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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 천연색소인 비트레드의 식품 중 분 석방법을 확립하고자 하였으며, 확립된 분석방법을 적용하여 국내 유통식품 중 비트레드의 사용실태를 조사하고 실제로 사용하고 있거나 사용가능성이 있는 영양보충용식품, 아이스 크림, 소스류, 캔디류, 레토르트식품 등을 대상으로 함유량을 조사하여 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- C18 카트리지칼럼의 Plus sep-pak 및 Sep-pak Vac (3cc)를 비교해본 결과 Plus sep-pak이 색소흡착이 잘되고 완벽히 용출되었으므로 Plus sep-pak 을 선택하여 정제조건을 검토하였다. 보통 역상카트리지칼럼의 활성화는 메탄올과 물 로 하고 용출은 메탄올로 하는 것이 일반적인 방법이나, 비 트레드 사용제품은 다른 색소를 혼용하기도 하기 때문에 처리 시 비트레드성분과 검출시간이 비슷한 물질로부터 순수 한 비트레드 성분만을 분리하기 위해 Ion-pairing시약을 사용한 정제방법을 검토하였다.
- 다. HPLC에 의한 비트레드의 정량분석조건은 역상계 칼럼인 X-terra RP (4.5 mmx250 mm, 5(im)을 이용하고 이동상으로는 0.1% 인산:메탄올 (90:10), 파장조건은 UV 538 nm, 온도는 40℃로 설정하였다.
- TLC에 의한 정성분석 조건검토 - 시판되고 있는 비트레 드색소를 정확히 칭량하여 각각 물, 5% 탄산나트륨:10% 염 산용액:메탄올 (1:1:1) 및 0.1% 인산:메탄올 (90:10)용액에 녹여 10, 000 ppm이 되도록 조제한 액을 표준용액으로서, 아 세톤, 3-메틸-1-부탄올, 에틸메틸케톤, 황산나트륨, 초산에틸, 물, 염산, 옥살산, 메탄설폰산을 전개용매로서 검토하였다. 박 층판의 하단 1.
- 검량선 및 재현성 검토 - 검량선 작성을 위해 비트레드를 100-2, 500 ppm] 되도록 조제하여 Table 1의 조작조건에 따라 HPLC에 주입하여 얻어진 피크면적으로부터 검량선을 작성하였다. 그 결과 Fig.
- 이는 분말 및 정제 (Tablet)상태의 영양보충용식 품 및 캔디류에서 잘 적용되나 소스류 및 레토르트식품 등의 단백질과 지방이 많은 제품은 물로 추출하는데 한계가 있으므로 이를 잘 조절할 수 있는 용매인 메탄올, 염산용액, n-헥산의 비율을 조절하여 추출을 행하여 적합한 결과를 나타내었다. 따라서, 본 연구에서는 여러가지 용매의 조합에 의한 색소의 추출수율을 조사한 결과, 비트레드의 정성 . 정량분석용 시험용액의 추출과정에서 소스, 레토르트식품 및 아이스크림에서는 50% 메탄올:10% 염산용액 :n-헥산 (50:10:50)을 이용하고, 영양보충용식품, 캔디류는 물을 가한 추출방법을 사용하여 양호한 결과를 얻을 수 있었다.
- 따라서, 비트레드색소추출액의 고형 잔여물을 면전여과하고 메탄올과 1% TBA-Br용액 10 ml로 각각 활성화한 C18 카트리지칼럼에 투과한 후, 물 10 ml로 세정하고 1% TBA- Br/메탄올용액 10 ml로 완전히 용출하고 감압건고 (40℃ 이하)하여 물 1 ml 에 용해하여 0.45 gm 실린지 필터로 여과한 액을 시험용액으로 하였다. Fig.
- 물의 양을 늘릴수록 Rf 치가 증가했으나 물의 비율이 너무 많이 증가하면 전개가 잘 이루어지지 않았다. 따라서, 전개용매의 함유조성을 변화시켜 최적 분석조건을 검토한 결과 아세톤:3-메틸-1-부탄올:물 (7:7:6)의 TLC에 의한 정성분석의 용매 조건으로 선택하였다. 다양한 식품 중의 비트레드를 분리하여 나타낸 크로마토그램은 Fig.
- 용출시간 (Retention time)은 메탄올의 혼합비율과 인산의 농도에 따라 분리능이 다르기 때문에 이들 조건의 혼합비율을 변화시켜 색소의 용출시간과 분리능을 비교하였다. 베타닌과 이소베타 닌의 용출시간이 1~2분사이면 검체처리 시 문제 될 소지가 있어, 4분정도로 분리되어 용출되도록 조절하였다. 그 결과, Fig.
