[논문]제주산 식물을 이용한 미백 기능성화장품 원료에 대한 검색

이선주; 부희정; 이정아; 정덕상

문제 정의

제주도에서 자생하는 여러가지 식물들의 기능성 미백 화장품 원료로서의 사용 가능성을 확인하기 위하여 mushroom tyrosinase와 melanin 세포를 이용하여 효능 측정을 하였다. Melanin 형성의 최종산물인 멜라닌 양을 측정함 으로서 시료들의 미백효과를 전체적으로 확인할 수 있었고, MTT법을 이용하여 세포 증식 억제 효과가 없으면서 미백효능이 좋은 시료를 확인하고자 하였다. 그 결과 여러 시료 중에서 개민들레 줄기, 까마중, 미국미역취, 돌외, 주목 추출물에서 좋은 멜라닌 생성 억제 효과를 확인할 수 있었다.
[5, 6, 7]. 본 실험에서는 멜라닌 생성 억제 효과를 갖는 천연 식물의 검색을 위하여 청정지역인 제주도에서 자생하는 18종의 식물을 B16F10 melnoma 세포를 이용하여 최종 멜라닌 합성 억제 효과와 MTT법을 이용하여 세포 독성 을 확인하였다. 그리고 mushroom tyrosinase 활성 억제 효과를 측정하여 멜라닌 합성과 멜라닌 생성 초기에 관여하는 tyrosinase 억제 효과와의 관계를 확인하였다.
Tyrosinase는 멜라닌 생성 초기 단계에 관여하는 효소로서, 미백관련 효능을 검증 시 그 활성 억제 정도를 측정하여 평가한다. 본 실험에서도 멜라닌 생성 억제 효과를 보인 개민들레 줄기, 까마중, 미국미역취, 돌외, 주목 추출물의 mushroom tyrosinase 효소활성 억제 정도를 측정하여 멜라닌 생성 억제 효과가 tyrosinase 활성을 억제하여 나타난 결과인지를 확인하고자 하였다. 시료농도 150 μg/mL로 처리한 결과 tyrosinase 활성 억제를 시키는 시료는 없었으며, 오히려 주목(-3492%), 까마중(-12.

제안 방법

세포의 증식과 독성에 대한 평가는 Mosmann의 방법을 변형한 MTT 정량법을 이용하여 측정하였다[91 B16F10cell과 HaCaT cell (5 x 104 cells/mL) 을 각각 96 well plate에 200 "L 넣고 cell을 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 전 배양(overnight)시켰고, 부착된 cell에 시료를 처리한 후 4 일간 다시 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였다. 배양된 세포에 MTT (50 mg/mL) 시약을 처리 (0.
B16F10 melanoma 세포에 멜라닌 생성 억제 효과를 보인 개민들레 줄기, 까마중, 미국미역취, 돌외, 주목의 메탄올 추출물을 6개의 농도로 처리하여 농도에 따른 세포 증식에 미치는 효과를 측정하였다. 높은 농도(300 ㎍/mL) 로 처리한 경우에서는 까마중 추출물이 대조군인 arbutin(18.
0 x 10° cells/mL)을 culture plate에 전종(3 mL)하여 전 배양하고, 4일간 시료를 처리한 후 3 7℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였다. Plate의 배지 제거 후 세포를 수확하여 세포수를 2.0 X 105 cells/m也로 조정하고 1 N NaOH 200를 넣고 95℃ 에서 5 min간 멜라닌을 녹인 후에 450 nm에서 ELISA reader로 측정하여 대조군과 비교하였다. 합성 멜라닌을 이용하여 standardsoultion을 만들고 시료와 standard soultion을 96 well plate에 넣고 흡광도를 측정하였다.
본 실험에서는 멜라닌 생성 억제 효과를 갖는 천연 식물의 검색을 위하여 청정지역인 제주도에서 자생하는 18종의 식물을 B16F10 melnoma 세포를 이용하여 최종 멜라닌 합성 억제 효과와 MTT법을 이용하여 세포 독성 을 확인하였다. 그리고 mushroom tyrosinase 활성 억제 효과를 측정하여 멜라닌 합성과 멜라닌 생성 초기에 관여하는 tyrosinase 억제 효과와의 관계를 확인하였다.
25%)보다 우수하거나 비슷한 효과를 보였다(Table 1). 그리고 효능이 좋은 5개의 시료에 대해서는 농도별 멜라닌 생성 억제 효과를 측정하였다 (Figure 1).
멜라닌 최종 산물인 멜라닌 양을 B16F10 melanoma 세포에 시료를 처리하여 저해 정도를 측정함으로서 미백효과를 확인하였다. Melanoma 세포를 이용한 멜라닌양의 측정은 천연물의 미백효능을 in citro에서 확인할 때 가장 정확한 방법이다.
항온기에서 배양하였다. 배양된 세포에 MTT (50 mg/mL) 시약을 처리 (0.1 mg)하여 4 h 동안 항온기에 두어 formazan을 형성시키고, 형성된 for- mazane DMSO로 녹인 후 540 nm에서 흡광도 ELISA reader로 측정하여 대조군과 비교하였다.
시료의 멜라닌 생성 억제 정도는 B16F10 melanoma cell을 이용하여 최종 생성되는 멜라닌 생성 억제 정도를 Gordon PR 방법을 수정하여 측정하였다[10]. B16F10 melanoma cells (1.
따라서 미백 효능이 있는 소재가 kerationcyte에 대한 독성이 없어야 한다. 이를 확인하기 위하여 인간 표피에서 분리해낸 kerati- nocyte인 HaCaT세포를 이용하여 농도별로 처리한 시료의 독성을 확인하였다. 그 결과 고농도(300㎍/mL)로 처리한 경우 개민들레 줄기(36.
제주도에서 자생하는 여러가지 식물들의 기능성 미백 화장품 원료로서의 사용 가능성을 확인하기 위하여 mushroom tyrosinase와 melanin 세포를 이용하여 효능 측정을 하였다. Melanin 형성의 최종산물인 멜라닌 양을 측정함 으로서 시료들의 미백효과를 전체적으로 확인할 수 있었고, MTT법을 이용하여 세포 증식 억제 효과가 없으면서 미백효능이 좋은 시료를 확인하고자 하였다.
0 X 105 cells/m也로 조정하고 1 N NaOH 200를 넣고 95℃ 에서 5 min간 멜라닌을 녹인 후에 450 nm에서 ELISA reader로 측정하여 대조군과 비교하였다. 합성 멜라닌을 이용하여 standardsoultion을 만들고 시료와 standard soultion을 96 well plate에 넣고 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 농도는 합성 멜 라닌으로 작성된 표준 농도 곡선으로부터 결정하였다.

