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문제 정의
- 동정하여 보고한 바 있다(17). 본 논문에서는 그 후속연구로서 신선초의 항산화활성물질의 탐색에 관한 일 련의 실험이 진행되어 열수추출물의 동일 획분(ethyl acetate 가 용 중성획분)으로부터 활성물질 2종이 추가로 구명되었기에 그 내용을 보고하고자 한다.
제안 방법
- FAB-MS 분석은 Tandem Mass Spectrometer(JMS-HX/HX 110A, Jeol, Japan)를 사용하였으며, matrix 시약으로 metanitrobenzyl alcohol(NBA)을 사용하였다.
- HPLC에 의한 정제는 gBondapak ODS colurnn(7.8X300mm,10)im, Waters, USA)을 이용하여 4.0 mL/min(Model 510 solvent deliveiy system, Waters)의 유속으로 행하였다. Sephadex LH-20 column chromatography에 의해 정제한 50% MeOH 획 분은 254 nm의 검출파장(Model 486 tunable absorbance detector, Waters, USA)에서 35% MeOH(pH 2.
- Lu 등(18)의 방법에 의해 Sephadex LH-20(70-230 mesh, Pharmacia, Sweden)을 MeOH/H2O(l : 9, v/v)로 상온에서 24시간 동안 팽윤화시킨 다음, 같은 용매로 column(3.7X21 cm)에 충진 시킨 후, MeOH 농도를 10-100%까지 10%씩(각 단계별 150 mL) 증가시키는 step-wise 용출 방법으로 분획하였다.
- 신선초 열수추출물의 EtOAc 가용 획분들의 항산화활성은 a-tocopherol의 활성에 비해 약간 낮은 활성을 보였으나, 그들 획분들이 혼합물 상태임 을 고려하였을 때, 그들 각 획분들에 잠재성 있는 항산화화합 물이 함유되어 있을 가능성이 높게 시사되었다. 따라서 분리된 두 획분 중 보다 활성이 높은 EtOAc 가용 중성획분을 대상으로 항산화 활성물질의 단리를 시도하였다.
- 그래서 동일조건의HPLC에 의해 반복 . 분취하여 화합물 1(4 23.94분, 1.6 mg, 황 색분말)과 화합물 2(4 25.44분, 2.2 mg, 황색분말)를 각각 단리 하였다.
- 3 mL를 시험관에 넣고, vortex mixer로 가볍게 혼합한 다음, 암소에서 30분간 반응시킨 후, 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교구로 천연항산화제인 a-tocopherol(Sigma, MO, USA)을 이용하였으며, DPPH radical0] 50% scavenging되어진 농도를, SC50(50% scavenging con- centration)으로 나타냈다.
- 신선초 지상부 건조분말(2.5 kg)을 열수(90℃, 30분, 50 L)로 추출한 후, 여과하여 얻어진 여액(16L)을 5% NaHCOa를 이용하여 pH 8.0으로 조정한 다음, ethyl acetate(EtOAc, 18.7 LX 3)로 분배하여 EtOAc 가용 중성 획분(EtOAc-soluble neutral frac- tion)과 수용성 산성획분(aqeous-acidic fraction)로 분획하였다. 이 수용성 산성획분에 LON HCl 을 가하여 pH 3.
- 7 LX 3)로 분배하여 EtOAc 가용 중성 획분(EtOAc-soluble neutral frac- tion)과 수용성 산성획분(aqeous-acidic fraction)로 분획하였다. 이 수용성 산성획분에 LON HCl 을 가하여 pH 3.0으로 조절한 후, 다시 EtOAc(13LX3)로 분배하여 EtOAc 가용 산성획분 (EtOAc-soluble acidic fraction)^ 수용성 획분 (aqeous fiaction)으로 분획하였다.
- 이상의 부분구조를 종합 해 볼 때, 화합물 1은 hetero환 구조를 갖는 fiicocoumarin일 가능성이 강하게 시사되었다. 이 화합물의 보다 정확한 구조해석을 위해 2D-NMR 분석을 행하여 각 proton과 carbon 간의 상 호관계를 분석하였다. 특호〕, HMBC spectrum (Fig.
