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문제 정의
- 고 알려져 있다(Keith, 1975). 본 연구에서는 담배 의 흡연시 Cambridge filter pad를 통과한 가스상 성분들을 20 mL PBSfpH 7.4) 용액이 있는 gas-washing bottle에 포집한 GVP에 대해 세포 독성을 조사하였다. Fig.
- , 2003). 본 연구에서는 담배시료의 GVP에 대한 세포독성 결과를 자세하게 이해 하기 위해 CA 필터담배, carbon 필터담배 그리고 양절담배에 대한 가스상 성분들에 대하여 조사하였다. 각 담배를 5회 흡연한 후 acetaldehyde 외7종의 carbonyl 화합물, acrylonitrile 외 3종의 volatile 화합물 그리고 ammonia 및 HCN 등의 이행량을 분석하였다.
제안 방법
- CA 필터담배, carbon 필터담배 그리고 양절담배의 일정한 puff 수에 대한 연기일반성분에 대한 이행량을 비교하고자, puff 수 5로 연소시켜 TPM, tar, 및 nicotine등에 대한 이행량을 측정하였다. Table 1에서와 같이 CA 필터담배와 carbon 필터담배의 TPM, tar 그리고 nicotine등에 대한 이행량은 필터 특성과 관계없이 비슷한 값을 보여주고 있다.
- 본 연구에서는 담배시료의 GVP에 대한 세포독성 결과를 자세하게 이해 하기 위해 CA 필터담배, carbon 필터담배 그리고 양절담배에 대한 가스상 성분들에 대하여 조사하였다. 각 담배를 5회 흡연한 후 acetaldehyde 외7종의 carbonyl 화합물, acrylonitrile 외 3종의 volatile 화합물 그리고 ammonia 및 HCN 등의 이행량을 분석하였다. Fig.
- 담배연기 중 tar, 니코틴 분석은 ISO 3308에 준하여, 각각의 담배시료 20개피를 RM20 흡연장치를 이용하여 담배를 연소시키면서 92 mm Cambridge filter pad를 TPM을 포집하여 분석하였다. 연기응축물 중의 니코틴분석은 ISO 10315에 준하여 GC 분석을 실시하였다.
- 담배연기응축물 (CSC) 은 담배시료 10개피를 RM20/CS 흡연장치 (Heinr Borgwaldt, Germany) 를 이용하여 CORESTA 표준흡연조건 (puff volume: 35 mL, puff frequency : 60 sec, puff duration: 2 sec)하에서 puff 수 5회 연소시켜 생성된 담배연기를 44 mm Cambridge filter pad를 이용하여 포집하였다. DMSO 를 사용해서 Cambridge filter pad로부터 CSC를 추출하여 농도가 10 mg/mL이 되도록 한 후 -70℃에 보관하면서 시험에 사용하였다.
- 본 연구에서도 CHO-K1 세포를 이용한 neutral red uptake 법을 사용해서 CA 필터담 배, carbon 필터담배 그리고 양절담배로부터 제조된 CSC에 대한 세포독성을 측정 비교하였다. 담배주류연의 세포독성에 대한 담배필터의 영향을 조사하기 위하여 동일한 puff 수(5회)로 연소시켜 담배시료를 제조하였다. 세 종류 담배의 puff 횟수의 증가에 따라서 세포 생존율이 감소되었으며, 특히 양절담배에서 가장 급격하게 감소 되었다(Fig.
- 따라서 본 연구에서는 CA필터로 이루어진 표준담배 (Kentucky Reference Cigarette, 2R4F), CA필터를 탄소필터로 대치한 표준담배, 필터가 제거된 표준담배(양절담배) 등 3종의 시료의 담배 연기 응축물(CSC) 및 가스상 분획에 대한 세포독성 을 조사하였고, 담배 연기 성분들과의 상관성을 비교 평가하였다.
- 유기용매 용액(50%ethanol-l% acetic acid) 150 μl을 첨가해서 실온에서 15분간 neutral red 를 추출한 후 microplate reader(BIO~TEK, USA)를 사용해서 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 시험결과는 세포를 배양하지 않은 well 에서 측정된 흡광도에 대하여 보정하였으며, 흡광도는 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 생존율로 변환 하였다.
- CHO-K1 세포(2x104 cells)를 96 well plate(n=6)에 이식해서 24시간동안 배양한 후 시험물질을 처리하였다. 모든 실험에서 사용되는 대조군은 최고농도의 CSC에 첨가된 1%의 DMSO 또는 GVP에 첨가된 10%의 PBS 처리군으로 하였다. 시험물질의 처리 후 22 ±2시간 동안 5% FBS, penicillin 100 U/mL 와 streptomycin 100 μg/mL이 포함된 Ham, s F12 배양액에서 배양했으며, 세포배양이 끝나면 배양액을 제거한 후 150 μl의 neutral red 용액(40 μg/mL)을 처리하여 37℃에서 배양하였다.