- 카트리지칼럼의 Plus sep-pak 및 Sep-pak Vac (3cc)를 비교해본 결과 Plus sep-pak이 색소흡착이 잘되고 완벽히 용출되었으므로 Plus sep-pak 을 선택하여 정제조건을 검토하였다. 보통 역상카트리지칼럼의 활성화는 메탄올과 물 로 하고 용출은 메탄올로 하는 것이 일반적인 방법이나, 비 트레드 사용제품은 다른 색소를 혼용하기도 하기 때문에 처리 시 비트레드성분과 검출시간이 비슷한 물질로부터 순수 한 비트레드 성분만을 분리하기 위해 Ion-pairing시약을 사용한 정제방법을 검토하였다. 비트레드는 산성상태에서 안정하게 칼럼에 잘 흡착하기 때문에 색소추출액에 10% 염산용 액을 2~3방울 넣은 다음에 투과하고, 산성물질에 일반적으로 사용하는 Ion-pairing 시약인 Tetrabutylammonium bromide (TBA-Br)를 0.
- 본 연구에서는 식품 중 비트레드색소의 시험방법을 비트레드임을 확인한 제품을 사용하여 HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography)와 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)로 신속하고 재현성이 높은 비트레드의 시험방법을 확립하였다. 확립된 최적 분석방법을 적용하여 국내유통식품 중 영양보충용식품 60품목, 아이스크림 12품목, 소스류 72품목, 캔디류 48품목, 레토르트식품 12품목 등 총 5종 204 품목을 대상으로 비트레드의 함유량을 시험한 후 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 보통 역상카트리지칼럼의 활성화는 메탄올과 물 로 하고 용출은 메탄올로 하는 것이 일반적인 방법이나, 비 트레드 사용제품은 다른 색소를 혼용하기도 하기 때문에 처리 시 비트레드성분과 검출시간이 비슷한 물질로부터 순수 한 비트레드 성분만을 분리하기 위해 Ion-pairing시약을 사용한 정제방법을 검토하였다. 비트레드는 산성상태에서 안정하게 칼럼에 잘 흡착하기 때문에 색소추출액에 10% 염산용 액을 2~3방울 넣은 다음에 투과하고, 산성물질에 일반적으로 사용하는 Ion-pairing 시약인 Tetrabutylammonium bromide (TBA-Br)를 0.1%, 0.5%, 1%로 각각 비율을 달리하여 색소 흡착, 용출 및 분리도를 비교하였다. 0.
- 가. 시료의 추출방법은 소스류, 레토르트식품 및 아이스크림에서는 50% 메탄올:10% 염산용액:n-헥산 (50 :10:50)을이용하고, 영양보충용식품, 캔디류은 물을 가한 추출방법을 사용하여 양호한 결과를 얻을 수 있었다. 색소의 정제는 C18 카트리지칼럼에 Ion-pairing시약을 사용한 정제방법일 때 가장 양호한 결과를 얻었다.
- 시험조작 - 상기의 조작에 따라 얻어진 비트레드의 표준용 액과 시험용액 각각 10씩을 Table 1의 조작조건에 따라 HPLC에 주입하여 분석을 수행하였다.
- 식품 중 비트레드에 대한 추출수율을 검토하기 위해 영양 보충용식품, 캔디류, 소스, 레토르트식품, 아이스크림 등을 대상품목으로 하여 각각 물, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 클 로로포름 및 50% 메탄올:10% 염산용액:n-헥산의 혼합용액 등의 용매별에 대한 색소의 추출수율을 검토하였다. 비트레 드의 성질은 알코올 및 유기용매 상에 잘 용해되지 않고 물 에 가장 잘 녹기 때문에 물에서 가장 잘 추출됨을 확인할 수 있었다.
- 구연산, 초산, 과염소산은 2분 이내의 빠른 용출 시간과 분리능이 현저하게 떨어졌지만 인산의 경우는 베타닌과 이소베타닌의 피크의 분리가 확실히 나타나 인산을 첨가한 완충용액과 메탄올로 용출시간을 조절하였다. 용출시간 (Retention time)은 메탄올의 혼합비율과 인산의 농도에 따라 분리능이 다르기 때문에 이들 조건의 혼합비율을 변화시켜 색소의 용출시간과 분리능을 비교하였다. 베타닌과 이소베타 닌의 용출시간이 1~2분사이면 검체처리 시 문제 될 소지가 있어, 4분정도로 분리되어 용출되도록 조절하였다.
