Recently, we reported that high extracellular calcium increased receptor activator of nuclear factor-${\kappa}B$ ligand (RANKL) expression via p44/42 mitogen-activated protein kinase (p44/42 MAPK) activation in mouse osteoblasts. However, the mechanism for p44/42 MAPK activation by high e...
Recently, we reported that high extracellular calcium increased receptor activator of nuclear factor-${\kappa}B$ ligand (RANKL) expression via p44/42 mitogen-activated protein kinase (p44/42 MAPK) activation in mouse osteoblasts. However, the mechanism for p44/42 MAPK activation by high extracellular calcium is unclear. In this study, we examined the role of intracellular calcium increase in high extracellular calcium-induced RANKL induction and p44/42 MAPK activation. Primary cultured mouse calvarial osteoblasts were used. RANKL expression was highly induced by 10 mM calcium treatment. Ionomycin, a calcium ionophore, also increased RANKL expression and activated p44/42 MAPK. U0126, an inhibitor of MEK1/2, an upstream activator of p44/42 MAPK, blocked the RANKL induction by both high extracellular calcium and ionomycin. High extracellular calcium increased the phosphorylation of proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2), one of the known upstream regulators of p44/42 MAPK activation. Bisindolylmaleimide, an inhibitor of protein kinase C, did not block RANKL induction and p44/42 MAPK activation induced by high extracellular calcium. 2-Aminoethoxydiphenyl borate, an inhibitor of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) receptor, blocked the RANKL induction by high extracellular calcium. It also partially suppressed the activation of Pyk2 and p44/42 MAPK. Cyclosporin A, an inhibitor of calcineurin, also inhibited high calcium-induced RANKL expression in dose dependent manner. However, cyclosporin A did not affect the activation of Pyk2 and p44/42 MAPK by high extracellular calcium treatment. These results suggest that 1) the increase in intracellular calcium via IP3-mediated calcium release is necessary for RANKL induction by high extracellular calcium treatment, 2) Pyk2 activation, but not protein kinase C, following the increase in intracellular calcium might be involved in p44/42 MAPK activation, and 3) calcineurin-NFAT activation by the increase in intracellular calcium is involved in RANKL induction by high extracellular calcium treatment.
Recently, we reported that high extracellular calcium increased receptor activator of nuclear factor-${\kappa}B$ ligand (RANKL) expression via p44/42 mitogen-activated protein kinase (p44/42 MAPK) activation in mouse osteoblasts. However, the mechanism for p44/42 MAPK activation by high extracellular calcium is unclear. In this study, we examined the role of intracellular calcium increase in high extracellular calcium-induced RANKL induction and p44/42 MAPK activation. Primary cultured mouse calvarial osteoblasts were used. RANKL expression was highly induced by 10 mM calcium treatment. Ionomycin, a calcium ionophore, also increased RANKL expression and activated p44/42 MAPK. U0126, an inhibitor of MEK1/2, an upstream activator of p44/42 MAPK, blocked the RANKL induction by both high extracellular calcium and ionomycin. High extracellular calcium increased the phosphorylation of proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2), one of the known upstream regulators of p44/42 MAPK activation. Bisindolylmaleimide, an inhibitor of protein kinase C, did not block RANKL induction and p44/42 MAPK activation induced by high extracellular calcium. 2-Aminoethoxydiphenyl borate, an inhibitor of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) receptor, blocked the RANKL induction by high extracellular calcium. It also partially suppressed the activation of Pyk2 and p44/42 MAPK. Cyclosporin A, an inhibitor of calcineurin, also inhibited high calcium-induced RANKL expression in dose dependent manner. However, cyclosporin A did not affect the activation of Pyk2 and p44/42 MAPK by high extracellular calcium treatment. These results suggest that 1) the increase in intracellular calcium via IP3-mediated calcium release is necessary for RANKL induction by high extracellular calcium treatment, 2) Pyk2 activation, but not protein kinase C, following the increase in intracellular calcium might be involved in p44/42 MAPK activation, and 3) calcineurin-NFAT activation by the increase in intracellular calcium is involved in RANKL induction by high extracellular calcium treatment.