대상 데이터

B16F10 melanoma celle KCLB (Korean cell line bank)로부터 분양 받았고, HaCaT celle 제주대학교 의과대학 생화학 실험실에서 협조를 얻어 100 units/mL penicillin-streptomycin 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CCh 항온기에서 배양하였다. 배지는 3일에 한 번 새 배지로 교환하였으며, 4~7일에 한 번씩 계대 배양하였다.
배지는 3일에 한 번 새 배지로 교환하였으며, 4~7일에 한 번씩 계대 배양하였다. tyrosinase, 2-tyrosin, 합성 멜라닌 그리고 3-(4, 5-dimethylthiazol-2- gel)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) Sigma (USA)사의 것을 구입하여 사용하였다.
실험에 사용된 각각의 시료들은 제주도에 자생하는 식물들로서, 직접 채집하여 동정한 후 깨끗이 씻어 이물질을 제거하여 통풍이 잘되는 그늘진 곳에서 건조하였다. 잘 건조된 시료들은 잘게 파쇄하여 건조 시료 1 kg을 80% 메탄올 2 L에 넣고 3개월 이상 암냉소에 보관하였다.

이론/모형

Tyrosinase 저해 활성 측정은 dopachrome 방법을 이용하여 UV/Vis 분광광도계로 측정하였다[8]. 0.

