 분리 한 션고KFig. 3), 활성 부분의 SDS-PAGE는 분자량이 30.1 K Da으로 단일 띠를 나타냈다(Fig. 4). 최종 단계에서 분 리힌 효소의 비활성은 22.
- 기질로 N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe pNA을 이용하여 pH 변화에 따른 효소 활성을 조사한 결과 Fig. 5와 같이 pH 7.0에서 9一5까지 넓은 범위에서 높은 활성을 보여 주는 alkaline protease로 나타났다. 뽕나무버섯(Kim and Kim, 1999>은 pH 7.
- 이와 같은 조건을 갖고 있는 것이 민자 주방망이버섯이디-, 이 버섯은 맛과 향이 뛰어나 식용으루 도 널리 이용되고 있으녀 항암 효과도 큰 것으로 알려 저 있匸卜一 또한 실험을 통해 활성이 놀은 혈전용해효소도 함 유 하고 있는 깃으로 밝혀졌다. 문리한 이 효소의 비활성 은 할미송이비섯으로부터 분리한 효소 보다는 석지만, 뽕 나무 버섯이나 쓴송이버섯으旦부터 분리한 효소 보다 크 고, 젓갈, 청국장으로부터 분리한 효소들 보다는 매우 큰 것을 알 수 있었다. 다른 버섯의 경우와 비교하면 할미송 이 버섯은 활성이 내우 크지반 약간의 독성을 갖고 있고 뽕나무 버섯의 경우 식용 가능하지만 야생에서 대량 재배 시에는 버섯 균사가 사물 기생과 더불어 활물 기생도 하모 로 다른 나무에 피헤를 줄 수도 있디-.
- p data-page="1">버섯들이 가지고 있는 영양 싱분 중에는 건물 중 47〜 83%가 탄수화물이고, 17〜35%이 단백질로 유류보다는 낮 지만 다른 식품에 비해 함량이 높은 편으로 특히 9가지의 필 수 아미노산이 풍부하며, 1.1 〜8.3%의 지방을 포함하지 만 특히 지방산 중 우리 생활에 필수적인 불포화 지방산 의 비율이 포화 지방산 보다 훨씬 높다, 이런 이유로 지금 까지 버섯은 주로 식용으로 사용되어 왔으나 근래에는 의 약용으로 크게 활용되기 시작하였다, 특히 치료용으로 효 용가치가 높게 평기되기 시작한 것은 동물실힘과 함께 임 상증례를 발표함에 따마 더 이용가치가 있음을 증명하기 에 이르렀다. 이 의용비싯은 균주를 배양함으로서 대랑 생산체제를 이룩할 수 있고 식용이나 의료용으로 장기간 복용하였을 때에 부작용이 거의 나타나지 않아서 다른 장 기에 손상을 주지 않는 이점이 있다.
후속연구
- 혈전용해 활성이 큰 민자주방망이버섯은 식용 가능하여 식품으로 이용할 수 있을뿐디러 새■己운 혈전 용해제의 재료로 시용할 수노 있 다. 따라서 대량 재배가 가능할 경우 식용 뿐 아니라 약용 으로의 사용가능성두 커 소비가 증대 할 것으로 기대된다.
- 됨 수 있다. 이와 갇 이 혈전용해물질을 함유한 버섯을 식품으로 사용하여 항 시 섭취 할 경우 혈전치료 食과와 더불어 예방 효과도 클 것으로 기대된다. 이와 같은 조건을 갖고 있는 것이 민자 주방망이버섯이디-, 이 버섯은 맛과 향이 뛰어나 식용으루 도 널리 이용되고 있으녀 항암 효과도 큰 것으로 알려 저 있匸卜一 또한 실험을 통해 활성이 놀은 혈전용해효소도 함 유 하고 있는 깃으로 밝혀졌다.
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