- 본 연구는 필터종류에 따른 담배의 주류연 성분이 세포독성에 미치는 영향을 조사하기 위해, cellulose acetate(CA) 필터의 표준담배 (Kentucky Reference Cigarette, 2R4F), CA 필터를 carbon 필터로 대치한 표준담배, 필터가 제거 된 표준담배(양절담배) 등 3종의 시료를 사용하였다. 담배연기의 세포독성은 CH0-K1 세포주를 이용한 neutral red uptake법을 사용해서 측정하였다.
- , 2001). 본 연구에서도 CHO-K1 세포를 이용한 neutral red uptake 법을 사용해서 CA 필터담 배, carbon 필터담배 그리고 양절담배로부터 제조된 CSC에 대한 세포독성을 측정 비교하였다. 담배주류연의 세포독성에 대한 담배필터의 영향을 조사하기 위하여 동일한 puff 수(5회)로 연소시켜 담배시료를 제조하였다.
- 4) 용액이 있는 gas washing bottle에 포집하였다. 이와 같은 방법으로 5회 흡연한 담배연기로부터 제조한 GVP는 포집 후 2시간 내에 세포독성을 측정하였다.
- 본 연구에서 사용된 담배시료는 CA 필터가 부착된 표준담배 (Kentucky reference cigarette 2R4F)를 기준으로 해서, CA필터를 carbon dual 필터(탄소함량 : 2 mg/mm)로 대치한 담배와 필터가 제거된 양절담배를 각각 제조하였다. 필터담배는 공기희석율 0% 및 EPD 170 mmH/로 맞추어서 선별하였다. 제조된 3종류의 담배를 CORESTA 조건으로 설정되어있는 항온 항습실 (온도 22 ±2℃, 상대습도 60 ±5%)에서 48시간 조화시킨 후 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 Chinese hamster ovary (CH0-K1) 세포주는 한국세포주은행(KCLB)으로 부터 분양받아 사용하였으며, 세포주기는 14 ± 2 시간이다. CH0-K1 세포는 10% FBS, 100 U penicillin 100 u/rnL와 streptomycin 100 μg/mL이 포함된 Ham's Fl2 배양액을 사용하였다. 배양된 세포는 2~3일마다 0.
- Nutrient Mixture Ham's F-12 medium(Ham's F-12), fetal bovine serum(FBS), L-gluta- mine, penicillin/ streptomycin solution, phosphate- buffered saline(PBS) 등은 GIBCO(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다. Dimethysulfoxide (DMSO), mitomycin C(MMC), sodium dodecyl sulfat(SDS), colchicine, cyclophosphamide, nuetral red 등은 Sigma(St, Louis, USA) 제품을 사용하였다. 그 외의 유기용매들은 특급시약을 사용하였다.
- Nutrient Mixture Ham's F-12 medium(Ham's F-12), fetal bovine serum(FBS), L-gluta- mine, penicillin/ streptomycin solution, phosphate- buffered saline(PBS) 등은 GIBCO(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다. Dimethysulfoxide (DMSO), mitomycin C(MMC), sodium dodecyl sulfat(SDS), colchicine, cyclophosphamide, nuetral red 등은 Sigma(St, Louis, USA) 제품을 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 담배시료는 CA 필터가 부착된 표준담배 (Kentucky reference cigarette 2R4F)를 기준으로 해서, CA필터를 carbon dual 필터(탄소함량 : 2 mg/mm)로 대치한 담배와 필터가 제거된 양절담배를 각각 제조하였다. 필터담배는 공기희석율 0% 및 EPD 170 mmH/로 맞추어서 선별하였다.
- 03% EDTA 용액을 이용하여 계대 유지하였다. 세포주의 자연발생적 돌연변이 생성을 최소화하고자 구입 후부터 18번 미만으로 계대 배양한 세포만을 실험에 사용하였다. 배양은 CO2 배양기 (VISION, Korea)# 이용하여 포화습도하에서 37℃, 5% CO2 상태로 배양하였다.
- 실험에 사용한 Chinese hamster ovary (CH0-K1) 세포주는 한국세포주은행(KCLB)으로 부터 분양받아 사용하였으며, 세포주기는 14 ± 2 시간이다. CH0-K1 세포는 10% FBS, 100 U penicillin 100 u/rnL와 streptomycin 100 μg/mL이 포함된 Ham's Fl2 배양액을 사용하였다.
