Corynebacterium glutamicum에서 분리된 프로모터를 이용한 메치오닌 생합성 유전자의 조절해제 Derepression of a Methionine Biosynthetic Gene by Utilizing a Promoter Isolated from Corynebacterium glutamicum원문보기
Corynebacterium glutamicum에서 promoter-probe vector인 pSK1Cat을 이용해 분리된 프로모터를 함유하는 단편들 중 가장 높은 활성을 나타낸 $P_{19}$ 단편에 대한 심도 있는 분석을 수행하였다. Subcloning을 실시하여 프로모터 활성을 지닌 DNA 영역을 180 bp로 압축할 수 있었고 $(P_{180})$, 이를 C. glutamicum의 균주개량 측면에서 그 활용성을 분석하였다. C. glutamicum에서 메치오닌 생합성에 관여하는metX유전자의 메치오닌에 의한 repression을 해제시키기 위하여 metX유전자의 promoter를 $P_{180}$ promoter로 교체하였고 $(P_{180}-metX)$, $P_{180}-metX$를 C. glutamicum에 도입하여 발현되는 homoserine acetyltransferase 활성을 다양한 성장조건에서 측정하였다. MB영양배지에서 배양하는 경 우 $P_{180}-metX$를 함유는 균주는 wild type보다 약 24배 높은 homoserine acetyltransferase 활성을 나타내었다. Tac 프로모터에 연계하는 경우 $(P_{tac}-metX)$, 약 13배의 활성 증가만이 관찰되었다. 최소배지에서 배양한 후 분석한 결과, $P_{180}-metX$에서의 발현양상은 배지에 첨가된 methionine에 의해 영향받지 앓음을 확인하였는데, 이는 $P_{180}$ 단편이 생합성 유전자의 derepression에 의한 아미노산 생산균의 개량에 효율적으로 이용될 수 있음을 의미한다. $P_{180}-metA$를 라이신 생산균에 도입하는 경우 최대 약 0.8g/l의 메치오닌이 생산됨을 확인하였다.
Corynebacterium glutamicum에서 promoter-probe vector인 pSK1Cat을 이용해 분리된 프로모터를 함유하는 단편들 중 가장 높은 활성을 나타낸 $P_{19}$ 단편에 대한 심도 있는 분석을 수행하였다. Subcloning을 실시하여 프로모터 활성을 지닌 DNA 영역을 180 bp로 압축할 수 있었고 $(P_{180})$, 이를 C. glutamicum의 균주개량 측면에서 그 활용성을 분석하였다. C. glutamicum에서 메치오닌 생합성에 관여하는metX유전자의 메치오닌에 의한 repression을 해제시키기 위하여 metX유전자의 promoter를 $P_{180}$ promoter로 교체하였고 $(P_{180}-metX)$, $P_{180}-metX$를 C. glutamicum에 도입하여 발현되는 homoserine acetyltransferase 활성을 다양한 성장조건에서 측정하였다. MB 영양배지에서 배양하는 경 우 $P_{180}-metX$를 함유는 균주는 wild type보다 약 24배 높은 homoserine acetyltransferase 활성을 나타내었다. Tac 프로모터에 연계하는 경우 $(P_{tac}-metX)$, 약 13배의 활성 증가만이 관찰되었다. 최소배지에서 배양한 후 분석한 결과, $P_{180}-metX$에서의 발현양상은 배지에 첨가된 methionine에 의해 영향받지 앓음을 확인하였는데, 이는 $P_{180}$ 단편이 생합성 유전자의 derepression에 의한 아미노산 생산균의 개량에 효율적으로 이용될 수 있음을 의미한다. $P_{180}-metA$를 라이신 생산균에 도입하는 경우 최대 약 0.8g/l의 메치오닌이 생산됨을 확인하였다.
A transcriptionally active fragment $(P_{19})$ isolated by utilizing the promoter-probe shuttle vector pSK1Cat was analyzed. By subcloning analysis, the 180 bp region $(P_{180})$ responsible for the activity was determined. Transcriptional fusion of the C. glutamicum metX gene ...
