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문제 정의
- 이 nitrogenase는 ammonium ion이 존재할 때, PII 계 열 단백질인 GlnB와 GlnK에 의해 negative regulation을 받게 된다. 본 연구에서는 와 glnK 유전자를 interruption하여 수소생성의 증진을 꾀하였다. 그 결과, parental strain이나 glnB 혹은 glnK 유전자 하나만을 interruption 시켰을 경우, 암모니움 이온에 의해 nitrogenase 활성이 저해를 받고 있었 으나, glnB, glnK 모두를 interruption 시켰을 때, 암모니움 이 온에 의한 저해 효과가 줄어드는 것을 볼 수 있었다 또한 이러한 glnB-glnK double mutant에 nifHDK gene을 in trans로 넣어 nitrogenase의 dosage를 높였을 경우, 수소 생성이 약 30% 가량 증진되었다는 것을 볼 수 있었다.
제안 방법
- Nitrogenase 에 의해 환원된 ethylene gas의 양은 gas chromatography (Shimadzu 17A)를 이용해서 측정했다. Column (2 mm x 2 m) 은 Porapack type 日로 충진한 후 사용하였으며, flame-ionization detector (FID)로 분석하였다. Carrier gas는 flow rate이 40 mL/min가 되도록 했으며 N2 gas를 사용하였다.
- 8% agarose gel에 전기영동하고 Hybond-N membrane (Amersham, UK) 에 blotting을 했다(2). DNA를 UV-cross linking을 통해 고 정시킨 후, probe 표지와 검출은 Gene Images (Amersham, UK)를 사용하여 X-ray film (Agfa, Belgium)에 현상하였다.
- HP1과 HP1에서 유래된 변이주 HPlAglnK, HPlAglnB, HPM잉nBK를 광합성 조건에서 배양하여 수소 생성을 측정 했다(Fig. 3-6). 각 균주의 성장 속도는 큰 차이 없으나, 암 모니움 이온이 존재하지 않을 때, 최대 KIM] 늦게 도달한 다는 것을 알 수 있었다(Fig.
- 3)로 분석하였다. Molecular sieve 5A (Supelco)로 충진된 2 mm x 2 m columml을 사용했으며, thermal conductivity detector (TCD)로 분석하였고, cmier gas (flow rate : 50 ml/min)는 Ar을 사용하였다. Column 온 도는 80℃, injector 온도 100℃, detector 온도 120℃이었다(12).
- 이후, 기질로서 acetylene gas를 vial 개스 층의 10% 부피에 해당되는 양으로 주입한다. Nitrogenase 에 의해 환원된 ethylene gas의 양은 gas chromatography (Shimadzu 17A)를 이용해서 측정했다. Column (2 mm x 2 m) 은 Porapack type 日로 충진한 후 사용하였으며, flame-ionization detector (FID)로 분석하였다.
- 1). R. sphaeroides 241의 염색체 DNA> template로 g/z/B의 upstream과 downstream을 포함하는 약 2.3-kb 의 DNA 부분을 PCR (polymerase chain reaction)하여 pGEM-T ez vector에 cloi血g하여 확보했다. glnB 유전자 내의 243-bp의 Pstl-Nsil DNA를 제거하기 위충)] 451-bp의 Sacl-PstI DNA와 217-bp의 NsH-Sall DNA를 pLOl suicide plasmid (Km「)에 클로닝해서 재조합 plasmid인 pLOA 이曲를 제조했다.
- glnB mutant를 제작하기 위해 glnB 유전자 내의 243-bp의 Pstl-Nsil DNA 지역을 제거시킨 후 (Fig. 1), 668-bp 의 SaclI-Sall 절편(Fig. 1A, 굵은 선)을 pLOl plasmid (Km「)에 cloning하여 pLOAglnB를 만들었다. 이를 본 연구의 모균주로 사용한 HP1에 이동시켜 single crossover 유도했다.
- 3-kb 의 DNA 부분을 PCR (polymerase chain reaction)하여 pGEM-T ez vector에 cloi血g하여 확보했다. glnB 유전자 내의 243-bp의 Pstl-Nsil DNA를 제거하기 위충)] 451-bp의 Sacl-PstI DNA와 217-bp의 NsH-Sall DNA를 pLOl suicide plasmid (Km「)에 클로닝해서 재조합 plasmid인 pLOA 이曲를 제조했다. Pstl, Nsil site는 PCR로 DNA fragment를 얻을 때 임의로 만들었다.
- 2). glnB-glnK double mutant (HP1 AglnBK)는 HPlAglnB strain을 사용하여 위와 같은 방법으로 glnK를 파괴했고 그 염색체 구조도 확인했다(Fig. 2).