- 6 mmx250 mm, 5 Rm)칼럼을 선택하여 본 실험에 사용하였다. 이동상 으로는 시료의 급격한 pH변화를 막기 위해 완충용액을 검토하였다. 구연산, 초산, 과염소산은 2분 이내의 빠른 용출 시간과 분리능이 현저하게 떨어졌지만 인산의 경우는 베타닌과 이소베타닌의 피크의 분리가 확실히 나타나 인산을 첨가한 완충용액과 메탄올로 용출시간을 조절하였다.
- 비트레드의 TLC에 의한. 정성분석을 위해서 박층판으로는 순상계의 셀룰로오스 HPTLC, 실리카겔 HPTLC 및 역상계 의 RP-18 HPTLC 등을 각각 이용하고, 전개용매는 아세톤, 3-메틸-1-부탄올, 에틸메틸케톤, 황산나트륨용액, 초산에틸, 물, 염산, 옥살산용액, 메탄설폰산 등의 여러 용매조건과 비 교검토하여 전개시간의 단축과 분리능의 개선실험을 수행하였다. 또한, 비트레드 표준용액도 이동상, 물, 탄산나트륨용 액 등의 여러 용매에 용해하여 실험하였다.
- 조사대상식품인 국내유통 가공식품 중 영양보충용식품, 아이스크림, 소스류, 캔디류, 레토르트식품 등 총 5종 204품목 에 함유된 비트레드의 함유량을 확립된 분석방법으로 시험 하였다. 그 결과 영양보충용식품 60품목에서 900.
- 본 연구에서는 식품 중 비트레드색소의 시험방법을 비트레드임을 확인한 제품을 사용하여 HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography)와 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)로 신속하고 재현성이 높은 비트레드의 시험방법을 확립하였다. 확립된 최적 분석방법을 적용하여 국내유통식품 중 영양보충용식품 60품목, 아이스크림 12품목, 소스류 72품목, 캔디류 48품목, 레토르트식품 12품목 등 총 5종 204 품목을 대상으로 비트레드의 함유량을 시험한 후 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
- 정성분석을 위해서 박층판으로는 순상계의 셀룰로오스 HPTLC, 실리카겔 HPTLC 및 역상계 의 RP-18 HPTLC 등을 각각 이용하고, 전개용매는 아세톤, 3-메틸-1-부탄올, 에틸메틸케톤, 황산나트륨용액, 초산에틸, 물, 염산, 옥살산용액, 메탄설폰산 등의 여러 용매조건과 비 교검토하여 전개시간의 단축과 분리능의 개선실험을 수행하였다. 또한, 비트레드 표준용액도 이동상, 물, 탄산나트륨용 액 등의 여러 용매에 용해하여 실험하였다.
- 1 g을 가하여 10, 000 ppm으로 한 비트레드 표준용액을 박층판에 점적하였다. 또한, 역상계 박층판인 RP- 18F254S를 사용하고 에틸메틸케톤:메탄올:5% 황산나트륨 (1:1:1)의 경우는 빠른 전개가 이루어지나 R£가 1정도로 나타났다. 셀룰로오스 HPTLC를 이용하고 전개용매는 아세톤 :3-메틸-1-부탄올물을 이용한 결과는 RP-18F254S보다 전개시간은 길지만 반점이 선명하게 분리가 잘 일어났다.
- 시료 - 국내유통식품 중 비트레드색소 사용실태를 조사한 결과 식품 중 비트레드색소를 실제로 사용하고 있거나 사용 가능성이 있는 영양보충용식품 60품목, 아이스크림 12품목, 소스류 72품목, 캔디류 48품목, 레토르트식품 12품목 등 총 5종 204 품목을 대상으로 서울, 부산, 대구, 대전, 광주, 전주, 청주, 강릉, 속초에서 각각 구입하여 시료로 사용하였다. 표준품 - 비트레드색소를 (주)엠에스씨에서 제공받아 LC-Mass로 비트레드의 주성분인 베타닌과 이소베타닌을 확인한 후 이를 표준품으로 사용하였다.
- 제품을, Tetrabutylammonium bromide (TBA- Br)는 Junsei Co. 제품을, TLC 박층판은 셀룰로오스 (10x10cm, HPTLC plates, Merck)를, C18 카트리지칼럼은 Sep-pak plus (Waters)를 사용하였다.