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문제 정의
GPCR이 EGFR을 transactivation 하는 과정에 세포내칼슘 증가, proline-rich tyrosine kinase 2(Pyk2), protein kinase C(PKC), Src, 활성화산소종 등이 관여함이 보고된 바 있다(Wetzker와 Bohmer, 2003). 따라서 본 연구에서는 고농도 세포외칼슘에 의한 RANKL 발현과 p44/42 MAPK 활성화에 세포내칼슘 증가와 Pyk2 인산화가 관여하는지 알아보고자 하였다.
본 연구에서는 고농도 세포외칼슘에 의한 p44/42 MAPK 활성화 기전을 알아보고자 하였다. CaSR을 발현하는 세포에 고농도 세포외칼슘을 처리한 경우 phospholipase C 와 PKC 활성화를 통해 p44/42 MAPK 활성화가 이루어진다고 알려져 있으나(Kifor 등, 2001; Sakwe 등, 2004), 본 연구에서는 PKC 억제제가 p44/42 MAPK 활성화와 RANKL 발현에 아무런 영향을 미치지 않았다.
제안 방법
2B). GPCR 이 EGFR을 transactivation하는 과정에 Pyk2 활성화가 관여하며, 세포 내 칼슘 증가에 의해 Pyk2 활성화가 유도되는 것£로알려져 있으므로(Tahara 등, 2001; Wetzker와 Bohmer, 2003), 고농도 세포외칼슘과 2-APB 처리가 Pyk2활성화에 미치는 영향을 관찰하였다. p44/42 MAPK와 비슷호卜 게 고농도 세포외칼슘 처리 후 5분째 Pyk2 인산화가 증가되었으며, 2-APB에 의해 그 정도가 감소되었다(Fig.
PCR 조건과 primei서열은 Table 1과 같다. PCR이 끝난 후 10 卩1를 1.2% agarose gel에서 전기영동 하고 ethidium bromide 로 염색하여 PCR 산물을 확인하였다.
4°C에서 14, 000 rpm으로 15분 동안 원심분리한 우 supernatant를 모아서 BCA ki1을 이용해서 단백질 농도를 측정하였다, 20 卩醐 단백질 샘플을 4-12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gradient gel에 전기영동하고, PVDF membrane에 electrotransf&하였다. p44/42 MAPK, 활성화된 형태인 phospho-p44/42 MAPK, Pyk2와 활성화된 형태인 phospho-Pyk2에 대한 일차 항체를 이용하여 immunoblotting을 시행하였으며, 마지막 단계에서 Supersignal chemiluminescent substrate를 넣어 반응시킨 후 전산화영상장치인 Las plus(Fuji Photo Film Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 산물을 확인하였다.
골모세포는 생후 2-3일된 생쥐에서 전두골과 두정골을 분리하고 0.1% crude collagenase, 0.05% trypsin 및 0.5 mM EDTA로 구성된 효소용액에서 10분, 10분, 10분, 20분, 20분, 20분 씩 연속적으로 효소처리하여 I〜VI군의 골 세포군을 분리하고, 이중 골모세포의 형질을 가진 세포가 많은 것으로 알려진 IV〜VT군의 세포를 모아 10% FBS가 함유된 DMEM에서 배양하였으며, 일차 계대배양후 각 실험에 사용하였다.
골모세포를 60 mm dish에 5X 10, 개 씩 분주하고 다음날 1% FBS가 함유된 DMEM으로 배양액을 바꾼 후 고농도 세포외칼슘(10 mM), ionomycin (1 pM)은 8시간 동안 처리하였으며 MEK1/2 억제제인 U0126, PKC 억제제인 bisindolylmaleimide, IP3 receptor 억제제인 2- APB, calcineurin 억제제인 cyclosporin A를 처리하는 경 £세는 다른 약물처리 1시간 전부터 첨가하여 배양하였다.
배양하였다. 그 후 U0126, bisindolylmaleimide, 2-APB, cyclosporin A 등으로 1시간 전처치하거나 하지않고 고농도 세포외칼슘(10mM)을 5〜30분간 처리한 후 p44/42 MAPK 또는 PykQ가 활성화되는지 확인하기 위해 Western blot 분석을 시행하였다. Phosphate-bufiered saline에 두 번씩 세척하고 세포를 PBS-TDS lysis buffer (0.