A transcriptionally active fragment $(P_{19})$ isolated by utilizing the promoter-probe shuttle vector pSK1Cat was analyzed. By subcloning analysis, the 180 bp region $(P_{180})$ responsible for the activity was determined. Transcriptional fusion of the C. glutamicum metX gene to $P_{180}\;(P_{180}-metX)$ resulted in a 24-fold increase in MetX activity in a complex medium, while a 13-fold increase was observed with the $P_{tac}$ promoter. Additionally, the expression conferred by $P_{180}$ was not affected by methionine added to the growth medium, suggesting that the $P_{180}$ clone is useful for the deregulated expression of biosynthetic genes in C. glutamicum during amino acid fermentation. Introduction of $P_{180}-metX$ into a lysine-producing C. glutamicum resulted in the production of methionine to 0.8 g/l.
A transcriptionally active fragment $(P_{19})$ isolated by utilizing the promoter-probe shuttle vector pSK1Cat was analyzed. By subcloning analysis, the 180 bp region $(P_{180})$ responsible for the activity was determined. Transcriptional fusion of the C. glutamicum metX gene to $P_{180}\;(P_{180}-metX)$ resulted in a 24-fold increase in MetX activity in a complex medium, while a 13-fold increase was observed with the $P_{tac}$ promoter. Additionally, the expression conferred by $P_{180}$ was not affected by methionine added to the growth medium, suggesting that the $P_{180}$ clone is useful for the deregulated expression of biosynthetic genes in C. glutamicum during amino acid fermentation. Introduction of $P_{180}-metX$ into a lysine-producing C. glutamicum resulted in the production of methionine to 0.8 g/l.
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문제 정의
gZutamicMm의 산업적인 중요성에도 불구하고 유전 자적 특성은 많이 밝혀졌지만, 그 유전자발현을 조절하는 프로모 터에 대한 정보는 아직까지도 미흡한 수준이며 , 일반적인 프로모 터의 구조와 전형적인 프로모터보존 서열 또한 확립되어 있지 않은 상태이다. 따라서 아미노산 생산을 위하여 생합성 목표유전 자를 증폭하고 외래 유전자를 도입하는 유전공학 기술을 이용하여 transcriptional level에서 목표유전자들을 통제하기 위해서는 우수한 프로모터의 확보와 그 특성이 규명되어야 하는 것이 선 결과제이다.
본 연구에서는 C. glutamicum에서 효율적으로 이용될 수 있는 프로모터 중 활성이 강한 프로모터를 선택해 이에 대한 심도있는 분석을 수행하였다. 특히 메치오닌 생합성의 첫 단계를 매개하는 metX 유전자를 이 프로모터에 연계해 그 응용성을 분석하였고, 동시에 메치오닌 생산에 미치는 영향도 분석하였다.
제안 방법
glutamicume] metX 유전자는 메치오닌 생산경로에서 homoserine을 acetylhomoserine으로 전환시켜주는 homoserine acetyltransferase (HAT)> 발현하는 유전자로, 메치오닌에 의해 강한 repression을 받고 있는 것으로 보고되어 있다(6, 9, 14). C. glutamicum metX 유전자의 프로모터 부위를 P180으로 교체한 뒤, HAT 효소 활성을 측정하여 metX 유전자의 조절기작 해제를 확인하였다(Table 2).
aF를 이용하였다 (Table 1). C. glutamicume 일상적인 경우에 영양배지인 MB 배지(3)에서 배양하였으며, 필요시에는 최소배지로서 MCGC 배지(5, 27)를 사용하여 30℃에서 배양하였으며 경우에 따라서 kanamycin을 15 |ig/ml 혹은 chloramphenicol 10-50)ig/ml 농도로 첨가하여 사용하였다. 최소배지의 배양에 사용된 탄소원은 1% glucose 를 이용하였고, E.
농도 기울기는 기초과학지원연구소의 아미노산 분석조건을 모델로 하여 이를 변형하여 작성하였다. HPLC pump와 UV detector는 각각 영린기기(Kyong-ki, Korea)의 영린 SP930D 용매 이송펌프와 같은 회사의 영린 IV730D 검출기를 사용하였다.