- 필터담배는 공기희석율 0% 및 EPD 170 mmH/로 맞추어서 선별하였다. 제조된 3종류의 담배를 CORESTA 조건으로 설정되어있는 항온 항습실 (온도 22 ±2℃, 상대습도 60 ±5%)에서 48시간 조화시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 세포독성 결과의 모든 ECso 측정값은 CSC/mL 또는 puff/L로 환산해서 표준편차와 함께 표시하였다. SPSS(version 10.0) 통계프로그램을 이용하여 one way ANOVA test를 실시하였다. 사후분석으로는 Duncan test 를 통해서 p<0.
- 0) 통계프로그램을 이용하여 one way ANOVA test를 실시하였다. 사후분석으로는 Duncan test 를 통해서 p<0.05의 수준에서 각 시험군과의 유의성을 검정하였다.
- ECso 값은 대조군에 비하여 50%의 생존율을 나타내는 시료의 농도이며, 용량-반응식을 이용하여 값을 구하였다. 세포독성 결과의 모든 ECso 측정값은 CSC/mL 또는 puff/L로 환산해서 표준편차와 함께 표시하였다. SPSS(version 10.
이론/모형
- 담배연기로부터 얻은 시험물질의 세포독성은 리소좀에 의한 neutral red 흡수 정도를 측정하는 Neutral red cytotoxicity assay 방법을 사용하였다.(Borenfreund and Puerner, 1985).
- 본 연구는 필터종류에 따른 담배의 주류연 성분이 세포독성에 미치는 영향을 조사하기 위해, cellulose acetate(CA) 필터의 표준담배 (Kentucky Reference Cigarette, 2R4F), CA 필터를 carbon 필터로 대치한 표준담배, 필터가 제거 된 표준담배(양절담배) 등 3종의 시료를 사용하였다. 담배연기의 세포독성은 CH0-K1 세포주를 이용한 neutral red uptake법을 사용해서 측정하였다.
- 연기응축물 중의 니코틴분석은 ISO 10315에 준하여 GC 분석을 실시하였다. 담배의 주류연 중 carbonyl 화합물의 분석은 Health Canada의 official method(1999)에 따라서 측정했으며, 휘발성 및 반휘발성 성분의 분석은 ATD-400이 장착된 HP5890 GC를 이용하여 분석하였다.
- 담배연기 중 tar, 니코틴 분석은 ISO 3308에 준하여, 각각의 담배시료 20개피를 RM20 흡연장치를 이용하여 담배를 연소시키면서 92 mm Cambridge filter pad를 TPM을 포집하여 분석하였다. 연기응축물 중의 니코틴분석은 ISO 10315에 준하여 GC 분석을 실시하였다. 담배의 주류연 중 carbonyl 화합물의 분석은 Health Canada의 official method(1999)에 따라서 측정했으며, 휘발성 및 반휘발성 성분의 분석은 ATD-400이 장착된 HP5890 GC를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- 4) 용액이 있는 gas-washing bottle에 포집한 GVP에 대해 세포 독성을 조사하였다. Fig. 2 에서와 같이, 모든 담 배시료에 대한 GVP를 세포에 처리시 농도 의존 적으로 세포 생존율이 감소되었으며, 특히 양절 담배의 경우 세포생존율이 가장 급격하게 감소하였다. 용량-반응식을 이용해서 구해진 CA 필 터담배, carbon 필터담배 그리고 양절담배의 GVP에 대한 EC5o 값은 각각 32.
- 담배 연기응축물 (CSC)의 puff당 세포독성은 양절담배에 비해 필 터담배에서 현저하게 낮았으나, CSC 단위 농도 당 세포독성은 담배시료 간 유의적인 차이가 없었다. Gas washing bottle을 이용하여 포집한 가스상 분획 (GVP)에 대한 세포독성을 비교한 결과, CA 필터담배, carbon 필터담배 그리고 양절담배의 EC5o 값이 각각 32.5, 40.9, 25.6 puff/L로서, carbon 필터담배의 세포독성이 가장 낮았다.
- 각각의 담배시료에 대한 가스상 성분들의 이행량을 조사한 결과, carbonyl 화합물의 경우 양 절담배에서 상대적으로 높았으며, carbon 필터담 배에서 가장 낮은 값을 나타내었다. 담배필터를 사용함으로써 HCN과 ammonia 등과 같은 성분들을 약 50% 제거하는 것으로 나타났으며, 또한 formaldehyde, acetaldehyde, acetone, acrolein, crotonaldehyde 그리고 MEK 등은 담배시료의 GVP에 대한 세포독성과 정의 관계가 있는 것으로 사료된다.