- glnB는 downstream에 glutamine synthetase를 코딩하는 glnA 유전자와 operon을 이루기 때문에 polar effect를 피하기 위해 항생제 marker를 사용하지 않고 in-frame deletion mutant를 제작하였다(Fig. 1). R.
- Single crossover의 exconjugant로 부터 double crossover의 재조합 균주, HPlAgln沮는 15%sucrose가 함유된 Sistrom 배지에서 선별했다(15, 16). glnK mutant# 얻기 위해, glnK 유전자의 C-말단 부분에 해당하는 77-bp의 Bglll-Smal DNA 지역을 제거시킨 후 (Fig. 2), 1, 291-bp의 Pstl-Xhol 절편(Fig. 2A, thick line)을 suicide vector인 pLOl (Km「)에 cloning하여 pLOAghiK를 만 들었다. 이 plasmid를 사용해서 위와 사실상 동일한 방법에 의해, glnK mutant인 HPMglnK를 얻었다.
- Pstl, Nsil site는 PCR로 DNA fragment를 얻을 때 임의로 만들었다. pLOAglnB를 HP1에 이동시켜 single crossover (Km1) 를 유도했고, 이것을 다시 15% sucrose 가 함유된 Sistrom's medium 에 도말하여 levan sucrase (sacE)에 의한 levan 형성을 통한 negative selection 을 통해 double crossover (Kn?)를 얻어냈다. 이 double crossover의 염색체 구조는 Southern hybridization analysis로 확인했다.
- 광합성 조건에서 성장한 세포 (80-100 KU)를 side-arm serum vial (60-70 ml)에 800 μ1을 접종한 후 총량이 8 ml 이 되게 변형된 조성의 Sistrom's medium을 채웠다. 그리고 rubber cap을 씌운 후, 1분간 vacuum을 걸어주고, argon gas (Ar)로 내부공기를 1분간 치환하였다.
- 균주 HP1, HPlAglnK, HPlAglnB, HPlAglnBK 의사)romosomal DNA를 분리하여, 제한효소로 자른 후, 0.8% agarose gel에 전기영동하고 Hybond-N membrane (Amersham, UK) 에 blotting을 했다(2). DNA를 UV-cross linking을 통해 고 정시킨 후, probe 표지와 검출은 Gene Images (Amersham, UK)를 사용하여 X-ray film (Agfa, Belgium)에 현상하였다.
- 그리고, glnK mutant를 얻기 위해, 476-bp의 Pstl-BgHI DNA와 815-bp의 Smal-Xhol DNA를 PCR로 얻은 후, pLOl 에 클로닝해서 pLOAglnK를 만들었고 이를 HP1에 이동시 켰다(Fig. 2). 위와 유사한 방법으로 얻은 glnK mutant인 HPlAglnK의 염색체를 Smal으로 잘라 분석한 결과, HP1 은6.
- 균체의 광합성 성장도중 흔히 접할 수 있는 세포 내 암모 니움 이온은 nitrogenase의 활성과 발현을 감소시킨다. 본 연구는 nitrogenase에 미치는 암모니움 이온의 감소 효과를 없 애기 위해 glnB, g血K가 각각, 혹은 모두 파괴된 변이주를 제작하였다. 그 결과, 암모니움 이온 효과가 glnK-glnB double mutant에서 나타나지 않았다.
- sphaeroides KCTC 12085로 명 명하였다. 분리균의 수소생성능을 높이 기 위해, uptake hydrogenase를 제 거했다. 광합성 조건에서 생성된 수소는 autotrophic 성장 도 중 생성된 수소를 reductant로써 사용할 수 있고(1), 이때, 수소는 세포막에 있는 uptake hydrogenase를 통해 세포 내로 들어온다.
- 필요할 경우, kanamycin (Km)은 25 iig/ml, tetracyclin (Tc) 은 1 μg/ml의 농도로, ampicillin (Ap)은 50 Ug/ml의 농도로 사용했다(13, 14). 세포의 성장은 Klett Summerson colorimeter (No. 66 filter, Manostat Co., USA)를 사용해서 측정해고, 세포 성장 정도는 Klett Unit (KU)로 나타냈다. 광도는 10 W/m2, 배양온도는 R.
- 수소 함량은 gas-tight microsyringe로 side-arm serum vial 내의 head space의 gas를 300 μ 1 뽑아 gas chromatography (Shimazu 17ATT ver. 3)로 분석하였다. Molecular sieve 5A (Supelco)로 충진된 2 mm x 2 m columml을 사용했으며, thermal conductivity detector (TCD)로 분석하였고, cmier gas (flow rate : 50 ml/min)는 Ar을 사용하였다.
