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문제 정의
- 목 적 : 단백뇨 질환에서 볼 수 있는 사구체 상피세포(glomerular epithelial cells, GEpC) 족 돌기 사이에 위치한 세극막(slit diaphragm)의 P-cadherin의 당뇨조건에 따른 병리학적 변화를 알아보고자 하였다.
- Xu 등[15]은 고농도 당으로 자극한 사구체 족세포에서 PKC를 통하여 P-cadherin 발현이 감소하였 다고 보고하였다. 본 연구자들은 당뇨병성 신병 증을 포함한 단백뇨 질환에서 자주 관찰할 수 있는 GEpC의 세극막 이상에 있어서 AGE와 당에 의한 P-cadherin의 변화를 생체 외 배양실험을 통하여 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 사용한 백서의 P-cadherin sense 의 염기서열은 5'-CTTACAATGGGGTGGTG- G-3'이고, antisense의 염기서열은 5'-GCCAC- GGTGAAATGATCC—3, 이었으며 housekeeper 로서 백서의 GAPDH sense의 염기서열은 5'- CTCTACCCACGGCAAGTTCAA-3, 이고, an- tisense의 염기서열은 5—GGATGACCTTGCC- CACAGC-3'이었고 Bionics(Korea)에 주문 제작하였다. 10X PCR buffer(Intron, Korea), 2.5 mM dNTP(Intron, Korea)과 각각의 특정 prim- er에 증류수를 더하여 전체 양을 50 ㎕-으로 맞 춘 후 94 ℃ 에서 5분간 가열한 다음 94 ℃ 30초, 각각에 맞는 annealing 온도에서 30초간, 72℃ 에서 30초간 30 cycles을 시행하였다. 생성물을 1.
- 48시간 동안 각 조건에서 배양한 GEpC의 RNA를 분리하기 위해 RNA isolation solution 과 chloroform으로 추출 후 isopropanol과 3% sodium acetate, 100% ethanol을 이용하여 pre- cipitation시킨 다음 전체 RNA를 분리하였다. 전체 RNA 5의 농도로 M-MLV reverse tran- scriptase(Intron, Korea) 과 oligo-dT(KDR, Korea), 2.
- Santa Cruz, CA, USA)를 60 분간 반응시키고 TBST로 세척한 후 LumiGLO chemiluminescent substrate를 이용하여 X-ray film에 노출시켰다. Band density를 densitom- etry(LabWorks 4.0, UVP, Inc. Upland, CA, USA)로 각각 측정하여 각 조건의 결과를 비교 하였다.
- P-cadherin에 대한 PCR 생성물을 397 base pairs 에서 확인할 수 있었으며 P-cadherin mRNA의 표현양을 GAPDH mRNA의 표현양으로 교정한 후 B5의 결과에 대한 각 군의 결과를 비교하였다. RT-PCR에 의한 P-cadherin의 band density는 고농도의 당을 첨가한 B30에서 40.
- 세포분획의 단백양을 결정한 후 30을 8% polyacrylamide gradient g이에 분주하고 전기영동으로 분리시킨 후 1-3시간 동안 PVDF membrane에 전사시키고 5% skim milk 를 포함한 TBST로 비특이적인 반응을 억제시켰다. 다음 전술한 polyclonal rabbit anti P~cad- herin(Santa Cruz Biotechnology, Inc. CA, USA) 항체로 실온에서 L5시간 동안 반응시키고 TBST(washling buffer)로 5T0분 간격으로 2-3회 세척한 다음, 이차항체로 HRP conjugated goat anti-rabbit IgG 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA)를 60 분간 반응시키고 TBST로 세척한 후 LumiGLO chemiluminescent substrate를 이용하여 X-ray film에 노출시켰다. Band density를 densitom- etry(LabWorks 4.
- 방 법 : 백서 GEpC을 배양하고 고농도의 당과 후기 당화합물 (advanced glycosylation endproducts, AGE)을 적용하여 당뇨병 환경에 가까운 조건을 설정한 후, P-cadherin 단백양은 Western 분석으로, 유전자 표현의 변화는 RT-PCR로 관찰하였다. 실험군은 당의 농도를 5 또는 30 mM로, AGE와 BSA를 첨가하고 osmotic con- trol로서 당 5 mM에 mannitol 25 mM을 섞은 것을 조합하여 A5, A30, B5, B30, Aosm로 하였다.