- 칼럼은 분석시간의 단축과 분리능 향상을 위해 지금까지색소 분석에 많이 사용한 Capcell Pak C18 보다 Table 1에나타낸 바와 같이 비트레드색소 분리와 특히, 넓은 pH안정성 범위로 분석개발이 양호한 Xterra RP (4.6 mmx250 mm, 5 Rm)칼럼을 선택하여 본 실험에 사용하였다. 이동상 으로는 시료의 급격한 pH변화를 막기 위해 완충용액을 검토하였다.
- 시료 - 국내유통식품 중 비트레드색소 사용실태를 조사한 결과 식품 중 비트레드색소를 실제로 사용하고 있거나 사용 가능성이 있는 영양보충용식품 60품목, 아이스크림 12품목, 소스류 72품목, 캔디류 48품목, 레토르트식품 12품목 등 총 5종 204 품목을 대상으로 서울, 부산, 대구, 대전, 광주, 전주, 청주, 강릉, 속초에서 각각 구입하여 시료로 사용하였다. 표준품 - 비트레드색소를 (주)엠에스씨에서 제공받아 LC-Mass로 비트레드의 주성분인 베타닌과 이소베타닌을 확인한 후 이를 표준품으로 사용하였다.
성능/효과
- 5%, 1%로 각각 비율을 달리하여 색소 흡착, 용출 및 분리도를 비교하였다. 0.1%, 0.5% TBA-Br용 액으로 활성화하고 0.1%, 0.5% TBA-Br 메탄올용액으로 용출하였을 때 흡착과 분리는 잘 일어나나 용출이 완벽히 되 지 않아 회수율이 떨어졌으며, TBA-Br을 1% 첨가하였을 때는 색소흡착, 용출 및 분리가 완전히 일어났다. 한편, 50% 메탄올:10% 염산용액:n-헥산 (50:10:50>의 용매로 추출한 액 은 메탄올이 완전히 제거하지 않은 상태에서 색소추출액을 투과하면 색소흡착이 잘 되지 않으므로 감압건고 시 메탄올 성분을 완전히 제거해야 한다.
- 8에 나타낸 바와 같이 상관계수 (R2)=L0000의 양호한 결과를 얻었다. Table 2는 비트레드에 대한 HPLC 재현성을 검토한 결과를 나타낸 것으로서 비트 레드의 RSD (%)=0.25로 매우 양호한 결과를 얻었다.
- 조사대상식품인 국내유통 가공식품 중 영양보충용식품, 아이스크림, 소스류, 캔디류, 레토르트식품 등 총 5종 204품목 에 함유된 비트레드의 함유량을 확립된 분석방법으로 시험 하였다. 그 결과 영양보충용식품 60품목에서 900.22- 27, 701.60 이 검출되었으며, 캔디류는 48품목 중 30품목에서 21.95~713.40 /g이 검출, 나머지 18품목에서는 불검출이었으며, 아이스크림은 12품목에서 155.85~505.37 gg/g 이 검출되었고, 소스류는 72품목 중 18품목에서 43.52~64.75 fig/g이 검출, 나머지 54품목에서는 검출되지 않았고, 레토르트식품은 12품목에서 모두 검출되지 않았다.
- 베타닌과 이소베타 닌의 용출시간이 1~2분사이면 검체처리 시 문제 될 소지가 있어, 4분정도로 분리되어 용출되도록 조절하였다. 그 결과, Fig. 7에서 보는 바와 같이 0.1% 인산:메탄올 (90:10)의 최적분석조건을 확립하였다.
- 5에서와 같이 5 cm~10 cm의 짧은 전개거리에서 충분히 분리가 가능하였다. 또한 이를 HPTLC 스캐너로 측정한 결과 Fig. 6에서 보는 바와 같이 최대흡수파장이 538 nm이고 R升 일치하여 정확한 정성분석이 가능하였다.
- 1% 인산:메탄올 (90:10)용액에 녹여 10, 000 ppm이 되도록 조제한 액을 표준용액으로서, 아 세톤, 3-메틸-1-부탄올, 에틸메틸케톤, 황산나트륨, 초산에틸, 물, 염산, 옥살산, 메탄설폰산을 전개용매로서 검토하였다. 박 층판의 하단 1.5 cm의 위치에 TLC용 시험용액 및 색소표 준용액을 HPTLC로 직경 4 mm가 되도록 질소가스를 이용하여 점적한 다음 전개 후 얻어진 점의 위치와 색을 자연광 하에서 육안으로 관찰하여 시험용액과 색소표준용액의 R保 를 비교하거나, 이를 HPTLC 스캐너를 이용하여 비트레드임을 확인하였다.
