본 연구는 일반적으로 사용되는 DNA 추출방법들에 대한 효율을 비교하기 위해 수행하였다. 원료 옥수수 및 이를 가공한 시료들로부터 DNA추출을 하였으며, 추출된 DNA의 형상, 농도 및 순도 측정 그리고 PCR 분석 결과를 비교하였다. 5가지 방법으로 옥수수의 DNA를 추출한 결과, 추출방법에 따른 DNA 형상의 차이가 거의 없는 것을 확인하였으나, 각각의 시료들로부터 추출된 DNA의 양은 시료 g당 $0.25{\mu}g$부터 $234.0{\mu}g$까지 매우 다양하게 나타났다. 5가지 방법으로 옥수수 시료들의 DNA를 추출한 결과, CTAB법과 DNeasy plant Maxi 키트를 이용한 DNA 추출방법이 높은 수율을 보였다.
본 연구는 일반적으로 사용되는 DNA 추출방법들에 대한 효율을 비교하기 위해 수행하였다. 원료 옥수수 및 이를 가공한 시료들로부터 DNA추출을 하였으며, 추출된 DNA의 형상, 농도 및 순도 측정 그리고 PCR 분석 결과를 비교하였다. 5가지 방법으로 옥수수의 DNA를 추출한 결과, 추출방법에 따른 DNA 형상의 차이가 거의 없는 것을 확인하였으나, 각각의 시료들로부터 추출된 DNA의 양은 시료 g당 $0.25{\mu}g$부터 $234.0{\mu}g$까지 매우 다양하게 나타났다. 5가지 방법으로 옥수수 시료들의 DNA를 추출한 결과, CTAB법과 DNeasy plant Maxi 키트를 이용한 DNA 추출방법이 높은 수율을 보였다.
In this study, the effects of five extraction methods for raw and processed corns were compared with respect to the integrity, yields and quality of DNA extracted from them and the results were assessed by PCR analysis. From the comparison of five extraction methods, DNA integrity showed a similar p...
In this study, the effects of five extraction methods for raw and processed corns were compared with respect to the integrity, yields and quality of DNA extracted from them and the results were assessed by PCR analysis. From the comparison of five extraction methods, DNA integrity showed a similar pattern. Amounts of genomic DNA obtained from the five extraction methods varies from $0.25{\mu}g\;to\;234{\mu}g$ per 1 g sample. The DNA yield extracted with CTAB method and DNeasy Plant Maxi kit is greater than that obtained from other extraction methods. These results would be applicable for the selection of an adequate extraction method for specific samples.
In this study, the effects of five extraction methods for raw and processed corns were compared with respect to the integrity, yields and quality of DNA extracted from them and the results were assessed by PCR analysis. From the comparison of five extraction methods, DNA integrity showed a similar pattern. Amounts of genomic DNA obtained from the five extraction methods varies from $0.25{\mu}g\;to\;234{\mu}g$ per 1 g sample. The DNA yield extracted with CTAB method and DNeasy Plant Maxi kit is greater than that obtained from other extraction methods. These results would be applicable for the selection of an adequate extraction method for specific samples.
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제안 방법
13) Autoclaving은 고온 및 고압처리를 위하여 Autoclave(GB-506-8, Han Baek CO., Korea)를 이용하여 1.3 kgf/cm2, 121℃에서 18분간 가공하였고, Baking은 고온처리를 위하여 Dry oven(Imperial V Digital Mechanical, Lab-line Inc., USA)을 이용하여 20VC에서 40분간 가공하였다. 그리고 Fiying은 유탕처리를 위해 해바라기유(CJ, Korea)를 이용하여 158℃에서 15초간 가공하였다.
8% agarose gel(Takara, Japan) 에 DNA 5 μl와 6 X loading dye(Bioneer, Korea) 1 μl을 혼합한 용액을 투여하여 100 voltS. 15분간 전기영동 하였고 marker로는 100 bp DNA ladder(Bioneer, Korea)를 사용하였다. 전기영동이 끝난 것은 EtBr(Ethidium Bromide, Bioneer, Korea)로 25분간 염색하고 30분간 탈색하여 Image Analyzer(Gel Doc XR, Bio-Rad, USA)로.