- 으로 CA 필터 또는 carbon 필터 담배의 경우보다 2배 이상 높았다. 담배 연기응축물 (CSC)의 puff당 세포독성은 양절담배에 비해 필 터담배에서 현저하게 낮았으나, CSC 단위 농도 당 세포독성은 담배시료 간 유의적인 차이가 없었다. Gas washing bottle을 이용하여 포집한 가스상 분획 (GVP)에 대한 세포독성을 비교한 결과, CA 필터담배, carbon 필터담배 그리고 양절담배의 EC5o 값이 각각 32.
- 각각의 담배시료에 대한 가스상 성분들의 이행량을 조사한 결과, carbonyl 화합물의 경우 양 절담배에서 상대적으로 높았으며, carbon 필터담 배에서 가장 낮은 값을 나타내었다. 담배필터를 사용함으로써 HCN과 ammonia 등과 같은 성분들을 약 50% 제거하는 것으로 나타났으며, 또한 formaldehyde, acetaldehyde, acetone, acrolein, crotonaldehyde 그리고 MEK 등은 담배시료의 GVP에 대한 세포독성과 정의 관계가 있는 것으로 사료된다.
- 3 에서와 같이 carbonyl 화합물 중 formaldehyde, acetaldehyde, acetone, acrolein, crotonaldehyde 그리고 MEK의 이행량은 양절담배 > CA 필터담배 > carbon 필터담배 순으로 낮은 값을 나타냈으며, 각 담배시료의 GVP에 대한 세포독성 결과와 정의 관계가 있었다. 또한 HCN과 ammonia는 양절담배에 비하여 두 종류의 필터담배에서 이행량이 약 50% 정도 감소되었으며, CA 필터담배와 carbon 필터 담배간의 차이는 없었다. 이와 같은 분석 결과로부터, HCN과 ammonia 등과 같은 성분들은 담 배필터에 의해서 크게 제거되는 것으로 나타났으며, formaldehyde, acetaldehyde, acetone, acrolein, crotonaldehyde 그리고 MEK 등은 담배시료의 GVP에 대한 세포독성에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.
- 담배주류연의 세포독성에 대한 담배필터의 영향을 조사하기 위하여 동일한 puff 수(5회)로 연소시켜 담배시료를 제조하였다. 세 종류 담배의 puff 횟수의 증가에 따라서 세포 생존율이 감소되었으며, 특히 양절담배에서 가장 급격하게 감소 되었다(Fig. 1). 용량-반응식을 이용해서 구한 CA 필터담배, carbon 필터담배 그리고 양절담배의 ECso 값은 각각 68.
- 1). 용량-반응식을 이용해서 구한 CA 필터담배, carbon 필터담배 그리고 양절담배의 ECso 값은 각각 68.0 ±3.7, 67.5 ±4.5, 그리고 28.8 ± 3.1 puff/L로서 양절담배에서 2배 이상 높은 세포독성을 보였다(Table 2). 그러나 CSC 단위 농도당 ECso 값은 각각 95-100 μg CSC/mL로서 담배시료 간 유의적인 차이는 없었 다(Data not shown).
- 2 에서와 같이, 모든 담 배시료에 대한 GVP를 세포에 처리시 농도 의존 적으로 세포 생존율이 감소되었으며, 특히 양절 담배의 경우 세포생존율이 가장 급격하게 감소하였다. 용량-반응식을 이용해서 구해진 CA 필 터담배, carbon 필터담배 그리고 양절담배의 GVP에 대한 EC5o 값은 각각 32.5 ±3.1, 40.9 ±3.3 그리고 25.6 ±3.5 puff/L 로서 carbon 필터담배의 세포독성이 현저하게 낮았다(Table 2). 이와 같은 결과는 carbon을 함유한 필터를 채택한 담배의 경우 전 연기 (whole smoke) 수준에서 낮은 유전독성 및 세포독성을 보이는 경우와 일치하는 결과이다 (Bombick et al.
- 또한 HCN과 ammonia는 양절담배에 비하여 두 종류의 필터담배에서 이행량이 약 50% 정도 감소되었으며, CA 필터담배와 carbon 필터 담배간의 차이는 없었다. 이와 같은 분석 결과로부터, HCN과 ammonia 등과 같은 성분들은 담 배필터에 의해서 크게 제거되는 것으로 나타났으며, formaldehyde, acetaldehyde, acetone, acrolein, crotonaldehyde 그리고 MEK 등은 담배시료의 GVP에 대한 세포독성에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.
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