선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이는 Exiguobacterium sp. SC2-1 배양액의 우수한 항산화 활성을 나타내는 것으로써 천연 항산화제로서 가능성을 보여주고 있는 것이며 인체에 유해한 합성 항산화제의 대체제로서의 가능성을 보여주는 것이다.
- 본 연구에서는 해양 유래 항산화 물질을 생산해내는 미생물을 탐색하고 동정하여 배지 상에서 영양성분의 최적화.조 건 등의 배양조건을 검토하여 항산화 물질 생성 특성을 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 해양 유래 항산화 물질을 생산해내는 미생물을 탐색하고 동정하여 배지 상에서 영양성분의 최적화.조 건 등의 배양조건을 검토하여 항산화 물질 생성 특성을 보고하고자 한다.
가설 설정
- b)Each basal medium is Marine broth (Difco Co.z USA).
제안 방법
- 5% (w/v)를 각각 첨가한 후, K2HPO4/ MgSO4 . 7H2Oz MgC12, Na2HPO4, KH2PQ의 농도를 각각 0.05% (w/v)가 되도록 첨가하고 pH를 7.8로 조절하였으며, 접종 원을 2% (v/v)로 접종하여 25℃, 24시간 동안 배양한 후, 600 nm에서 생육 도를 측정하였으며 배양액을 다시 원심 분리하여 얻은 상등액을 가지고 항산화 활성을 측정하였다.
- 5 ml microcentrifuge tube에 옮겨 10, 000 rpm에서 1분간 원심분리하여 상청액을 제거한 후 모아진 bacteria pellet을 수집하였다. Accuprep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 분리하고 Bio- neer사에서 제조한 eubacteria의 Universal Primer 27F forward primer와 1522R reverse primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 반응 산물은 Accuprep PCR Purification Kit를 이용하여 정제하였으며, 최종적으로 염기서열을 분석하였다.
- 배지 조건의 최적화 과정에서 탄소 원의 종류에 따른 배양액의 항산화 활성 측정은 DPPH법에 의한 전자공여 능으로 측정하였다. 균주 배양은 기본 배지인 Marine broth를 기본 배지로 하여 mannitol, sucrose, lactose, xylose, maltose, fructose, dextrose, glycerin을 각각 1% (w/v)로 첨가하여 초기 pH를 7.8로 동일하게 조정한 후, 전 배양된 분리 균주를 각각 2% (v/v)로 접종하여 25℃에서 24시간 배양한 후, 600 nm 흡광도로 생육 도를 측정하였으며, 8, 000 rpm에서 3분간 원심분리하여 얻은 상등액을 가지고 항산화 활성을 측정하였으며, 이에 나타난 maltose의 농도별 효과를 검토하기 위하여 Marine broth에 탄소 원을 0, 0.5, 1, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0% 각각의 농도별로 첨가하여 25℃, 24시간 배양한 상등액을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다[6].
- 질소원의 종류에 따른 배양액의 항산화 활성 측정은 DPPH 법에 의한 전자공여 능으로 측정하였다. 균주 배양은 기본배 지인 Marine broth 배지에 최적 탄소 원인 maltose를 2.5% 농도로 첨가한 후, peptone, yeast extract, tryptone, NaNOj, (NHQ2SO4, (NH4)2HPO4, malt extract, NH4NO3, KNO3를 각각 0.5% (w/v)의 농도로 각각 첨가하였으며, 전 배양된 분리 균주를 각각 2% (v/v)로 접종하여 초기 pH를 동일하게 7.8로 조정한 후, 25℃에서 24시간 배양한 후, 600 nm에서 흡광도로 생육 도를 측정하고, 원심분리하여 얻은 상등액을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다. 또한 선발된 최적 질소원 농도를 0, 0.
- 8로 조절한 다음, 12VC, 15분간 고압 멸균하였다. 그 후, 2% (v/v) 정도의 농도로 균을 최적 배지 접종한 다음, 25℃, 24시간 동안 200 rpm에서 배양한 후, 최종적으로 항산화 활성을 측정하였다. 또한 천연 항산화 제인 a-tocopherol, 합성 항산화제인 BHA, BHT의 농도를 0.