5가지 방법으로 원료 시료 및 가공된 시료의 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 1.
5μl로 최종 반응액이 25μl가 되도록 조성하였다. PCR은 고온개시 (Hot Start)법을 사용하였으며 GeneAmp 9700(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 95℃에서 10분간 최초 변성을 시킨 후, 9?C에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 1회 반복으로 하여 40회 반복하고 마지막으로 72℃에서 7분간 최종 신장하였다. PCR반응에 의한 증폭결과는 0.
DNA 농도는 분광광도계 (Ultrospec 4300 pro, Amersham Pharmacia Biotech., Sweden)를 사용하여 측정하였고 PCR반응에 필요한 DNA농도(20 ng/μl)가 되도록 멸균증류수로 희석한 후, -20℃에서 보관하였다. 추출한 DNA(20 ng/μl)는 0.
PCR 반응용액의 조성은 DNA polymerase(Applied Biosystems, USA) 0.125 |J(0.625 unit), dNTPs(Applied Biosystems, USA) 2μl(200μM), 1 OX PCR buffer 4 \il (Applied Biosystems, USA), primer(Nippon gene, Japan) 0.5(i/(each 0.5 μM), template DNA(20ngμl) 2.5μl로 최종 반응액이 25μl가 되도록 조성하였다. PCR은 고온개시 (Hot Start)법을 사용하였으며 GeneAmp 9700(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 95℃에서 10분간 최초 변성을 시킨 후, 9?C에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 1회 반복으로 하여 40회 반복하고 마지막으로 72℃에서 7분간 최종 신장하였다.
PCR은 고온개시 (Hot Start)법을 사용하였으며 GeneAmp 9700(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 95℃에서 10분간 최초 변성을 시킨 후, 9?C에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 1회 반복으로 하여 40회 반복하고 마지막으로 72℃에서 7분간 최종 신장하였다. PCR반응에 의한 증폭결과는 0.5 × TAE에서 1.8% agarose gel에 PCR 증폭산물 5μl와 loading dye 1μl를 혼합한 용액을 투여하여 100 volt로 25분간 전기영동 하였고 marker로는 100 bp DNA ladder를 사용하였다. 전기영동이 끝난 것은 EtBr로 25분간 염색하고 30분간 탈색하여 Image Analyzer로 확인하였다.
가공 방법은 Autoclaving, Baking, Frying으로 구분 수행하였다.13) Autoclaving은 고온 및 고압처리를 위하여 Autoclave(GB-506-8, Han Baek CO.
건조된 시료는 입자를 균질화하기 위해 초고속 분쇄기 (Puverisette 14, Germany)를 이용하여 입자크기가 200 gm 이하가 되도록 분쇄하였다. 균질화된 시료는 가공을 위해 50 m/의 멸균된 증류수에 잘 혼합하여 반죽을 만든 후, 일정 크기가 되도록 나누었다.
그 후, 원료 및 가공된 시료를 식품공전을 통하여 제시된 유전자재조합식품의 시험방법을 포함한 5가지 DNA 추출 방법을 이용하여 가공 공정에 따른 DNA의 변화 및 PCR에 의한 검출정도 확인 그리고 현재 상업화된 여러 제조사들의 DNA 추출제품들의 가공식품 적용성을 비교하였다.
따라서 본 연구에서는 옥수수의 가공식품에서 많이 이용하는 방법으로 원료 옥수수를 고온 및 고압, 굽기, 유탕 가공을 하였다. 그 후, 원료 및 가공된 시료를 식품공전을 통하여 제시된 유전자재조합식품의 시험방법을 포함한 5가지 DNA 추출 방법을 이용하여 가공 공정에 따른 DNA의 변화 및 PCR에 의한 검출정도 확인 그리고 현재 상업화된 여러 제조사들의 DNA 추출제품들의 가공식품 적용성을 비교하였다.
6)을 통하여 소개되었던 Promega사의 Wizard Magnetic DNA Purification System for food(PM), Wizard DNA clean-up System(PC)를 이용한 방법을 사용하였다. 또한, iNtRON사의 G-spin lip Genomic DNA extraction kit fbr plant(IG)를 이용한 방법도 사용하였다. 모든 시료에 대해 3회 반복하여 DNA를 추출하였다.