- 8 mg)에서 항산화활성이 나타났다. 이를 대상으로 fiBondapak ODS column에 의한 HPLC (35% MeOH, 254 nm)분석을 행한 결과, retention time(/^)23.94분 및 25.44분에서 peak가 검출되어 그들 각 peak의 화합 물들을 분취한 후 항산화활성을 검토하였다. 그 결과 2종 화합 물 모두로부터 항산화활성이 인정되었다.
- 9)까지총 12종의 signal들이 검출되었다. 이어, 보다 정확한 구조해석을 위해 HMBC 분석을 행하였다. 화합물 2의 각 proton 및 carbon 간에 관찰된 HMBC spectrum 상의 주요 상관관계를 Fig.
- 정제된 활성물질의 구조해석을 위해 'H-nuclear magnetic res- onance(1H-NMR, 500 MHz), l3C-NMR(125 MHz), two-dimensional NMR(2D-NMR), 그리고 FAB-MS(fest-atom bombardment mass spectrometer)의 기기분석을 실시하였다.
- 활성 물질의 1H-NMR, 13C-NMR 및 2D-NMR spectra는 Fou- riertransfomnuclear magnetic resonance(FT-NMR) 기기 (500 MHz, uni, INOV4 500, Varian, Walnut Creek, CA, USA)에 의해 분석하였으며, 용매는 CDQD를, 그리고 내부표준물질은 사용용매 를 기준점으로 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 신선초(Angelica keiskei Koidz)는 제주도에서 재 배된 것으로 지상부를 TOP에서 6시간 급속동결(10-10-3 torr) 하여 햄머밀 방식에 의해 분말화한 것을 (주)샬롬으로부터 제 공받아 시료로 사용하였다.
- 신선초 지상부 건조분말(2.5 kg)을 열수로 추출한 후, 여과하여 얻어진 상등액을 EtOAc로 용매분획하여 EtOAc 가용 산성 획분(12.5 g)과 EtOAc 가용 중성획분(2.4아을 얻었다. 이들 각 획분을 대상으로 DPPH radical-scavenging 활성을 검정한 결과, 50%의 DPPH radical-scavenging 농도(SC50)는 EtOAc 가용 산성 획분이 21 (ig/mL, EtOAc 가용 중성획분이 18㎍/mL, 그리고 a-tocopherole 8.
이론/모형
- Moon 등(19)의 방법에 따라 DPPH(l, l-diphenyl-2-picryl- hydrazyl, Sigma, St. Louis, MO, USA) EtOH 용액 (100 μM)2.7ml/] 추출물이 함유된 시료용액 0.3 mL를 시험관에 넣고, vortex mixer로 가볍게 혼합한 다음, 암소에서 30분간 반응시킨 후, 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교구로 천연항산화제인 a-tocopherol(Sigma, MO, USA)을 이용하였으며, DPPH radical0] 50% scavenging되어진 농도를, SC50(50% scavenging con- centration)으로 나타냈다.
- Takao 등(20)의 방법에 의해 정제된 획분이나 단리된 물질을 TLC(thin-layer chromatograph) plate에 spotting하여 적절한 용매계로 전개한 후, DPPH ethanol 용액 (200)iM)을 plate에 분무하여 보라색이 탈색되어진 획분이나 물질을 항산화활성의 양성으로 판정하였다(TLC-DPPH 법).
성능/효과
- 화합물 1의 FABMS(positive) spectrum에서 [* M+H] 187 및 [M+Na]+ 209의 pseudomolecular ion이 검출되어 이 화합물의 분자량이 186임을 알 수 있었다. 13C-NMR spectrum에서 1종의carboxylic carbon(5 162.9, C-2) 및 10종의 sp2 carbon(8 159.1-104.7)을 포함한 총 11종의 carbon signal0] 관찰되어 화합물 1은 11종의 탄소로 구성된 화합물임을 알 수 있었다. 1H-NMR spectrum에서는 8 8.
- 1에 나타냈다. 6 7.53의 proton(H-5)과 5 108.1의 carbon (C-3') 간의 상관관계로부터 ftiran 환이 coumarin의 6, 7위에 결 합되어 있음을 알 수 있었고, 특히 5 7.87의 proton(lH, d, J=2.0 Hz, H-2)으로부터 5 149.2의 carbon(C-7) 간에 관찰된 cross peak로부터 Z위와 7위의 탄소 간에 에테르(oxy)결합이 형성된 psoralen 구조를 취하고 있음을 확인할 수 있었다. 또한methoxyl기의 proton(5 4.