- 5 mM dNTP(Intron, Korea), 그리고 증류수로 최종 20로 부피를 맞춘 후 37℃에서 20분간 반응 후 90 ℃ 에서 효소의 반응을 불활성 화시킨 후 합성된 cDNA을 주형으로 RT-PCR 을 수행하였다. 사용한 백서의 P-cadherin sense 의 염기서열은 5'-CTTACAATGGGGTGGTG- G-3'이고, antisense의 염기서열은 5'-GCCAC- GGTGAAATGATCC—3, 이었으며 housekeeper 로서 백서의 GAPDH sense의 염기서열은 5'- CTCTACCCACGGCAAGTTCAA-3, 이고, an- tisense의 염기서열은 5—GGATGACCTTGCC- CACAGC-3'이었고 Bionics(Korea)에 주문 제작하였다. 10X PCR buffer(Intron, Korea), 2.
- 5 mM dNTP(Intron, Korea)과 각각의 특정 prim- er에 증류수를 더하여 전체 양을 50 ㎕-으로 맞 춘 후 94 ℃ 에서 5분간 가열한 다음 94 ℃ 30초, 각각에 맞는 annealing 온도에서 30초간, 72℃ 에서 30초간 30 cycles을 시행하였다. 생성물을 1.5 % agarose gel을 이용하여 각 시료의 PCR 생 성물을 dye을 포함하여 15 ㎕의 양을 전기영동하고 ethidium bromide로 염색하여 UV light 하에서 Polaroid film에 감광시키고 densitom- etry(LabWbrks 4.0, UVP, Inc. Upland, CA, USA)로 각각 측정한 후 GAPDH의 값으로 보정 하였다.
- , 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)# 이용하여 4℃ overnight 시 켜 분리하였다. 세포분획의 단백양을 결정한 후 30을 8% polyacrylamide gradient g이에 분주하고 전기영동으로 분리시킨 후 1-3시간 동안 PVDF membrane에 전사시키고 5% skim milk 를 포함한 TBST로 비특이적인 반응을 억제시켰다. 다음 전술한 polyclonal rabbit anti P~cad- herin(Santa Cruz Biotechnology, Inc.
- : 백서 GEpC을 배양하고 고농도의 당과 후기 당화합물 (advanced glycosylation endproducts, AGE)을 적용하여 당뇨병 환경에 가까운 조건을 설정한 후, P-cadherin 단백양은 Western 분석으로, 유전자 표현의 변화는 RT-PCR로 관찰하였다. 실험군은 당의 농도를 5 또는 30 mM로, AGE와 BSA를 첨가하고 osmotic con- trol로서 당 5 mM에 mannitol 25 mM을 섞은 것을 조합하여 A5, A30, B5, B30, Aosm로 하였다.
- Kreisberg가 성상을 확인하고 공여한 백서의 GEpC를 배양하여 실험에 이용하였다[16, 17]. 유 지 배양액으로는 10% fetal bovine serum(FBS), 16.6 mM Hepes, 3.3 mM L-glutamine, 0.66 unit/mL insulin 그리고 antibiotics를 혼합한 RPMI 1640 배양액(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)을 사용하였고 background# 줄이기 위해 각각의 실험 전에 FBS 0.5%만을 첨가하였다. 배양액 교환은 3일에 한번씩 하였고 계대배양은 0.
- 하여 5 ㎍/mL의 농도로 배양액에 희석하여 투여하였다[18, 20, 21]. 이를 요약하여 배양액 속당의 농도를 5 또는 30 mM로, AGE와 BSA/를 첨가하고 osmotic control로서 당 5 mM 에 mannitol 25 mM을 섞은 것을 조합하여 A5, A30, Aosm, B5, B30으로 group을 지었다[18, 21], 각 군의 의미는 이전 논문에서 상세히 서술 하였다[21, 22].
- 48시간 동안 각 조건에서 배양한 GEpC의 RNA를 분리하기 위해 RNA isolation solution 과 chloroform으로 추출 후 isopropanol과 3% sodium acetate, 100% ethanol을 이용하여 pre- cipitation시킨 다음 전체 RNA를 분리하였다. 전체 RNA 5의 농도로 M-MLV reverse tran- scriptase(Intron, Korea) 과 oligo-dT(KDR, Korea), 2.5 mM dNTP(Intron, Korea), 그리고 증류수로 최종 20로 부피를 맞춘 후 37℃에서 20분간 반응 후 90 ℃ 에서 효소의 반응을 불활성 화시킨 후 합성된 cDNA을 주형으로 RT-PCR 을 수행하였다. 사용한 백서의 P-cadherin sense 의 염기서열은 5'-CTTACAATGGGGTGGTG- G-3'이고, antisense의 염기서열은 5'-GCCAC- GGTGAAATGATCC—3, 이었으며 housekeeper 로서 백서의 GAPDH sense의 염기서열은 5'- CTCTACCCACGGCAAGTTCAA-3, 이고, an- tisense의 염기서열은 5—GGATGACCTTGCC- CACAGC-3'이었고 Bionics(Korea)에 주문 제작하였다.