또한, iNtRON사의 G-spin lip Genomic DNA extraction kit fbr plant(IG)를 이용한 방법도 사용하였다. 모든 시료에 대해 3회 반복하여 DNA를 추출하였다.
본 연구에 이용된 primer는 starch synthase를 암호화하는 옥수수의 내재유전자 zSSUb 유전자14)를 표적으로 하여 114bp의 증폭산물을 얻을 수 있도록 제작되었으며, Real-time PCR를 위한 probe가 함께 제작되었다. 이와같은 primer와 probe는 일본의 Nippon Gene사에서 제작하여 시판하고 있는 것으로 각각의 염기서열은 비공개로 되어 있다.
8% agarose gel에 PCR 증폭산물 5μl와 loading dye 1μl를 혼합한 용액을 투여하여 100 volt로 25분간 전기영동 하였고 marker로는 100 bp DNA ladder를 사용하였다. 전기영동이 끝난 것은 EtBr로 25분간 염색하고 30분간 탈색하여 Image Analyzer로 확인하였다.
대상 데이터
재료. 본 연구에서는 GM 옥수수 품종인 M0N810((Monsanto, USA)과 비형질전환 옥수수(non-GM)를 .시료로 사용하였다.
이론/모형
5μl로 최종 반응액이 25μl가 되도록 조성하였다. PCR은 고온개시 (Hot Start)법을 사용하였으며 GeneAmp 9700(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 95℃에서 10분간 최초 변성을 시킨 후, 9?C에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 1회 반복으로 하여 40회 반복하고 마지막으로 72℃에서 7분간 최종 신장하였다. PCR반응에 의한 증폭결과는 0.
옥수수에서의 DNA추출은 식품의약품 안전청고시(2005-3호)를 통하여 제정된 유전자재조합식품의 DNA 추출방법인 Cetyltrimethyl-ammonium bromide(CTAB, CT)법15), Qiagen사의 DNeasy plant Maxi kit(QM)를 이용한 방법 외에도 유전자재조합식품검사지침(2002. 6)을 통하여 소개되었던 Promega사의 Wizard Magnetic DNA Purification System for food(PM), Wizard DNA clean-up System(PC)를 이용한 방법을 사용하였다. 또한, iNtRON사의 G-spin lip Genomic DNA extraction kit fbr plant(IG)를 이용한 방법도 사용하였다.
성능/효과
이러한 결과는 기존에 보고 된 콩 및 가공식품에서의 파괴된 DNA 패턴과 유사한 결과이다.16) 분광광도계에 의한 추출된 DNA의 정량적 분석에서 1 g의 시료를 사용한 가공공정을 거치지 않은 원료 시료와 가공공정을 거친 시료의 경우 모두에서 5가지 DNA추출방법 가운데 CTAB법과 QM방법에 의한 DNA추출방법이 높았으며, 상대적으로 빠른 방법인 PM, PC, IG는 원료 시료에서도 낮은 수율을 보였다(Table 1). 또한, DNA형상에서 가장 많이 분해된 것으로 보였던 baking시료의 DNA양이 flying시료에 비해 많은 것으로 나타났다.
각각의 추출방법에 따라 추출양의 차이가 있지만, 모든 방법에서 거의 비슷한 형상의 DNA가 추출된다는 것을 확인하였다. 5가지 DNA추출방법 중에는 CTAB법을 이용한 방법이 가장 많은 DNA를 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 그러나, 수율이 가장 높은 CTAB법에 의한 DNA추출은 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라, phenol과 chloroibrm 등과 같은 유기용매를 사용해야 한다는 단점을 가지고 있어, QM법이 대체할 수 있는 방법으로 사려된다.
5가지 방법으로 추출된 각각의 DNA를 일정농도(20ng/μl)로 희석하여 template로 이용하고 옥수수의 내재유전자 zSSIIb 유전자14)를 증폭시킬 수 있는 primer를 이용하여 PCR한 결과 거의 차이가 없음을 확인하였다. 다만, PM방법으로 추출된 DNA들의 PCR 결과에서 baking, frymg 가공 조건이 원료나 autoclaving 가공 조건에 비해 매우 적은 PCR 산물을 얻은 것으로 확인되었다(Fig.