- 8로 조정한 후, 25℃에서 24시간 배양한 후, 600 nm에서 흡광도로 생육 도를 측정하고, 원심분리하여 얻은 상등액을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다. 또한 선발된 최적 질소원 농도를 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0% (w/v)로 달리하여 질소원 선발 실험 조건과 같은 방법으로 수행하였다. 이때 Marine broth에 함유된 peptone과 yeast extract는 탄 소원 및 다른 질소원과 동일한 실험조건을 만들어주기 위하여 첨가량을 고려하지 않고 실험을 진행하였다.
- 그 후, 2% (v/v) 정도의 농도로 균을 최적 배지 접종한 다음, 25℃, 24시간 동안 200 rpm에서 배양한 후, 최종적으로 항산화 활성을 측정하였다. 또한 천연 항산화 제인 a-tocopherol, 합성 항산화제인 BHA, BHT의 농도를 0.05% (w/v)로 조절한 후 DPPH법에 의한 방법으로 항산화 활성을 비교하였다.
- 분리 균주의 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 분석과 균주의 세포벽 지방산 조성을 분석하였다. 염기서열을 분석하기 위하여 MB에서 24시간 동안 배양된 균주를 사용하여 배 양액을 1.
- 분리 균주의 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 분석과 균주의 세포벽 지방산 조성을 분석하였다. 염기서열을 분석하기 위하여 MB에서 24시간 동안 배양된 균주를 사용하여 배 양액을 1.5 ml microcentrifuge tube에 옮겨 10, 000 rpm에서 1분간 원심분리하여 상청액을 제거한 후 모아진 bacteria pellet을 수집하였다. Accuprep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 분리하고 Bio- neer사에서 제조한 eubacteria의 Universal Primer 27F forward primer와 1522R reverse primer를 이용하여 PCR을 수행하였다.
- 0% (w/v)로 달리하여 질소원 선발 실험 조건과 같은 방법으로 수행하였다. 이때 Marine broth에 함유된 peptone과 yeast extract는 탄 소원 및 다른 질소원과 동일한 실험조건을 만들어주기 위하여 첨가량을 고려하지 않고 실험을 진행하였다.
- 제주 연안 해수를 해양 미생물 분리용 평판배지 MA (Marine agar, Difco)에서 10’에서 10, 배로 희석한 후 배지에도 말하여 25℃에서 3일간 배양하고, 생성된 균주를 tooth pick 로 새로 만든 신선한 배지에 옮긴 후 다시 배양한 다음 생성된 colony에 멸균된 filter paper를 평판 배지 위의 colony 상에 놓고 한천배지에 있는 colony의 대사산물 및 균체가 여지에 옮겨지도록 한 후 DPPH (l/l-diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 탄 올 용액을 균체 및 대사산물이 묻은 filter paper에 분사하여 색이 소실되는 균주를 1차적으로 총 10여 종을 선별하였다[24].
- Accuprep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 분리하고 Bio- neer사에서 제조한 eubacteria의 Universal Primer 27F forward primer와 1522R reverse primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 반응 산물은 Accuprep PCR Purification Kit를 이용하여 정제하였으며, 최종적으로 염기서열을 분석하였다. 세포 지방산 분석을 위해 Marine broth에 25℃, 24시간 배양한 균체의 지방산을 Microbial Identification System (MIDI; Microbial ID, Sherlock System)의 지침에 의해 지방산을 추출하여 분석하였다.
- 최적 무기염류를 선발하기 위하여 Marine broth를 기본 배지로 하여 최적 탄소 원과 질소원 실험 결과로 선발된 maltose 2.5% (w/v), yeast extract 1.5% (w/v)를 각각 첨가한 후, K2HPO4/ MgSO4 . 7H2Oz MgC12, Na2HPO4, KH2PQ의 농도를 각각 0.
- 최적 배양 조건 및 영양성분 선발 시험 결과로부터 얻어진 2.5% (w/v) maltose, 1.5% (w/v) yeast extract, 0.05% (w/v) KH2PO4를 50 ml Marine broth가 첨가된 250 ml 삼각 플라스크에 첨가한 후, pH를 7.8로 조절한 다음, 12VC, 15분간 고압 멸균하였다. 그 후, 2% (v/v) 정도의 농도로 균을 최적 배지 접종한 다음, 25℃, 24시간 동안 200 rpm에서 배양한 후, 최종적으로 항산화 활성을 측정하였다.