성능/효과

이를 확인하기 위하여 인간 표피에서 분리해낸 kerati- nocyte인 HaCaT세포를 이용하여 농도별로 처리한 시료의 독성을 확인하였다. 그 결과 고농도(300㎍/mL)로 처리한 경우 개민들레 줄기(36.53%)를 제외하고 모두 50% 이상의 세포 독성을 보였고, 미국미역취와 개민들레 줄기인 경우 농도(10 μg/mL)는 오히려 세포 증식을 시키고 있음을 확인하였다(Figure 3).
Melanin 형성의 최종산물인 멜라닌 양을 측정함 으로서 시료들의 미백효과를 전체적으로 확인할 수 있었고, MTT법을 이용하여 세포 증식 억제 효과가 없으면서 미백효능이 좋은 시료를 확인하고자 하였다. 그 결과 여러 시료 중에서 개민들레 줄기, 까마중, 미국미역취, 돌외, 주목 추출물에서 좋은 멜라닌 생성 억제 효과를 확인할 수 있었다. 그러나 이들 시료 증 까마중은 고농도에서 높은 독성을 보였고, 돌외와 주목도 비교적 독성이 높게 나옴을 확인할 수 있었다.
그 결과 여러 시료 중에서 개민들레 줄기, 까마중, 미국미역취, 돌외, 주목 추출물에서 좋은 멜라닌 생성 억제 효과를 확인할 수 있었다. 그러나 이들 시료 증 까마중은 고농도에서 높은 독성을 보였고, 돌외와 주목도 비교적 독성이 높게 나옴을 확인할 수 있었다. 반면 미국미 역취인 경우 고농도 (200 ㎍/mL에서 멜라닌 세포에서는 오히려 약간의 세포 증식을 시켰으며, HaCaT 세포에서도 비교적 낮은 세포 증식 억제(10.
86%)에 비해 가장 강한 독성(9558%)을 보였고, 미국 미역취 추출물인 경우 고농도에서도 세포 증식 억제를 보이지 않았다. 그리고 개민들레 줄기 추출물인 경우도 농도별 세포 증식 억제가 크지 않음을 확인할 수 있었으며, 까마중 추출물을 제외하고는 고농도에서 50% 이상의 세포 증식 억제를 하지 않음을 확인하였다(Figure 2).
B16F10 melanoma 세포에 멜라닌 생성 억제 효과를 보인 개민들레 줄기, 까마중, 미국미역취, 돌외, 주목의 메탄올 추출물을 6개의 농도로 처리하여 농도에 따른 세포 증식에 미치는 효과를 측정하였다. 높은 농도(300 ㎍/mL) 로 처리한 경우에서는 까마중 추출물이 대조군인 arbutin(18.86%)에 비해 가장 강한 독성(9558%)을 보였고, 미국 미역취 추출물인 경우 고농도에서도 세포 증식 억제를 보이지 않았다. 그리고 개민들레 줄기 추출물인 경우도 농도별 세포 증식 억제가 크지 않음을 확인할 수 있었으며, 까마중 추출물을 제외하고는 고농도에서 50% 이상의 세포 증식 억제를 하지 않음을 확인하였다(Figure 2).
그러나 이들 시료 증 까마중은 고농도에서 높은 독성을 보였고, 돌외와 주목도 비교적 독성이 높게 나옴을 확인할 수 있었다. 반면 미국미 역취인 경우 고농도 (200 ㎍/mL에서 멜라닌 세포에서는 오히려 약간의 세포 증식을 시켰으며, HaCaT 세포에서도 비교적 낮은 세포 증식 억제(10.28%)를 보이면서 좋은 멜라닌 생성 억제 효과를 보였다. 그러나 멜라닌 생성 억제 효과는 tyrosinase 활성 억제 실험을 통해 이 효소의 억제에 의한 결과가 아님을 확인할 수 있었다.
Melanoma 세포를 이용한 멜라닌양의 측정은 천연물의 미백효능을 in citro에서 확인할 때 가장 정확한 방법이다. 본 실험에 사용된 제주 자생 식물의 최종 멜라닌 생성 억제 정도를 측정한 결과 시료 처리 농도(100 ㎍/mL)에서 까마중(96.41%), 개민들레 줄기 (50.00%), 돌외(77.83%), 미국미역취(38.78%), 주목(74.3B %)이 대조군으로 사용된 arbutin (47.25%)보다 우수하거나 비슷한 효과를 보였다(Table 1). 그리고 효능이 좋은 5개의 시료에 대해서는 농도별 멜라닌 생성 억제 효과를 측정하였다 (Figure 1).
본 실험에서도 멜라닌 생성 억제 효과를 보인 개민들레 줄기, 까마중, 미국미역취, 돌외, 주목 추출물의 mushroom tyrosinase 효소활성 억제 정도를 측정하여 멜라닌 생성 억제 효과가 tyrosinase 활성을 억제하여 나타난 결과인지를 확인하고자 하였다. 시료농도 150 μg/mL로 처리한 결과 tyrosinase 활성 억제를 시키는 시료는 없었으며, 오히려 주목(-3492%), 까마중(-12.94%) 그리고 돌외(-0.46%)인 경우는 tyrosinase 활성을 증가시키고 있음을 확인할 수가 있었다(Table 2).

후속연구

현재 본 실험실에서는 제주도 자생식물들의 다양한 생리활성에 대한 연구가 진행되고 있으며, 특히 기능성 화장품 원료 개발을 위한 여러가지 실험을 시행하고 있다. 본 연구에서 확인된 좋은 미백효과를 갖는 천연물 역시 현재 분리과정 중에 있으며 더 많은 연구를 진행 중에 있다.

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