배양이 끝난 세포로부터 easy-BLUE^M을 이용하여 total RNA를 분리하였으며, 1卩g의 total RNA로부터 1U superscript reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성하고, 이 중 10%의 cDNA를 이용하여 2U의 Takara Taq, PCR buffer, 0.8 mM dNTP, 100 pM의 primer가 혼합된 용액 50 |il에서 PCR을 시행하였다. PCR 조건과 primei서열은 Table 1과 같다.
세포내칼슘이 증가하면 calcineurin이 활성화되어 nuclear factor of activated T cells(NFAT)의 인산화를 유도하고 핵으로의 이동을 촉진하여 여러 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있으므로(Hogan 등, 2003), calcineurin 억제제로 작용하는 cyclosporin A를 처리하여 그 효과를 관찰하였다. Cyclosporin A도 농도의존적으로 고농도 세포 외 칼슘에 의한 RANKL 발현을 크게 억제하였으며, 또한 RANKL의 basal expression丘 감소시켰다(Fig.
또한 고농도 세포외칼슘을 처리했을 때 p44/42 MAPK 활성화와 유사한 시간대에 Pyk2 인산화가 증가하였으며, 2-APB 처리에 의해 Pyk2 인산화와 p44/42 MAPK 활성화가 부분적으로 억제되었으므로, 고농도 세포외 칼슘에 의한 p44/42 MAPK 활성화에 Pyk2가 관여할 수 있을 것으로 생각된다. 2-APB에 의한 RANKL 발현 억제 효과에 비해 p44/42 MAPK나 Pyk2 인산화에 대한 억제 효과는 적게 나타났으며, 그 차이가 나타나는 이유는 명확하지 않았다. 한가지 가능성은 고농도 세포외칼슘 처리에 의해 증가된 세포내칼슘이 p44/42 MAPK 활성화 이외에 또다른 타겟에 작용하여 RANKL 발현을 조절할 가능성이 있는 것으로 생각되었다.
Calcineurin 억제제인 cyclosporin A가 사람 골수기질세포에서 RANKL의 발현을 약간 증가시킨다는 보고가 있, 어(Hofbauer 등, 2001), 고농도 세포외칼슘에 의한 RANKL 발현에 cyclosporin A가 미치는 효과를 관찰하였다. Cyclosporin A는 고농도 세포외칼슘에 의한 RANKL의 발현 증가를 거의 완전히 억제하였으며, RANKL basal expression 정도도 억제하였다. 그러나 Pyk2 인산화와 p44/42 MAPK 활성화에는 별다른 억제효과를 나타내지 않았다.
Cyclosporin A도 농도의존적으로 고농도 세포 외 칼슘에 의한 RANKL 발현을 크게 억제하였으며, 또한 RANKL의 basal expression丘 감소시켰다(Fig. 3A). 그러나 cyclosporin A는 p44/42 MAPK, Pyk2의 활성화에는 별다른 효과를 미치지 않았다(Fig.
본 연구에서 calcium ionophore에 의해서 p44/42 MAPK 활성화와 RANKL 발현증가가 이루어지며 , 고농도 세포외칼슘에 의한 RANKL 발현 증가가 2-APB에 의해 거의 억제된 결과는, 골 모세포에서 고농도 세포외칼슘에 의한 RANKL 발현 증가에는 IP3를 매개로 세포내 저장소에서 칼슘이 유리됨에 의해 세포내칼슘 농도가 증가됨이 필요함을 시사하고 있다. 또한 고농도 세포외칼슘을 처리했을 때 p44/42 MAPK 활성화와 유사한 시간대에 Pyk2 인산화가 증가하였으며, 2-APB 처리에 의해 Pyk2 인산화와 p44/42 MAPK 활성화가 부분적으로 억제되었으므로, 고농도 세포외 칼슘에 의한 p44/42 MAPK 활성화에 Pyk2가 관여할 수 있을 것으로 생각된다. 2-APB에 의한 RANKL 발현 억제 효과에 비해 p44/42 MAPK나 Pyk2 인산화에 대한 억제 효과는 적게 나타났으며, 그 차이가 나타나는 이유는 명확하지 않았다.