대상 데이터
- Kreisberg가 성상을 확인하고 공여한 백서의 GEpC를 배양하여 실험에 이용하였다[16, 17]. 유 지 배양액으로는 10% fetal bovine serum(FBS), 16.
데이터처리
- 대조군과 함께 각 항목에 대하여 Western 분석은 5회, RT-PCRe 4회 실험한 후 결과를 비모수적 Mann-Whitney U test 방법으로 통계 처리하였으며 F값이 0.05 미만일 때 통계학적 유의성을 두었다.
성능/효과
- Bands는 118 kD 부위에서 관찰할 수 있었으며 actin양으로 교정한 후 B5 결과를 대조군으로 하여 각 군의 P-cadherin의 band density를 비교하였을 때 당을 첨가한 B30에서 50.4%의 감소 (F<0.01), AGE를 추가한 조건인 A5와 A30에서 각각 7.4%(P<0.05)와 30.4%(P<0.01)의 의미 있는 감소를 보였다(Fig. 2). 이러한 감소 소견은 osmotic control(Aosm)에서는 관찰할 수 없었다.
- P-cadherin에 대한 PCR 생성물을 397 base pairs 에서 확인할 수 있었으며 P-cadherin mRNA의 표현양을 GAPDH mRNA의 표현양으로 교정한 후 B5의 결과에 대한 각 군의 결과를 비교하였다. RT-PCR에 의한 P-cadherin의 band density는 고농도의 당을 첨가한 B30에서 40.3%의 감소CP<0.01), A30에서 27.2%의 의의 있는 감소CP<0.01)를 보였다(Fig. 3). AN] 비하여 A30에서도 의의 있는 감소를 보였다CP< 0.
- 결 과 : P-cadherin 단백양은 B5 결과를 대조군으로 비교하여 당을 첨가한 B30에서 50.4%의 감소, AGE를 추가한 조건인 A5와 A30에서 각각 7.4%와 30, 4%의 의미 있는 감소를 보였다. 또한 P-cadherin mRNA 의 표현은 B30 에서
- 이러한 감소 소견은 osmotic control(Aosm)에서는 관찰할 수 없었다. 따라서 고농도의 당은 GEpC의 P-cadherin 의 단백량을 의미 있게 감소시키고 이는 AGE를 첨가하여도 의미 있게 감소시키며 이는 단순한 삼투압효과가 아닌 당과 AGE에 의한 효과임을 알 수 있었다.
- 따라서 본 연구자가 이전 실험에서 확인한 AGE에 의한 실험적 사구체 여과모델에서의 투과율 증가[39]와 Otero 등[38]의 AGE에 의한 혈관내피세포간 cadherin의 감소와 혈관 투과성의 증가결과와 함께 본 연구에서의 GEpC의 P-cad- heriri에 대한 결과를 종합하면, 당뇨환경에서 사구체투과율의 증가에 있어서 최소한 부분적으로 고농도의 당과 AGE에 의한 P-cadheriri의 유전자 수준에서의 억제에 의한 단백의 생성 감소에 따른 세극막 성분의 변화로서 설명할 수 있을 것이다. P-cadherin 외에도 다른 세극막 관련성분의 변화는 계속 연구 중에 있으며[21, 22], 추후 이의 변화 기전에 대한 연구가 필요하리라 사료된다.
- 이러한 감소 소견은 osmotic control (Aosm)에서는 관찰할 수 없었다. 즉, 고농도의 당은 유전자 수준에서 GEpC의 P-cadherin의 생성을 의미 있게 감소시키고 이는 AGE를 첨가하여도 의미 있게 감소시키며 이는 단순한 삼투압 효과가 아닌 당에 의한 효과임을 알 수 있었다.
후속연구
- 따라서 본 연구자가 이전 실험에서 확인한 AGE에 의한 실험적 사구체 여과모델에서의 투과율 증가[39]와 Otero 등[38]의 AGE에 의한 혈관내피세포간 cadherin의 감소와 혈관 투과성의 증가결과와 함께 본 연구에서의 GEpC의 P-cad- heriri에 대한 결과를 종합하면, 당뇨환경에서 사구체투과율의 증가에 있어서 최소한 부분적으로 고농도의 당과 AGE에 의한 P-cadheriri의 유전자 수준에서의 억제에 의한 단백의 생성 감소에 따른 세극막 성분의 변화로서 설명할 수 있을 것이다. P-cadherin 외에도 다른 세극막 관련성분의 변화는 계속 연구 중에 있으며[21, 22], 추후 이의 변화 기전에 대한 연구가 필요하리라 사료된다.
- 결 론 : 고농도의 당과 AGE에 의한 GEpC의 P-cadherine 유전자 수준에서의 억제로 단백의 생성 감소를 초래함으로써, 당뇨환경에서 세극막 성분의 변화를 설명할 수 있으며, 추후 이의 변화 기전에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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