Micro tube에 위에서 준비한 배양액의 상등액(unknown sample)과 각 아미노산의 정량, 정성 분석을 위하여 Amino Acid Standard H (PIERCE, USA)를 각각 25 µl씩 첨가하였다. 그 후 각각에 처리 과정 중의 손실이나 변성 등을 추정할 수 있는 근거가 되는 internal standard로 10 mM DL-norleucine을 동량 첨가 하였다.
P19에 대한 최소 단위의 프로모터 활성 부위를 결정하기 위하여 subcloning을 실시하였다. Subcloning 결과, 프로모터 활성을 그대로 유지하며 또한 본래 pSKlCatP19 클론보다도 오히려 약간 높은 수준의 CAT 활성을 나타내는 0.
glutamicum MH20-22B는 1992년 Schrumpf 등(24)에 의해 개발된 라이신 생산균으로, aspartate로부터 (3-aspartate phosphate로의 전환을 담당하는 aspartate kinase의 feedback inhibition이 해제됨으로서 약 200 mM의 라이신을 생산하는 균으로 알려져 있다(24). 耳河-冰以를 C. glutamicum MH20-22B에 형질전환한 후 메치오닌 생산량의 변화를 관찰하였다(Fig. 2). C.
분석을 원하는 균주를 2% glucose가 함유된 CGIU 영양배지(12) 4 ml에서 전배양하였다. 균주가 stationary phase에 진입하는 시점(약 20시간)에서 15 ml CGin 영양배지를 포함한 250 nd baffled flask에 1/100 (v/v)의 비율로 접종 하였다. 약 20시간 배양 후 균주가 정체기에 진입하는 시기에 균체를 회수하여, 초기 균체 농도 QRoo에서 1이 되도록 60 ml의 CGX fermentation 최소배지(2, 24)을 함유한 500 ml baffled flask에 접종하여 flask scale의 fermentation을 실시하였다.
Micro tube에 위에서 준비한 배양액의 상등액(unknown sample)과 각 아미노산의 정량, 정성 분석을 위하여 Amino Acid Standard H (PIERCE, USA)를 각각 25 µl씩 첨가하였다. 그 후 각각에 처리 과정 중의 손실이나 변성 등을 추정할 수 있는 근거가 되는 internal standard로 10 mM DL-norleucine을 동량 첨가 하였다. 또한 이때 특정 아미노산의 정량, 정성 분석을 위해서 각 아미노산을 농도별 (l~8mM)로 제조하여 동일한 유도체화 과정을 거친후, standard curve를 만들어 분석하였다.
유도체화가 끝난 각각의 시료들을 diluent solution으로 희석하여 Nova-pak C18 Column (Waters Corporation, Massachusetts, USA)을 통해 분리 및 탐지하였다. 농도 기울기는 기초과학지원연구소의 아미노산 분석조건을 모델로 하여 이를 변형하여 작성하였다. HPLC pump와 UV detector는 각각 영린기기(Kyong-ki, Korea)의 영린 SP930D 용매 이송펌프와 같은 회사의 영린 IV730D 검출기를 사용하였다.
그 후 각각에 처리 과정 중의 손실이나 변성 등을 추정할 수 있는 근거가 되는 internal standard로 10 mM DL-norleucine을 동량 첨가 하였다. 또한 이때 특정 아미노산의 정량, 정성 분석을 위해서 각 아미노산을 농도별 (l~8mM)로 제조하여 동일한 유도체화 과정을 거친후, standard curve를 만들어 분석하였다. Rotary vacuum oven을 이용하여 완전히 건조시킨 후, 각각의 시료에 re-dry solution을 가한 후, sonicator를 이용해 완전히 용해하였다.
4 kb Bamin-Pstl 단편을 분리해 이를 같은 제한효소로 절단된 pSKICat 벡터에 삽입하였다. 마지막으로 플라스미드의 1.5 kb cat 유전자를 Kpnl과 Pstl으로 절단해 제거하였고 벡터를 T4 DNA polymerase로 처리한 후 재결합시켜 Pe-metX 클론을 완성 하였다.
