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문제 정의
- SNP(single nucleotide polymorphism)는 하나의 염기가 deletion, insertion 또는 substitution 되어 나타나는 것으로 human genom에서 가장 많은 변이의 원인으로 [16] 질병이나 약물의 개발을 위해 많은 연구가 이루어지고 있다 [11, 13]. 우리는 이런 연구 보고들을 기초로 도축되어 쇠고기 형태로 전환되면 품종별 식별이 어려운 문제를 해결하기 위하여 한우육과 젖소육 및 Black angus육을 짧은 시간내에 정확히 구분할 수 있는 방법을 찾고자 하였다.
제안 방법
- Forward primer와 reverse primer, 그리고 2가지의 TaqMan® MGB probe 를 이용하여 소 MC1R 유전자상의 SNP를 구분하기 위한 실험을 실시하였다. 그 결과, 한우 시료들(round)은 fluorescent dye FAM에서만 반응을 보였고 Holstein(diamond)과 Black angus(large squae)는 VIC dye에서만 반응을 나타냄을 알 수 있었다(Fig.
- MC1R 유전자(AF445642)의 559번째에서 576번까지를 forward piimer(5'-GCTGGAGACGGCAGTCAT-3')로, 617번째에서 633번까지를 reverse primer(5'- TCCAGCTGCTGCACCAC-3'로 사용하여 75 bp의 PCR 산물을 생산하고자 하였다. Probe로는 한우에 있어 594번째 guanine의 결손된 allele을 인식하는 FAM- labeled reporter 1 TaqMan® MGB probe(5'-FAM- CCAGGACACCGCCT-MGB-3')와 guanine이 존재하는 allele을 인식하는 VIC-labeled reporter 2 TaqMan® MGB probe(5'-VIC-CCAGGACACCGGCCT-MGB-3를 이용하였다.
- PCR 반응을 위해 반응액은 template DNA 11.875 µl, 40X assay mix 0.625 µl, TaqMan® Universal PCR master mix(2X) 12.5 µl로 총 25 µl로 조정하였다. Real-time PCR은 ABI Prism® 7000 sequence detection system(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행되었는데 PCR 수행은 95℃에서 10분간 pre-denaturation한 후 92℃, 15초, 60℃, 1 분간의 2단계로 PCR을 40 cycles 수행하였다.
- Real-time PCR은 ABI Prism® 7000 sequence detection system(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행되었는데 PCR 수행은 95℃에서 10분간 pre-denaturation한 후 92℃, 15초, 60℃, 1 분간의 2단계로 PCR을 40 cycles 수행하였다. PCR 수행이 끝난 후 결과의 분석은 SDS 7000 software (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 실시하였다.
- MC1R 유전자(AF445642)의 559번째에서 576번까지를 forward piimer(5'-GCTGGAGACGGCAGTCAT-3')로, 617번째에서 633번까지를 reverse primer(5'- TCCAGCTGCTGCACCAC-3'로 사용하여 75 bp의 PCR 산물을 생산하고자 하였다. Probe로는 한우에 있어 594번째 guanine의 결손된 allele을 인식하는 FAM- labeled reporter 1 TaqMan® MGB probe(5'-FAM- CCAGGACACCGCCT-MGB-3')와 guanine이 존재하는 allele을 인식하는 VIC-labeled reporter 2 TaqMan® MGB probe(5'-VIC-CCAGGACACCGGCCT-MGB-3를 이용하였다. Allelic discrimination에 사용되는 형광 probe와 5' nuclease assay 에 대한 내용은 Livak [10]에 의해 이미 설명된 바 있다.
- 5 µl로 총 25 µl로 조정하였다. Real-time PCR은 ABI Prism® 7000 sequence detection system(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행되었는데 PCR 수행은 95℃에서 10분간 pre-denaturation한 후 92℃, 15초, 60℃, 1 분간의 2단계로 PCR을 40 cycles 수행하였다. PCR 수행이 끝난 후 결과의 분석은 SDS 7000 software (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 실시하였다.
- 근육으로부터의 DNA분리 및 정제는 Miller 등 [12]의 phenol/chloroform 추출방법의 일부를 변형해 실시하였고 DNA는 TE buffer(10mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH7.4) 적당량을 넣어 재부유 시켜 50 µg/ml 농도로 준비하였다. 분리된 DNA는 1% agarose gel을 사용하여 확인하였다.
- 또한 정 등 [5]은 MC1R에 대해 PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 기법을 이용한 한우육 판별법을 보고하였다. 이 방법에서 한우와 젖소 간에 차이를 보이는 품종 특이적인 SSCP 유전자형을 확인하였다. 이는 RFLP와는 달리 제한 효소가 필요없이 간편하게 돌연변이로 유발된 유전자의 다형성을 직접 검출할 수 있으나, polyacrylamide gel 준비 및 염색 등으로 인한 시간의 문제 및 재현성이 떨어지는 단점이 있었다.
- 이러한 이유로 본 실험에서는 TaqMan® MGB probe와 2개의 primer set를 이용한 real-time PCR 방법을 통해 신속하고 정확한 구별법을 실시하였다. TaqMan® MGB probe 기술은 fluorescence resonance energy transfer (FRET)에 기초를 두고 있다 [8].