또한 심근세포에서 세포 내 칼슘이 증가되면 Pyk2 인산화를 통해 EGFR을 활성화하고 그를 통해 p44/42 MAPK 활성화를 야기한다는 보고(Tahara 등, 2001)와 골모세포에서 기계적 자극에 의한 p44/42 MAPK 활성화 과정이 Pyk2 인산화에 의해 매개된다는 보고(Boutahar 등, 2004)로 미루어볼 때 골 모세포에서도 Pyk2 인산화가 p44/42 MAPK 활성화에 관련될 수 있을 것으로 생각되었다. 본 연구에서 calcium ionophore에 의해서 p44/42 MAPK 활성화와 RANKL 발현증가가 이루어지며 , 고농도 세포외칼슘에 의한 RANKL 발현 증가가 2-APB에 의해 거의 억제된 결과는, 골 모세포에서 고농도 세포외칼슘에 의한 RANKL 발현 증가에는 IP3를 매개로 세포내 저장소에서 칼슘이 유리됨에 의해 세포내칼슘 농도가 증가됨이 필요함을 시사하고 있다. 또한 고농도 세포외칼슘을 처리했을 때 p44/42 MAPK 활성화와 유사한 시간대에 Pyk2 인산화가 증가하였으며, 2-APB 처리에 의해 Pyk2 인산화와 p44/42 MAPK 활성화가 부분적으로 억제되었으므로, 고농도 세포외 칼슘에 의한 p44/42 MAPK 활성화에 Pyk2가 관여할 수 있을 것으로 생각된다.
1C, D). 세포 내 칼슘증가가 RANKL 발현을 유도하는지 확인하고자 calcium ionophore인 ionomycin을 처리해준 경우 RANKL 발현이 크게 증가하였으며, 이러한 발현 유도효과는 U0126 에 의해 억제되었다(Fig. IE). 또한 ionomycin도 p44/42 MAPK 활성화를 유도하였으나, 고농도 세포외칼슘을 처리해준 경우 5분에 최대로 활성화되었다가 그 이후 감소되는 양상을 보인데 반해 ionomycin은 30분까지 지속적으로 p44/42 MAPK 활성화 상태를 유지하였다(Fig.
1A, B). 이러한 RANKL 발현 증가는 MEK1/2 억제제인 U0126을 처리하여 p44/42 MAPK 활성화를 억제하면 거의 완전히 억제되었다. Takami 등(2000)은 이러한 고농도 세포외칼슘의 효과가 세포내 칼슘 증가/PKC 활성화에 의한 것이라고 했기 때문에, PKC 억제제인 bisindolylmaleimidef- 첨가하고 고농도 세포외칼슘의 효과를 관찰하였다.
이상의 결과를 종합하면, 골모세포에 고농도 세포 외 칼슘을 처리하면, 세포내 칼슘 저장소에서 칼슘이 유리되어 세포 내 칼슘 농도가 증가되며, 이를 통해 Pyk2 인산화와 p44/42 MAPK 활성화가 일어나고, calcineurin/NFAT이 활성화되어 RANKL 발현이 증가되는데 기여할 것으로 생각되었다.
2-APB에 의한 RANKL 발현 억제 효과에 비해 p44/42 MAPK나 Pyk2 인산화에 대한 억제 효과는 적게 나타났으며, 그 차이가 나타나는 이유는 명확하지 않았다. 한가지 가능성은 고농도 세포외칼슘 처리에 의해 증가된 세포내칼슘이 p44/42 MAPK 활성화 이외에 또다른 타겟에 작용하여 RANKL 발현을 조절할 가능성이 있는 것으로 생각되었다.
최근의 보고들은 활성화된 p44/42 MAPK가 AP-1 활성화를 통하거나, NFAT의 인산화를 통해, 또는 NFAT tran scription activation complex에 p44/42 MAPK가 포함되어 NFAT에 의한 transcription activity를 증가시킴을 제시하였다(Sanrma 등, 2005; Yang 등, 2005). 현재까지 RANKL promoter에서 NFAT 또는 AP-1 결합 부위 존재에 대한 보고는 없었으며, calcineurin/NFAT과 p44/42 MAPK가 RANKL 발현을 어떻게 조절하는지 현재로는 설명할 수 없지만, 본 연구결과로 보아 이 두가지가 상호의존적으로 RANKL 발현 조절에 관여될 것으로 생각되었다.
참고문헌 (28)
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