아미노산 라이신 생산균으로 알려진 C. glutamicum MH20- 22B를 이용하여 분리된 Pg프로모터 단편의 유용성을 확인하였다. C.
균주가 stationary phase에 진입하는 시점(약 20시간)에서 15 ml CGin 영양배지를 포함한 250 nd baffled flask에 1/100 (v/v)의 비율로 접종 하였다. 약 20시간 배양 후 균주가 정체기에 진입하는 시기에 균체를 회수하여, 초기 균체 농도 QRoo에서 1이 되도록 60 ml의 CGX fermentation 최소배지(2, 24)을 함유한 500 ml baffled flask에 접종하여 flask scale의 fermentation을 실시하였다. 30℃, 250 rpm의 조건에서 배양하면서 정체기 후반, 사멸기 초반까지 일정시간의 간격을 두 고 배양액 1 ml 씩 회수하였다.
Rotary vacuum oven에서 1시간 동안 건조시켜 HPLC를 이용한 분석 직전까지 -20℃ 에서 공기 중의 수분과 차단하여 저장하였다. 유도체화가 끝난 각각의 시료들을 diluent solution으로 희석하여 Nova-pak C18 Column (Waters Corporation, Massachusetts, USA)을 통해 분리 및 탐지하였다. 농도 기울기는 기초과학지원연구소의 아미노산 분석조건을 모델로 하여 이를 변형하여 작성하였다.
최소단위로 제작된 Pg의 활용 가능성을 C. ghaamicion의 메치오닌 생합성에 관여하는 metX 유전자를 이용하여 확인하였다. C.
glutamicum에서 효율적으로 이용될 수 있는 프로모터 중 활성이 강한 프로모터를 선택해 이에 대한 심도있는 분석을 수행하였다. 특히 메치오닌 생합성의 첫 단계를 매개하는 metX 유전자를 이 프로모터에 연계해 그 응용성을 분석하였고, 동시에 메치오닌 생산에 미치는 영향도 분석하였다.
프로모터 영역이 교체된 metX 유전자를 pSKl(pSKlCat에서 cat gene이 deletion된 vector)에 클로닝하여 C. glutamicum AS019E12에서 metX 유전자의 발현에 의한 HAT 활성을 측정하였다. MB 영양배지에서 Ptac을 함유한 pSL365 clone의 경우 약 240 unit의 효소활성을 나타내었고, P180을 함유하는 pSL366의 경우에는 이의 약 2배에 해당하는 440 unit의 효소활성을 나타내었다(Table 2).
플라스미드 pSKlP|80-mEX는 다음과 같이 제작하였다. 플라스미드 pSKICat%의 I%의 프로모터인 약 180 bp 영역을 프라이머 E와 F를 이용해 증폭하였고, 이를 BamHI과 Pwl으로 절단한 후 같은 효소로 절단된 pSKICat에 삽입하여 pSKlCatPet을 완성하였다. 플라스미드 pSL75의 metX 유전자를 프라이머 G와 H 를 이용해 증폭하였고, 이를 PstI과 Kpnl으로 절단한 후 같은 효소로 절단해 cat 유전자가 제거된 pSKlCatP180 삽입하여 P180- metX 클론을 완성하였다.
플라스미드 pSKlPtg-merX는 다음과 같이 제작되었다. 플라스미드 pSL75의 metX 유전자를 프라이머 C와 D (Table 1)를 이용해 증폭하였고, 증폭된 1.2 kb의 단편을 EcoRI과 PM1으로 절단한 후 같은 효소로 절단된 pKK223-3 벡터에 삽입해 플라스미드 pSL314를 제작하였다. Ptac-metX를 함유하는 플라스미드 pSL314 의 1.