- 합성 항산화제에 대응할 수 있는 천연 항산화제의 개발에 대한 기초적인 자료를 제공하고자 해양 미생물을 이용한 연구를 하였으며, 전자공여 능으로 항산화 물질 생산 능력이 우수한 해양 미생물을 분리하여 SC2-1 라고 명명하였다. 분리 균주 SC2-1은 제주 연안 해수로부터 분리하였으며, 생화학적, 유전학적, 세포벽의 지방산 조성을 토대로 최종적으로 Exiguobacterium sp.
- 항산화 활성능 측정을 위한 균주를 배양하기 위해 25℃, 200 rpm이에서 진탕 배양하였으며, 상기의 방법으로 분리된 각 균주들을 MB (Marine broth, Difco) 에 2% (v/v)씩 첨가하여 24시간 배양한 후, 에탄올에 녹인 3x104M DPPH (0.118 mg/ml) 용액 29 ml에 균주 배양액 100 μ1를 혼합하여 30분간 반응시켰다. 반응물을 4℃, 10, 000 rpm이에서 2분간 원심분리 한 후, 분비물을 제거하여 525 nm에서 흡광도를 측정하여 항산화 활성 능이 가장 큰 균주를 선정하였다 [8].
이론/모형
- 배지 조건의 최적화 과정에서 탄소 원의 종류에 따른 배양액의 항산화 활성 측정은 DPPH법에 의한 전자공여 능으로 측정하였다. 균주 배양은 기본 배지인 Marine broth를 기본 배지로 하여 mannitol, sucrose, lactose, xylose, maltose, fructose, dextrose, glycerin을 각각 1% (w/v)로 첨가하여 초기 pH를 7.
- 증폭된 PCR 반응 산물은 Accuprep PCR Purification Kit를 이용하여 정제하였으며, 최종적으로 염기서열을 분석하였다. 세포 지방산 분석을 위해 Marine broth에 25℃, 24시간 배양한 균체의 지방산을 Microbial Identification System (MIDI; Microbial ID, Sherlock System)의 지침에 의해 지방산을 추출하여 분석하였다.
- 질소원의 종류에 따른 배양액의 항산화 활성 측정은 DPPH 법에 의한 전자공여 능으로 측정하였다. 균주 배양은 기본배 지인 Marine broth 배지에 최적 탄소 원인 maltose를 2.
성능/효과
- 5% (w/v)가 첨가된 배지에 KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 . 7HQ, MgCl2, Na2HPO4< 각각 0, 05% (w/v) 첨가하여 균의 생육도 및 항산화 활성을 조사한 결과는 Table 4와 같이 5종의 무기염류는 균주의 생장에는 그다지 효과적으로 나타나지 않았지만 그중에서도 KH2PO4 첨가 구에서 균 생육도 및 항산화 활성이 증가하는 양상을 나타내었다. 이러한 결과는 buffering reagent로 작용하는 #, 세포 구조를 형성하는 K*의 효과에 기인한다는 보고가 있다[8].
- 최적 배지 조건 에서의 Exiguobacterium sp. SC2-1 배양액의 항산화 활성과 합성 항산화제, 천연 항산화제와의 비교실험 결과는 균주의 전 자 공여 능은 93-95%, 합성 항산화제인 BHT와 BHA는 94~ 95%, 천연 항산화제 a-Tocopherole 94%로 거의 유사한 항산화 활성을 확인할 수 있었다.
- 질소원이 Exiguobacterium sp. SC2-1 배양에 미치는 영향을 알아보기 위하여 최적 탄소 원인 maltose 2.5% (w/v) 농도가 첨가된 MB 배지에서 유기태 질소원 및 무기태 질소원 등 총 9종을 각각 0.5% (w/v)씩 첨가하여 조사한 결과는 Table 3에 서와 같이 유기태 질소원인 yeast extract# 첨가한 배지에서 균 생육도 및 항산화 활성이 가장 높게 나타났으며, 모든 실 험구의 전자공여 능은 42.1 ~77%의 범위였으며, tryptone을 첨가한 배지에서도 균 생육도 및 항산화 활성이 양호하였으며, 다른 유기태 질소원의 경우에도 대조 구와 비교해 보았을 때 양호한 활성을 나타냈다. 그리고 NaNO3, NH4NO3, KNO3, (NHQ2SO4 등 무기태 질소원을 첨가한 배지에서는 항산화 활성이 비교적 낮게 나타나는 것을 확인할 수가 있었다.