- 우선, 矽K의 중앙 650-bp의 XhoI-SphI DNA를 pLOl에 클로닝했다. 이어, R.
- sphaeroides KCTC 12085 염색체상의 nifK 지역에 crossover를 일으켰다. 이 crossover가 된 균주 의 염색체 DNA를 뽑아 BgHI로 cutting하여 self-ligation을 통해 nifH와 nif扣를 얻었고, R. sphaeroides 241의 cosmid library 중, pUI8352의 EcoRY-Saci fragment로 nijK를 얻어 전체 nifHDK operon 유전자를 재조합했다. 이를 Himllll와 &比1으로 잘라 pRK415 의 ffindlll-Sad site 에 옮긴 毛 pNifHDK를 제작했다.
- 1A, 굵은 선)을 pLOl plasmid (Km「)에 cloning하여 pLOAglnB를 만들었다. 이를 본 연구의 모균주로 사용한 HP1에 이동시켜 single crossover 유도했다. Plasmid 유전자를 이동시키는 cc河ugatione 이미 보고된 방법에 따라 수행했다(12).
- 우선, 矽K의 중앙 650-bp의 XhoI-SphI DNA를 pLOl에 클로닝했다. 이어, R. sphaeroides KCTC 12085 염색체상의 nifK 지역에 crossover를 일으켰다. 이 crossover가 된 균주 의 염색체 DNA를 뽑아 BgHI로 cutting하여 self-ligation을 통해 nifH와 nif扣를 얻었고, R.
대상 데이터
- 이 double crossover의 염색체 구조는 Southern hybridization analysis로 확인했다. Probe로는 glnBA operon을 포함하는 2, 310『bp의 PCR DNA fragment를 사용했다. 그 결과, glnB mutant, HP1 AglnB는 Smll로 자른 시료에서 2.
- Plasmid 유전자를 이동시키는 cc河ugatione 이미 보고된 방법에 따라 수행했다(12). Single crossover의 exconjugant로 부터 double crossover의 재조합 균주, HPlAgln沮는 15%sucrose가 함유된 Sistrom 배지에서 선별했다(15, 16). glnK mutant# 얻기 위해, glnK 유전자의 C-말단 부분에 해당하는 77-bp의 Bglll-Smal DNA 지역을 제거시킨 후 (Fig.
- 균주로서 R. sphaeroides KCTC 12085(11)의 uptake hydrogenase (诚와 PHB synthase 가 파괴된 변이 주인 HP1 을 모균주 (parental strain) 로 사용했다. R.
- 탄소원으 로는 succinate 대신 DL-malate를 사용하였다. 암모니움 이온은 NHKl을 사용하여 공급했다. 사용된 균주와 plasmid는 Table 1에 정리되어 있다.
- 2A, thick line)을 suicide vector인 pLOl (Km「)에 cloning하여 pLOAghiK를 만 들었다. 이 plasmid를 사용해서 위와 사실상 동일한 방법에 의해, glnK mutant인 HPMglnK를 얻었다.
- sphaeroides 241의 cosmid library 중, pUI8352의 EcoRY-Saci fragment로 nijK를 얻어 전체 nifHDK operon 유전자를 재조합했다. 이를 Himllll와 &比1으로 잘라 pRK415 의 ffindlll-Sad site 에 옮긴 毛 pNifHDK를 제작했다.
- 또한 수소 생성을 위한 변형된 Sistrom's minimal medium으로 (NHeSCU를 제거 하고 질소원으로 glutamate 의 양을 늘렸고, ammonium molybdate 대신 sodium molybdate를 사용하였다. 탄소원으 로는 succinate 대신 DL-malate를 사용하였다. 암모니움 이온은 NHKl을 사용하여 공급했다.
이론/모형
- HP1과 HPIAglnBK 균주의 nitrogenase 활성을 acetylene 개스 환원법을 사용해 측정했다. HP1의 경우, 암모니움 이 온이 없을 때, 66.
- 이를 본 연구의 모균주로 사용한 HP1에 이동시켜 single crossover 유도했다. Plasmid 유전자를 이동시키는 cc河ugatione 이미 보고된 방법에 따라 수행했다(12). Single crossover의 exconjugant로 부터 double crossover의 재조합 균주, HPlAgln沮는 15%sucrose가 함유된 Sistrom 배지에서 선별했다(15, 16).
- 한편, glnK~glnB double mutant는 glnB mutant에 pLOA glnK를 이동시킨 후, double crossover하여 HPMghiBK를 얻 었다. 모든 mutant는 Southern hybridization 분석을 통해 확 인했다.