- 정 등 [4]은 MC1R의 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism) marker를 이용한 한우육 판별법을 보고하였다. 즉 PCR로 증폭된 MC1R gene을 Bse118 I, Msp I, Aci I 의 세 가지 제한 효소 처리하여 한우육과 젖소육에서 각각 다른 DNA band를 확인하였다. 이 방법은 이전의 RAPD나 SCAR 방법에 비하여 정확하고 안정적인 분석 결과를 얻을 수 있지만 PCR 후 DNA 정제, 그리고 다시 enzyme 처리과정을 거친 후 agarose gel 에 전기영동을 해야 하는 번거러움이 있었다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 공시재료는 도축장에서 흰색과 검은색 혼합의 Holstein 20마리, 체모가 완전히 검은 Black angus 5마리, 그리고 완전한 황갈색의 한우 20마리, 흰색과 황갈색의 혼합종인 Hereford(수입산) 10마리로부터 근육을 채취하였다.
성능/효과
- MGB probe 를 이용하여 소 MC1R 유전자상의 SNP를 구분하기 위한 실험을 실시하였다. 그 결과, 한우 시료들(round)은 fluorescent dye FAM에서만 반응을 보였고 Holstein(diamond)과 Black angus(large squae)는 VIC dye에서만 반응을 나타냄을 알 수 있었다(Fig.1). 추가적으로 실시한 Herefbrd(triangle)는 한우와 마찬가지로 FAM dye에서만 반응을 보였다.
- 또한 유통과정에서 한우육과 젖소육이 한우육으로 둔갑해 판매되는 경우가 발생하였다. 따라서 본 실험에서 사용한 TaqMan® MGB prob를 이용한 real-time PCR 방법은 2시간 이내에 순수한 한우육을 젖소육 및 Black angus육과 명확히 구별할 수 있는 정확하고 간편하며 재현성 있는 감별법이라 판단된다. 하지만 실험결과에서 본 바와 같이 황색 혼합모종 (Hereford 등)과 순수황색우(한우)의 분별은 본 실험 방법으로 불가능하다.
- 결과 분석 후 형광분포의 좌표값은 Table 1에 나타나 있다. 이 결과, 본 실험에 사용된 2개의 primer 및 2개의 TaqMan® MGB probe 를 이용하는 실험은 순수한 황갈색의 모색의 유전자 존재 여부를 검출할 수 있는 방법임을 알 수 있었다. 즉 황갈색을 포함한 품종인 한우나 Hereford 등은 FAM dye의 활성을 볼 수 있는 반면, 황갈색의 모색이 포함되지 않은 Holstein이나 Black angus는 FAM dye의 활성을 볼 수 없고 VIC dye의 활성만을 보였다.
- 추가적으로 실시한 Herefbrd(triangle)는 한우와 마찬가지로 FAM dye에서만 반응을 보였다. 즉 한우특이적인 prob는 황갈색 모색을 나타내는 DNA allele에만 결합 후 Taq DNA polymerase에 의해 활성화되어 FAM에 해당하는 형광만을 발현하였고, 황갈색의 모색이 아닌 allele DNA에는 다른 하나의 probe만 결합한 뒤, VIC의 형광만을 발현함을 알 수 있었다. 결과 분석 후 형광분포의 좌표값은 Table 1에 나타나 있다.
후속연구
- 황색 이외의 다른 모색이 섞인 품종과 순수황색을 구분하는 방법은 아직 세계적으로 확립된 바가 없기 때문에 우리나라의 수입육우 경우 황색 혼합모종 (Hereford 등)이 있음을 감안한다면 이 문제에 대한 연구가 더 요구된다고 할 수 있겠다. 하지만 본 연구방법의 응용은 양축농가 및 소비자를 보호하고 유통과정 중 발생하는 한우 둔갑육을 차단해 쇠고기 시장을 활성화시키기고 소비자와 양축농가의 경제적 손실 및 피해를 줄이고 한우산업의 경쟁력을 강화시킬 수 있으며 나아가 유통과정 중 젖소육이 한우육으로 둔갑되는 문제점을 방지할 수 있을 것이라 판단된다.
- 하지만 실험결과에서 본 바와 같이 황색 혼합모종 (Hereford 등)과 순수황색우(한우)의 분별은 본 실험 방법으로 불가능하다. 황색 이외의 다른 모색이 섞인 품종과 순수황색을 구분하는 방법은 아직 세계적으로 확립된 바가 없기 때문에 우리나라의 수입육우 경우 황색 혼합모종 (Hereford 등)이 있음을 감안한다면 이 문제에 대한 연구가 더 요구된다고 할 수 있겠다. 하지만 본 연구방법의 응용은 양축농가 및 소비자를 보호하고 유통과정 중 발생하는 한우 둔갑육을 차단해 쇠고기 시장을 활성화시키기고 소비자와 양축농가의 경제적 손실 및 피해를 줄이고 한우산업의 경쟁력을 강화시킬 수 있으며 나아가 유통과정 중 젖소육이 한우육으로 둔갑되는 문제점을 방지할 수 있을 것이라 판단된다.
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