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문제 정의
- 대식세포는 면역 반응의 초기 반응과 비 특이적 면역반응을 담당하며, LPS 및 IFN-a와 같은 물질에 의하여 특이적 활성이 유도된다. 본 연구는 유산균의 대식세포 활성화 여부를 확인 하 고자 혈관 확장, 신경 전달 및 숙주 방어와 같은 다양한 기능을 갖는 NO의 생성정도와 대식세포의 mediator인 TNF-a의 생성 정도를 조사하였다.
- 이 연구에서 우리는 NO와 TNF-a 생성에 따른 유산균(lactic acid bacteria)의 효과를 알아보기 위하여 murine macrophage 모델로서 RAW 264.7 cell을 사용하여 유산균 (lactic acid bacteria) 투여에 의한 NO와 TNF-a 생성 등에 대한 영향을 조사하여 이를 보고하고자 하였다.
제안 방법
- RAW 264.7 세포주에 세 가지 균주(Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium bi加"河를 각각의 농도별로 처리한 후에, 이를 时]간 동안 배양시켰다.
- 7 cell을 sterile glass-slide chamber(Nunk) 에서 1 x 103 cells/well이 되도록 분주하여 48시간 동안 배양하였다. 48 시간 배양 후 배지를 제거하고, LPS(100 n以m/), Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus 및 Bifidobacterium b诉血m의 세 균주를 각 농도별로 처리하여 48시간 배양하였다. 처리 후 상등액을 제거하여 세포를 고정시킨 후, Diff-Quick Solution(Sysmex corproration, Japan)으로 염색하여 이를 현미 경으로 관찰하였다.
- Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus 및 Bifidobacterium bifidwwi을 농도별로 처리한 RAW 264.7 세포의 배양액을 수확하고, 수확한 배양액과 staimdard를 각각의 well에 100 以씩 첨가한 후에 biotin conjugate를 50 \tl 첨가하여 실온에 서 90분 동안 배양시켰다.
- NO到 농도는 sodium nitrate를 희석시킨 용액에 대한 흡광도 를 측정하여, 이를 토대로 표준곡선을 작성하여 그 결과를 산출 하였다.
- NO는 대식세포의 중요한 mediate이기 때문에, NO 생성에 미 치는 유산균의 영향은 Griess assay를 통해 확인하였다. Raw264.
- Raw 264.7 세포에 의한 TNF・q의 생성에서 유산균이 미치는 효과를 조사하기 위하여 LPS의 존재에 따라 각 균주(Stob如i觸 acidophilus, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum) 를 Raw 264.7세포에 농도별로 처리하여 배양시켰으며, 그 결과 를 Fig. 2에 나타내었다.
- 4번에 걸쳐 세척한 후에, Streptatividin-HRP Working Solutionir 100 乂 첨가하여 실온에서 30분 동안 정치시켰다. 그 후 4차례 더 세척한 후에 stabilized chromogen 100 以을 첨가하 여 다시 30분 동안 암소에서 실온상태로 정치시키고, 여기에 stop solution 100 B을 가한 후에 ELISA 분석을 수행하였다.
- 배양 후 배양액에 분비된 TNF-a를 정량하기 위해서 Mouse TNF-a Immunoassay Kit(BioSource International. Inc., Camarillo, California, USA)를 이용하였다.
- , USA)를 이용하여 혐기 배양하였으며, Lactobacillus acidophilus와 Streptococcus thermophilus^s: 호기 배잉하였다. 세 가지 균체를 24시간 동안 배양한 후에 이를 원심분리하여 상등 액을 얻은 후, 그 상등액을 syringe filterfi- 이용하여 여과멸균 하여 본 실험에 이용하였다.
- 2% naphylenediamine HC1, stock-II: 2% sulfanilamide in 5% H2PO4)7} 사용되었다. 실험방법은 대식세포를 24시간 배양 후 ixio6 cell&mZ의 농도로 96-well plate 에 200 B씩 넣고 LPS를 20ng/mZ 농도로 첨가하고 syringe Slter로 여과한 Lactobacillus acidophilus, Streptococcus themophilus 및 Bifidobacterium bifidum^: 2배씩 희석하여 상등원액에서 25까지의 희석하여 희석액을 첨가 한 후, 이를 18시간 동안 5% CO2 배양기에서 37°C로 배양하였다.
- 1에서 보는 바와 같이 배지만 처리한 group에서는 NO 를 거의 방출하지 않았음을 확인할 수 있다. 이 연구에서 LPS 는 대식세포 활성의 positive control로서 이용되었다. 세 가지 유산균(Lactobacilhcs acidophilus, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum^] 상등액을 처리한 group은 Raw 264.