1). 5가지 방법으로 추출한 가공시료의 DNA는 분해가 많이 된 분자로 존재하며 모든 추출방법에서 원래의 genomic DNA가 파괴, 분해되어 작은 분자량을 가진 형상의 DNA로 존재하는 것을 확인하였다. 또한, 다른 시료에 비해 가공온도가 높고 가공시간이 길었던 baking의 경우, 다른 가공조건으로부터 분리된 DNA에 비해 더 많이 분해가 일어난 것으로 확인되었다(Fig.
이것으로써 autoclaving, baking, frying 가공은 DNA에 손상을 초래할 뿐만 아니라, 열에 노출된 시간 및 온도가 DNA의 변성에 많은 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다. 각각의 추출방법에 따라 추출양의 차이가 있지만, 모든 방법에서 거의 비슷한 형상의 DNA가 추출된다는 것을 확인하였다. 5가지 DNA추출방법 중에는 CTAB법을 이용한 방법이 가장 많은 DNA를 얻을 수 있는 것으로 나타났다.
결과 거의 차이가 없음을 확인하였다. 다만, PM방법으로 추출된 DNA들의 PCR 결과에서 baking, frymg 가공 조건이 원료나 autoclaving 가공 조건에 비해 매우 적은 PCR 산물을 얻은 것으로 확인되었다(Fig. 3). PCR은 DNA의 특정 염기서열에 상보적인 primer가 결합하여 일어나는 반응이다.
16) 분광광도계에 의한 추출된 DNA의 정량적 분석에서 1 g의 시료를 사용한 가공공정을 거치지 않은 원료 시료와 가공공정을 거친 시료의 경우 모두에서 5가지 DNA추출방법 가운데 CTAB법과 QM방법에 의한 DNA추출방법이 높았으며, 상대적으로 빠른 방법인 PM, PC, IG는 원료 시료에서도 낮은 수율을 보였다(Table 1). 또한, DNA형상에서 가장 많이 분해된 것으로 보였던 baking시료의 DNA양이 flying시료에 비해 많은 것으로 나타났다. 이것은 hying가공에서 사용되었던 oil이 DNA추출을 저해시켰기 때문인 것으로 보인다.
5가지 방법으로 추출한 가공시료의 DNA는 분해가 많이 된 분자로 존재하며 모든 추출방법에서 원래의 genomic DNA가 파괴, 분해되어 작은 분자량을 가진 형상의 DNA로 존재하는 것을 확인하였다. 또한, 다른 시료에 비해 가공온도가 높고 가공시간이 길었던 baking의 경우, 다른 가공조건으로부터 분리된 DNA에 비해 더 많이 분해가 일어난 것으로 확인되었다(Fig. 2). 이러한 결과는 기존에 보고 된 콩 및 가공식품에서의 파괴된 DNA 패턴과 유사한 결과이다.
이것은 hying가공에서 사용되었던 oil이 DNA추출을 저해시켰기 때문인 것으로 보인다. 이것으로써 autoclaving, baking, frying 가공은 DNA에 손상을 초래할 뿐만 아니라, 열에 노출된 시간 및 온도가 DNA의 변성에 많은 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다. 각각의 추출방법에 따라 추출양의 차이가 있지만, 모든 방법에서 거의 비슷한 형상의 DNA가 추출된다는 것을 확인하였다.
가공된 시료의 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 1.8% agarose gel에서 100 volt로 15분간 전기 영동한 결과, 5가지 방법으로 추출한 원료시료의 DNA는 모두 2 kb 이상의 거대분자로 존재하며 유사한 형상의 DNA로 존재하는 것을 확인하였다(Fig. 1). 5가지 방법으로 추출한 가공시료의 DNA는 분해가 많이 된 분자로 존재하며 모든 추출방법에서 원래의 genomic DNA가 파괴, 분해되어 작은 분자량을 가진 형상의 DNA로 존재하는 것을 확인하였다.
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