- pLOAglnB를 HP1에 이동시켜 single crossover (Km1) 를 유도했고, 이것을 다시 15% sucrose 가 함유된 Sistrom's medium 에 도말하여 levan sucrase (sacE)에 의한 levan 형성을 통한 negative selection 을 통해 double crossover (Kn?)를 얻어냈다. 이 double crossover의 염색체 구조는 Southern hybridization analysis로 확인했다. Probe로는 glnBA operon을 포함하는 2, 310『bp의 PCR DNA fragment를 사용했다.
성능/효과
- 4 and 5). HP1과 HP1A이nK, HPlAglnB의 암모니움 이온 농도에 따른 수소 생성은 암모니움 이온농도가 2 mN"] 되었을 때, nitrogenase의 활성이 완전히 저해가 되었으나, HPlAgln沮K의 경우, 2 mM 농도의 암모 니움 이온이 존재하는 조건에서도 ml 배양액 당 약 300 μ1의 수소가 생성되는 것을 볼 수 있었다(Fig. 6). 이는 암모 니움 이온이 없을 경우의 약 10%에 해당한다.
- 3-6). 각 균주의 성장 속도는 큰 차이 없으나, 암 모니움 이온이 존재하지 않을 때, 최대 KIM] 늦게 도달한 다는 것을 알 수 있었다(Fig. 3A-6A). 또한 HP1과 HP1A 이nBK는 암모니움 이온이 존재하지 않을 경우, 최대 수소 생성량이 ml 배양액 당 3.
- Probe로는 glnBA operon을 포함하는 2, 310『bp의 PCR DNA fragment를 사용했다. 그 결과, glnB mutant, HP1 AglnB는 Smll로 자른 시료에서 2.2 kb의 band가 나왔고, HP1은 예상대로 2 kb의 band가 나왔다. 또 X/ioI으로 자른 시료에서 HP1은 1.
- 본 연구에서는 와 glnK 유전자를 interruption하여 수소생성의 증진을 꾀하였다. 그 결과, parental strain이나 glnB 혹은 glnK 유전자 하나만을 interruption 시켰을 경우, 암모니움 이온에 의해 nitrogenase 활성이 저해를 받고 있었 으나, glnB, glnK 모두를 interruption 시켰을 때, 암모니움 이 온에 의한 저해 효과가 줄어드는 것을 볼 수 있었다 또한 이러한 glnB-glnK double mutant에 nifHDK gene을 in trans로 넣어 nitrogenase의 dosage를 높였을 경우, 수소 생성이 약 30% 가량 증진되었다는 것을 볼 수 있었다.
- 본 연구는 nitrogenase에 미치는 암모니움 이온의 감소 효과를 없 애기 위해 glnB, g血K가 각각, 혹은 모두 파괴된 변이주를 제작하였다. 그 결과, 암모니움 이온 효과가 glnK-glnB double mutant에서 나타나지 않았다. 반면, glnK mutant 혹은 glnB mutant에서는 여전히 암모니움 이온 효과가 나타났다.
- 이는 암모 니움 이온이 없을 경우의 약 10%에 해당한다. 따라서, HPMglnBK는 HP1에 비해 뚜렷한 수소 생성증가는 관찰 되지 않았어도, 암모니움 이온에 의한 감소효과는 덜 받고 있음을 의미한다.
- 본 연구 그룹은 수소생성능이 실험실 균주에 비해 5배 이상 높은 비유황 자색 광합성 세균을 우리나라의 대부도 인근 하천변의 수계 혐기층에서 분리, 동정하고 유전자은행 KCTC에 기탁하여 R. sphaeroides KCTC 12085로 명 명하였다. 분리균의 수소생성능을 높이 기 위해, uptake hydrogenase를 제 거했다.
- 2). 위와 유사한 방법으로 얻은 glnK mutant인 HPlAglnK의 염색체를 Smal으로 잘라 분석한 결과, HP1 은6.3 kb 부근에 하나의 band가 보였지만, HPMglnK는 3.9 kb 와 2.4 kb 부근에 두 개의 band가 보였다. 즉, PCR에 의해 의도적으로 만든 Smd site가 존재한다는 것을 확인하였다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, 암모니움에 의한 저해 효 과는 GlnK와 GlnB를 모두 제거했을 때 나타났고, HP1A gin由K 에서 nifHDK의 gene dosage를 strong promoter로 증진 시키면 수소생성의 더욱 큰 증진이 있을 것으로 예측할 수 있다.
- 4 kb 부근에 두 개의 band가 보였다. 즉, PCR에 의해 의도적으로 만든 Smd site가 존재한다는 것을 확인하였다. 그 외의 흐린 bands는 blocking이 잘 되지 않아 나타난 non-specific band 이다(Fig.
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