- 44분에서 peak가 검출되어 그들 각 peak의 화합 물들을 분취한 후 항산화활성을 검토하였다. 그 결과 2종 화합 물 모두로부터 항산화활성이 인정되었다. 그래서 동일조건의HPLC에 의해 반복 .
- 36)이 검출되었다. 그리고 methoxyl기와 benzene 환에 결합된 1H 분의 sp2 탄소 proton(8 7.53, s, H-5) 및 고자장으로 shift된 86.94(1H, d, J =2.0 Hz, H-3)의 proton을 제외하고는 화합물 1의 spectrum과 매우 유사한 경향을 보여, 화합물 2는 benzene 환에 methoxyl기가 결합된 fiicocoumarin일 가능성이 시사되었다. 13C-NMR 및 HSQC spectra로부터 1종의 carboxylic carbon (5 162.
- 3의 carbon(C-4a) 간에 상관관계가 관찰되어 coumarin의 benzene ring에 결합된 인접 proton들의 위치(3, 4위와 5, 6위)가 결정되었다. 또한, 8 7.55(H-5)와 7.90(H2)의 proton으로부터 6 118.0의 carbon(C-7)에, 그리고 6 7.51(H-6), 7.90(H-2') 및7.15의 proton(H-3#)로부터 8 159.1의 carbon (C-8) signal에 각각 cross peak가 검출되어 furan환은 coumarin의 7, 8위에 결합 되어 있음을 알 수 있었으며, 특히 2, 위와 8위 간에 에테르(oxy) 결합이 형성된 구조임을 알 수 있었다. 이상의 기기분석 결과 로부터 화합물 1은 pseudoisopsoralen으로 구조해석되었다.
- 또한 8-methoxypsoralene 신선초 뿌리(28>와 열매(11)에서 동정된 바 있으나 신선초 잎에서는 처 음으로 동정되었으며, pseudoisopsoralen이 신선초로부터 동정되 어진 것 또한 처음으로 생각된다. 본 연구로부터 pseudoisopso- ralen과 8-methoxypsoralene 시료의 건조중량 100 g 당 각각 64㎍ 및 88 ㎍의 단리 량을 보였으나 정제과정 중의 손실 등을 고 려하였을 때 그들의 실제 함량은 단리되어진 양보다 훨씬 높 을 것으로 사료되어진다. 이들 2종의 화합물을 포함한 신선초 중에 함유된 다양한 생리활성물질들의 정량분석에 관한 이후 의 연구에 기대되어지는 바가 크다.
- )을 MeOHHHQ 용매 계 (MeOH 함량을 10%씩 증가, step- wise 용줄)로 Sephadex LH-20 column chromatography에 의해용출 . 분획하여 TLC-DPPH법을 이용하여 항산화활성을 검정 한 결과, 50% MeOH 획분(221.8 mg)에서 항산화활성이 나타났다. 이를 대상으로 fiBondapak ODS column에 의한 HPLC (35% MeOH, 254 nm)분석을 행한 결과, retention time(/^)23.
- 0 ㎍/mL으로 나타났다. 신선초 열수추출물의 EtOAc 가용 획분들의 항산화활성은 a-tocopherol의 활성에 비해 약간 낮은 활성을 보였으나, 그들 획분들이 혼합물 상태임 을 고려하였을 때, 그들 각 획분들에 잠재성 있는 항산화화합 물이 함유되어 있을 가능성이 높게 시사되었다. 따라서 분리된 두 획분 중 보다 활성이 높은 EtOAc 가용 중성획분을 대상으로 항산화 활성물질의 단리를 시도하였다.
- 40의 6H분에 상당하는 sp2 탄소 proton이 검출되었다. 이 중 6 7.55(H-5)와 7.5 (H-6)에서 등가(#=8.5 Hz)로 나타난 각각 1H분의 proton signal들로부터 benzene환에 ortho ibrm의 proton이 존재함을 알 수 있었으며, 5 8.05(H-4)와6.40(H-3)에서 등가(#= 9.5 Hz)로 나타난 각 1H분의 proton들로 부터 cis form 의 olefinic double bond의 존재가 강하게 시사되었다. 또 6 7.