플라스미드 pSKICat%의 I%의 프로모터인 약 180 bp 영역을 프라이머 E와 F를 이용해 증폭하였고, 이를 BamHI과 Pwl으로 절단한 후 같은 효소로 절단된 pSKICat에 삽입하여 pSKlCatPet을 완성하였다. 플라스미드 pSL75의 metX 유전자를 프라이머 G와 H 를 이용해 증폭하였고, 이를 PstI과 Kpnl으로 절단한 후 같은 효소로 절단해 cat 유전자가 제거된 pSKlCatP180 삽입하여 P180- metX 클론을 완성하였다.
대상 데이터
염기서열 결정에는 프라이머 A와 B (Table 1)를 이용하였다. 결정된 염기서열 및 주변 서열 정보는 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 이용하였다.
일상적인 형질전환 및 유전자 조작을 위해 Corynebacterium glutamicum AS019E12, Escherichia coli DH5aF를 이용하였다 (Table 1). C.
glutamicume 일상적인 경우에 영양배지인 MB 배지(3)에서 배양하였으며, 필요시에는 최소배지로서 MCGC 배지(5, 27)를 사용하여 30℃에서 배양하였으며 경우에 따라서 kanamycin을 15 |ig/ml 혹은 chloramphenicol 10-50)ig/ml 농도로 첨가하여 사용하였다. 최소배지의 배양에 사용된 탄소원은 1% glucose 를 이용하였고, E. coli의 경우 영양배지로는 LB 배지를 사용하였으며 필요시 M9 최소배지(23)를 이용하여 배양하였다.
이론/모형
glutamicume 형질전환은 Follettie의 방법을 이용하였다(5). C. gWamimm으로부터의 plasmid DNA의 분리는 Yoshihama(27) 방법을 따랐다. 염기 서열 결정은 기초과학지원 연구소(대전)에 의뢰하여 결정하였다.
기본적인 DNA조작은 Molecular Cloning에 기재된 방법으로 수행하였다(23). C. glutamicume 형질전환은 Follettie의 방법을 이용하였다(5). C.
Crude extract는 Jetted Sinskey (8)의 방법에 의해 제작되었고, chloramphenicol acetyltransferase (CAT) 활성은 Shaw 등의 (25) 방법에 의해 측정하였다. 반응액은 100 mM Tris .
흡광도의 변화는 412 nm에서 즉정하였다. Homoserine acetyltransferase (wzeJX)의 활성은 Park 등에 의해 기술된 방법에 따라 측정하였다(14). 단백질 정량은 기술된 방법을 따랐다(1).
Homoserine acetyltransferase (wzeJX)의 활성은 Park 등에 의해 기술된 방법에 따라 측정하였다(14). 단백질 정량은 기술된 방법을 따랐다(1).
gWamimm으로부터의 plasmid DNA의 분리는 Yoshihama(27) 방법을 따랐다. 염기 서열 결정은 기초과학지원 연구소(대전)에 의뢰하여 결정하였다. 염기서열 결정에는 프라이머 A와 B (Table 1)를 이용하였다.
성능/효과
2). C. glutamicum MH20-22B 균 자체는 메치오닌을 거의 생산하지않지만 P180-matX를 도입하는 경우 메치오닌의 생산량이 최대 약 0.8g/l에 달함을 확인할 수 있었다. 메치오닌의 생산의 최대량에 도달한 후 급격한 감소가 일어나는데 이는 메치오닌이 재흡수 될 수 있음을 암시한다.
P19에 대한 최소 단위의 프로모터 활성 부위를 결정하기 위하여 subcloning을 실시하였다. Subcloning 결과, 프로모터 활성을 그대로 유지하며 또한 본래 pSKlCatP19 클론보다도 오히려 약간 높은 수준의 CAT 활성을 나타내는 0.6 kb 절편을 함유하는 클론을 분리하였고, 계속된 subcloning을 통해 강력한 프로모터 할성을 보이는 180 bp의 절편 P180을 획득하였다(Fig. 1).
coli에서 강력한 프로모터 중의 하나로 알려진 Ptac보다 2배 정도 강한 HAT 활성을 나타내는 것으로 확인 되었는데, 이는 P180의 이용가능성을 증대시켜 주는 것으로 판단된다. 대부분의 발효공정이 대사산물에 의하여 배지 내에 아미노산을 다량 함유하고 있는 조건에서 수행되므로 메치오닌에 의한 repression을 받지 않는 PK0-metX clonee 아미노산 생산을 위한 발효공정에서 유전자의 증폭에 유용하게 이용될 것으로 판단되었다.