- 라. 분석대상 시료에 대한 비트레드의 회수율은 과자94.84%, 음료 87.48%, 아이스크림 90.25%, 사탕 87.01%로모두 양호한 결과를 얻었다.
- 식품 중 비트레드에 대한 추출수율을 검토하기 위해 영양 보충용식품, 캔디류, 소스, 레토르트식품, 아이스크림 등을 대상품목으로 하여 각각 물, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 클 로로포름 및 50% 메탄올:10% 염산용액:n-헥산의 혼합용액 등의 용매별에 대한 색소의 추출수율을 검토하였다. 비트레 드의 성질은 알코올 및 유기용매 상에 잘 용해되지 않고 물 에 가장 잘 녹기 때문에 물에서 가장 잘 추출됨을 확인할 수 있었다. 이는 분말 및 정제 (Tablet)상태의 영양보충용식 품 및 캔디류에서 잘 적용되나 소스류 및 레토르트식품 등의 단백질과 지방이 많은 제품은 물로 추출하는데 한계가 있으므로 이를 잘 조절할 수 있는 용매인 메탄올, 염산용액, n-헥산의 비율을 조절하여 추출을 행하여 적합한 결과를 나타내었다.
- 비트레드의 주성분인 베타닌과 이소베타닌의 확인 시판되고 있는 비트레드의 주성분인 베타닌 (Betanine, 。226。13=550.48)과 이소베타닌(Isobetanine)을 확인하기 위해 LC-Mass를 이용하여 분석한 결과 여러 참고문헌 에서 보고한 결과와 동일한 패턴구조를 나타냈으며, Fig. 3 에서와 같이 베타닌과 이소베타닌이 각각 10분, 26분에서 분리 검출되고 분자량은 551.3으로 비트레드 성분임을 확인할 수 있었다.
- 시료의 추출방법은 소스류, 레토르트식품 및 아이스크림에서는 50% 메탄올:10% 염산용액:n-헥산 (50 :10:50)을이용하고, 영양보충용식품, 캔디류은 물을 가한 추출방법을 사용하여 양호한 결과를 얻을 수 있었다. 색소의 정제는 C18 카트리지칼럼에 Ion-pairing시약을 사용한 정제방법일 때 가장 양호한 결과를 얻었다.
- 또한, 역상계 박층판인 RP- 18F254S를 사용하고 에틸메틸케톤:메탄올:5% 황산나트륨 (1:1:1)의 경우는 빠른 전개가 이루어지나 R£가 1정도로 나타났다. 셀룰로오스 HPTLC를 이용하고 전개용매는 아세톤 :3-메틸-1-부탄올물을 이용한 결과는 RP-18F254S보다 전개시간은 길지만 반점이 선명하게 분리가 잘 일어났다. 물의 양을 늘릴수록 Rf 치가 증가했으나 물의 비율이 너무 많이 증가하면 전개가 잘 이루어지지 않았다.
- 이상의 결과로 본 시험방법은 시판되고 있는 국내 및 수입식품 중의 비트레드의 정성 및 정량분석에 유용한 방법으로 사료된다.
- 따라서, 본 연구에서는 여러가지 용매의 조합에 의한 색소의 추출수율을 조사한 결과, 비트레드의 정성 . 정량분석용 시험용액의 추출과정에서 소스, 레토르트식품 및 아이스크림에서는 50% 메탄올:10% 염산용액 :n-헥산 (50:10:50)을 이용하고, 영양보충용식품, 캔디류는 물을 가한 추출방법을 사용하여 양호한 결과를 얻을 수 있었다.
- 마. 조사대상식품인 국내유통 가공식품 중 영양보충용식품, 아이스크림, 소스류, 캔디류, 레토르트식품 등 총 5종 204품 목에 함유된 비트레드의 함유량을 확립된 분석방법으로 분석한 결과, 영양보충용식품 60품목에서 900.22-27, 701.60 µg/g이 검출되었으며, 캔디류는 48품목 중 30품목에서21.95~713.40 µg/g이 검출, 나머지 18품목에서는 불검출이었으며, 아이스크림은 12품목에서 155.85~505.37 µg/g이 검출되었고, 소스류는 72품목 중 18품목에서 43.52~64.75 µg/g이 검출, 나머지 54품목에서 검출되지 않았으며, 레토르트식 품은 12품목에서 모두 검출되지 않았다.
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