- 4아을 얻었다. 이들 각 획분을 대상으로 DPPH radical-scavenging 활성을 검정한 결과, 50%의 DPPH radical-scavenging 농도(SC50)는 EtOAc 가용 산성 획분이 21 (ig/mL, EtOAc 가용 중성획분이 18㎍/mL, 그리고 a-tocopherole 8.0 ㎍/mL으로 나타났다. 신선초 열수추출물의 EtOAc 가용 획분들의 항산화활성은 a-tocopherol의 활성에 비해 약간 낮은 활성을 보였으나, 그들 획분들이 혼합물 상태임 을 고려하였을 때, 그들 각 획분들에 잠재성 있는 항산화화합 물이 함유되어 있을 가능성이 높게 시사되었다.
- 1의 carbon (C-8) signal에 각각 cross peak가 검출되어 furan환은 coumarin의 7, 8위에 결합 되어 있음을 알 수 있었으며, 특히 2, 위와 8위 간에 에테르(oxy) 결합이 형성된 구조임을 알 수 있었다. 이상의 기기분석 결과 로부터 화합물 1은 pseudoisopsoralen으로 구조해석되었다.
- 9, C-2)을 경유하여 benzene 환에 a-pyrone환이 축합된 coumarin 계의 구조를 취하고 있음이 시사되었다. 이상의 부분구조를 종합 해 볼 때, 화합물 1은 hetero환 구조를 갖는 fiicocoumarin일 가능성이 강하게 시사되었다. 이 화합물의 보다 정확한 구조해석을 위해 2D-NMR 분석을 행하여 각 proton과 carbon 간의 상 호관계를 분석하였다.
- 0의 carbon(C-8) signal들 간에 cross peak가 검출되어 methoxyl기는 8위에 결합 되어져 있음이 확인되었다. 최종적으로 FABMS(positive) 분석을 행한 결과, [M+H]+ 207 및 [* M+Na] 239가 검출되어 분자 량이 206으로 확인되어 NMR 분석에 의해 구조해석된 화합물 의 분자량과 일치됨이 확인되었다. 따라서, 이상의 NMR 및FABMS 분석에 의해 화합물 2는 8-methoxypsoralen(xanthotoxin)으로 구조해석되었다.
- 이 화합물의 보다 정확한 구조해석을 위해 2D-NMR 분석을 행하여 각 proton과 carbon 간의 상 호관계를 분석하였다. 특호〕, HMBC spectrum (Fig. 1)에서 58.05의 proton(H-4)으로부터 6 125.6의 carbon (C-5) 간에, 그리고 6 6.40(H-3), 7.51(H-6) 및 7.55(H-5)의 각 proton으로부터 5115.3의 carbon(C-4a) 간에 상관관계가 관찰되어 coumarin의 benzene ring에 결합된 인접 proton들의 위치(3, 4위와 5, 6위)가 결정되었다. 또한, 8 7.
후속연구
- 본 연구로부터 pseudoisopso- ralen과 8-methoxypsoralene 시료의 건조중량 100 g 당 각각 64㎍ 및 88 ㎍의 단리 량을 보였으나 정제과정 중의 손실 등을 고 려하였을 때 그들의 실제 함량은 단리되어진 양보다 훨씬 높 을 것으로 사료되어진다. 이들 2종의 화합물을 포함한 신선초 중에 함유된 다양한 생리활성물질들의 정량분석에 관한 이후 의 연구에 기대되어지는 바가 크다. 특히 다양한 생리활성을 지닌 이들 화합물이 항산화활성물질로 단리되어진 것은 대단 히 흥미로운 결과라 생각되어지며, 그 활성발현기구의 해명 및 기존의 항산화제들과의 활성비교 또한 신선초의 기능성 평가 측면에서 상세히 검토되어져야 할 부분으로 판단된다.
- 이들 2종의 화합물을 포함한 신선초 중에 함유된 다양한 생리활성물질들의 정량분석에 관한 이후 의 연구에 기대되어지는 바가 크다. 특히 다양한 생리활성을 지닌 이들 화합물이 항산화활성물질로 단리되어진 것은 대단 히 흥미로운 결과라 생각되어지며, 그 활성발현기구의 해명 및 기존의 항산화제들과의 활성비교 또한 신선초의 기능성 평가 측면에서 상세히 검토되어져야 할 부분으로 판단된다.
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