이는 본래의 metX 프로모터가 메치오닌 등의 아미노산이 다량으로 함유된 배지에서 강력한 repression을 받는 반면, Ptac 프로모터와 P180 프로 모터는 메치오닌 등의 아미노산이 다량으로 함유된 배지에서 repression을 받지 않거나 혹은 최소 수준의 repression받는다는 사실을 보여주며, 또한 P180 프로모터를 가진 metX 클론이 MCGC 최소배지와 MB 영양배지에서 모두 발현되고 강한 HAT 활성을 가짐으로써 P18o 프로모터가 성장 단계에서 일정하게 항상 발현된다는 사실을 함께 나타내는 것으로 여겨진다. 또한 E. coli에서 강력한 프로모터 중의 하나로 알려진 Ptac보다 2배 정도 강한 HAT 활성을 나타내는 것으로 확인 되었는데, 이는 P180의 이용가능성을 증대시켜 주는 것으로 판단된다. 대부분의 발효공정이 대사산물에 의하여 배지 내에 아미노산을 다량 함유하고 있는 조건에서 수행되므로 메치오닌에 의한 repression을 받지 않는 PK0-metX clonee 아미노산 생산을 위한 발효공정에서 유전자의 증폭에 유용하게 이용될 것으로 판단되었다.
P19 클론의 오른쪽 3' 부분은 hypothetical membrane protein의 프로모터로 여겨지는 부분이 함유되어 있다. 염기서열을 분석한 결과 -10과 -35에 각각 TAGACT와 TTTCCA가 발견되었는데 이들은 염기서열의 유사성에 비주어 hypothetical membrane protein의 프로모터로서 작용할 것으로 예상되었다. 그러나, 이들 서열이 실제로 프로모터로 작용할 것인지는 보다 심도있는 연구에 의해 증명되어야 할 것이다.
MCGC 최소배지에서는 본래의 metX 프로모터의 경우 repressing 조건과 derepressing 조건에서 약 20배의 활성 차이를 나타낸 반면에, Ptac과 P180 프로모터를 함유하는 metX 유전자는 2배 정도의 활성 차이만을 나타내었다. 이는 본래의 metX 프로모터가 메치오닌 등의 아미노산이 다량으로 함유된 배지에서 강력한 repression을 받는 반면, Ptac 프로모터와 P180 프로 모터는 메치오닌 등의 아미노산이 다량으로 함유된 배지에서 repression을 받지 않거나 혹은 최소 수준의 repression받는다는 사실을 보여주며, 또한 P180 프로모터를 가진 metX 클론이 MCGC 최소배지와 MB 영양배지에서 모두 발현되고 강한 HAT 활성을 가짐으로써 P18o 프로모터가 성장 단계에서 일정하게 항상 발현된다는 사실을 함께 나타내는 것으로 여겨진다. 또한 E.
후속연구
염기서열을 분석한 결과 -10과 -35에 각각 TAGACT와 TTTCCA가 발견되었는데 이들은 염기서열의 유사성에 비주어 hypothetical membrane protein의 프로모터로서 작용할 것으로 예상되었다. 그러나, 이들 서열이 실제로 프로모터로 작용할 것인지는 보다 심도있는 연구에 의해 증명되어야 할 것이다.
또한 methionine 생산은 탄소원의 소비와도 밀접한 관계가 있음을 암시한다. 이러한 결과는 Piso 프로모터 단편의 효용성을 확인 시켜줌과 동시에 P180을 이용한 특정 metabolite의 생산 및 생합성 유전자의 증폭에 의한 생산성 향상 등에 이 단편이 유용하게 이용될 수 있음을 의미한다.
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