- 48 시간 배양 후 배지를 제거하고, LPS(100 n以m/), Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus 및 Bifidobacterium b诉血m의 세 균주를 각 농도별로 처리하여 48시간 배양하였다. 처리 후 상등액을 제거하여 세포를 고정시킨 후, Diff-Quick Solution(Sysmex corproration, Japan)으로 염색하여 이를 현미 경으로 관찰하였다.
대상 데이터
- Ltd.(Japan)의 General Anaerobic Medium(GAM) 배지를 사용하였고, Bifidobacterium bijidm 은 Bactron Anaerobic Chamber(Sheldon Manufecturing Inc., USA)를 이용하여 혐기 배양하였으며, Lactobacillus acidophilus와 Streptococcus thermophilus^s: 호기 배잉하였다. 세 가지 균체를 24시간 동안 배양한 후에 이를 원심분리하여 상등 액을 얻은 후, 그 상등액을 syringe filterfi- 이용하여 여과멸균 하여 본 실험에 이용하였다.
- DMEM(Dulbecco's modified Ease's medium) 배지 및 fetal bovine serum(FBS), penicillin(10000 U/mZystreptomydn(10000 U/mZ)(P/S), LPS(Esc/ieric/iia coli, 0127: B8 Westphal type)는 Sigam Chemical Co(St. Louis, Mo. USA)에서 구입하였다.
- RAW 264.7 대식세포주는 삼육대학교 약학과 대학원의 생화 학실험실로부터 분양받아서 이를 nitrogen tank에 보관하였고, 실험에 사용할 세포는 10% fetal bovine serum(FBS), 1% streptomycin(10000 U/m/) 및 penicillin(10000 U/m/)'®: 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 이용하여 37°C CO2 incubator에서 배양하였다.
- 유산균인 Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophUus, Bifidobacterium b脚刎은 (주)쎌바이오텍으로부터 분양받았다. 균체의 배양용 배지는 Nissui Pharm.
- 이 실험을 위하여 96well, LPS(20 ng/mZ), Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum, DMEM 배지, Griess reagent(stock-I: 0.2% naphylenediamine HC1, stock-II: 2% sulfanilamide in 5% H2PO4)7} 사용되었다. 실험방법은 대식세포를 24시간 배양 후 ixio6 cell&mZ의 농도로 96-well plate 에 200 B씩 넣고 LPS를 20ng/mZ 농도로 첨가하고 syringe Slter로 여과한 Lactobacillus acidophilus, Streptococcus themophilus 및 Bifidobacterium bifidum^: 2배씩 희석하여 상등원액에서 25까지의 희석하여 희석액을 첨가 한 후, 이를 18시간 동안 5% CO2 배양기에서 37°C로 배양하였다.
데이터처리
- 연구 결과는 각 군 간의 유의성 검증을 위해 Student's t-test 를 사용하였으며, 유의수준이 P<0.05일 경우 그 결과에 유의성 이 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
- Constituted neuronal NOS(nWOS)와 endothelial NOS(eNOS)와는 다르게 inducible isoform NOS(iNOS)를 통해 활성화된 염증세포들은 nitric oxide를 생성한다.%)낮은 농도에서의 NO는 혈관을 조절 하고 면역 체계를 조절하는 중요한 역할을 한다.23)면역세포에 서 iNOS에 의해 생성된 NO는 다량으로 외부의 자극에 의해 유 전자수준에서 발현되고 주로 침입한 미생물이나 종양세포에 대 해 독성을 갖는 방어물질로서 작용하는 것으로 알려져 있다.
- Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus 및 Sterep- tococcus 0矽初c拼成伽s 의 세 가지 유산균 모두 농도 의존적으로 NO와 TNF-a의 생성 증가에 관여함을 확인할 수 있었고, RAW264.7 세포의 형태 역시 농도 의존적으로 활성화되어 형태가 변화된 것을 관찰할 수 있었다. 식세포의 활성인자인 그람 음성 균의 LPS만 첨가한 group보다 유산균 첨가군에서는 NO와 TNF・a의 생성양이 현저히 많았으며, LPS와 세 가지 유산균 (bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thmnophilus}i: 함께 처리한 group은 대식세포의 NO와 TNF-a 생성에 상승 효과를 나타내어, 세 가지 균주(B甘idobc以。而m bifidum, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus) 만 처리한 group보다 많은 양의 NO와 TNF-o를 생성하는 것으 로 나타났다.
- 7세포와 비교하였을 때, 그 크기가 더 크고 round 형태가 아닌 매끄럽지 못하고 거친 표면을 가진 것으로 확인되었다. LPS와 유산균을 같이 처리한 group은 LPS나 유산균만 처리한 group에 비해서 RAW 264.7 세포의 형태가 더 커지고 더 거칠어져서 이들이 더 많이 활성화되었음을 짐작할 수 있었다.