- 또한 Exiguobacterium sp. SC2J의 배양 시 첨가한 탄 소원 중에서 항산화 활성이 가장 우수한 maltose의 농도별 효과를 검토한 결과는 Table 2와 같이 나타났으며, 2.5% (w/v) 첨가 농도에서 배양한 배양액에서 60% 정도의 항산화 활성으로 가장 높게 나타났다.
- 이와 같은 특성은 Exigubacterium sp.가 갖는 특성과 유사하였으며, SC2-1 균주의 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과 Exiguobacterium oxi- dotolenms와 98% 일치하는 것으로 분석되었다. 균주의 세포벽 지방산 조성은 Table 1에 나타내었으며, 이들의 주요한지 방산은 Ci3:o iso, Ci3:o anteiso, Cis:o iso, Ci6:o, Ci6:o wiic, Ci7:o iso 및 Sum in feature 4로 분석되어 본 균주는 Exiguobacterium 종과 98% 이상 일치하는 것으로 밝혀졌으며, 이에 최종적으로 Exiguobacterium sp.
- 1 ~77%의 범위였으며, tryptone을 첨가한 배지에서도 균 생육도 및 항산화 활성이 양호하였으며, 다른 유기태 질소원의 경우에도 대조 구와 비교해 보았을 때 양호한 활성을 나타냈다. 그리고 NaNO3, NH4NO3, KNO3, (NHQ2SO4 등 무기태 질소원을 첨가한 배지에서는 항산화 활성이 비교적 낮게 나타나는 것을 확인할 수가 있었다.
- 그리고 선발된 최적 질소원인 yeast extract 농도의 생육도 및 항산화 활성을 조사한 결과는 Fig. 2에서와같이 질소원이 1% 이상 첨가된 배지에서의 항산화 활성이 90% 이상 나타났으며, yest extract 1.5% (w/v)가 첨가된 배지에서 균 생육도 및 항산화 활성이 가장 높게 나타났다. 영양원에 대한 항산 화 활성의 증가가 확연히 나타나는데, 어떠한 작용에 의해서 대사산물이 생성되는지는 좀 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 3에 나타내었다. 배양 상등액의 전자공여 능(EDA)은 94~95%로 천연 항산화제인 a-Tocopherol (94%) 과 합성 항산화제인 BHT (94%), BHA (95%) 와 유사한 활성을 나타내었다. 이는 Exiguobacterium sp.
- 본 실험 계에서 대조 구로 자주 사용하는 합성 항산화제인 BHT, BHA는 항산화 작용으로 반응시간과 함께 525 run에서 짙은 자색을 가지는 DPPH 용액의 홉 광도가 점차적으로 감소하는 것으로 나타났다[11].
- 제주 연안의 해수로부터 항산화 생성 능이 있는 균주를 1 차적으로 분리한 후, DPPH법에 의하여 라디컬 소거 능이 가장 높은 균주를 선발하여 SC2-1이라 명명하였다. 항산화 능을 나타내는 분리 균주 SC2-1의 생화학적 특성[20]은 이전 보고에 의해서 나타내었으며, 분리 균주는 그람 양성의 단간균으 로 집락은 원형이며 오렌지색을 나타내었으며, 해양 세균으로 생육에 있어서 sodium chloride를 필요로 했으며 catalase 양성, oxidase 음성을 나타내었으며, D-fructose, D-maltose, D-mannitol를 이용하여 산을 생성하였다.
- 5% (w/v)였다. 질소원에서는 유기태 질소원인 yeast extract이었고, yeast extract 최적 농도는 1.5% (w/v)였으며, 최적 무기염류는 0.05% (w/v) KH2PO4를 첨가 했을 때 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다. 최적 배지 조건 에서의 Exiguobacterium sp.
후속연구
- 5% (w/v)가 첨가된 배지에서 균 생육도 및 항산화 활성이 가장 높게 나타났다. 영양원에 대한 항산 화 활성의 증가가 확연히 나타나는데, 어떠한 작용에 의해서 대사산물이 생성되는지는 좀 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다. Table 2, 3에서와같이 시간 경과에 따라서도 항산 화능이 감소하지 않는 것은 탄소 원이나 질소원이 영양원으로 충분히 작용하여 균주가 2차 대사산물들을 생산하는데 있어서 계속적으로 에너지원으로서 공급되어서 나타나는 결과라고 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.