- LPS 와 세 가지 유산균(玖fidobm야血时 bifidum. Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilusyi: 함께 처리한 group은 대식세포의 NO 생성에서 상승 효과(syn&gic efiect» 나타내어 세 가지 ^^(Pifidobaderium bifidum, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus 所。me幼沏s)각각을 처리한 group보匸} 더 많은 양 의 NO가 생성됨을 확인할 수 있었다.
- 1과 같이 NO 생성이 농도 의존적으로 증가 하였다. 2?배 희석한 Bifidobacterium b酋血, m을 처리하였을 때 positive control group인 LPS(20 ng/m/)만 첨 가한 group 보다 NO의 양^ 현저히 많이 생성되었음을 확인 할 수 있었다. LPS 와 세 가지 유산균(玖fidobm야血时 bifidum.
- 본 연구 결과, LPS를 처리 하지 않은 세포에서의 TNF-a의 생 성이 가장 낮았으며 24배 희석한 Bifidobacterium bifidum^: 처 리한 g2up에서부터는 positive control로써 LPS(lOrWmZ)를 처 리한 group보다 TNF-a의 생성이 농도 의존적으로 점차 증가하 는 것으로 나타났다. Lactobacillus 阪泌philus 와 Streptococcus thermophilus 역시 2。배 희석한 농도에서는 LPSQO ng/m/)만 처 리한 group보다 TNF-a 생성이 증가된 것을 확인 할 수 있었다. 유산균과 LPS(10 ng/mZX 함께 처리한 세포는 유산균만 처리한 세포들보다 TNF.
- 배지만 처리한 정상적인 RAW 264.7 세포는 표면에 아무것도 나타나지 않은 Round 형태로 나타났으며 (Fig. 3a), lOng/m/의 LPS(Fig. 3b)를 처리한 group과 세 가지 유산균(Lactobacillus acidophilus, Streptococcus themophilus, Bifidobacterium bifidum) 의 상등액만 처리한 group에서는 세포 형태에서 약간의 변화가 관찰되었다. 이들은 배지만 처리한 정상적인 RAW 264.
- 본 연구 결과, LPS를 처리 하지 않은 세포에서의 TNF-a의 생 성이 가장 낮았으며 24배 희석한 Bifidobacterium bifidum^: 처 리한 g2up에서부터는 positive control로써 LPS(lOrWmZ)를 처 리한 group보다 TNF-a의 생성이 농도 의존적으로 점차 증가하 는 것으로 나타났다. Lactobacillus 阪泌philus 와 Streptococcus thermophilus 역시 2。배 희석한 농도에서는 LPSQO ng/m/)만 처 리한 group보다 TNF-a 생성이 증가된 것을 확인 할 수 있었다.
- 이 연구에서 LPS 는 대식세포 활성의 positive control로서 이용되었다. 세 가지 유산균(Lactobacilhcs acidophilus, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum^] 상등액을 처리한 group은 Raw 264.7 세포에 배지만 처리한 control group과 비교하였을 때 상대적으로 많은 양의 NO를 생성하였는데, 특히 세 가지 유산균 중 Bifidobacterium bifidum 처리군에서 NO 생성이 가장 많았던 것 으로 나타났다.
- 7 세포의 형태 역시 농도 의존적으로 활성화되어 형태가 변화된 것을 관찰할 수 있었다. 식세포의 활성인자인 그람 음성 균의 LPS만 첨가한 group보다 유산균 첨가군에서는 NO와 TNF・a의 생성양이 현저히 많았으며, LPS와 세 가지 유산균 (bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thmnophilus}i: 함께 처리한 group은 대식세포의 NO와 TNF-a 생성에 상승 효과를 나타내어, 세 가지 균주(B甘idobc以。而m bifidum, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus) 만 처리한 group보다 많은 양의 NO와 TNF-o를 생성하는 것으 로 나타났다.
- Lactobacillus 阪泌philus 와 Streptococcus thermophilus 역시 2。배 희석한 농도에서는 LPSQO ng/m/)만 처 리한 group보다 TNF-a 생성이 증가된 것을 확인 할 수 있었다. 유산균과 LPS(10 ng/mZX 함께 처리한 세포는 유산균만 처리한 세포들보다 TNF.a의 생성이 크게 증가하였다.
- 이와 같은 결과는, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus 및 Bifidobacterium b讯Wm의 세 가지 유산균이 대 식세포를 자극하여 NO와 TNF-a를 생성시켜서 면역 기능을 증 진시킨다는 사실을 시사하고 있는 것으로 사료된다.
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