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문제 정의
- 본 연구에서 발현한 재조합 p12단백질이 ASFV 항체를 검출하기 위한 진단항원으로서 유용한지 여부를 간접 ELISA로 조사하였다. Checkerboard titration법을 실시한 결과 재조합 p12 항원과 검사 혈청의 적정한 희석 배수는 각각 1:150 및 1:100이었다(Fig.
- 본 연구에서는 재조합 baculovirus를 이용하여 ASFV p12 단백질을 발현하여, 발현된 재조합 p12 단백질이 항 체검출용 진단항원으로서의 유용성 여부를 ELISA로 평 가하였다.
제안 방법
- (1) ASFV의 ORF O61R 유전자를 삽입한 재조합 baculovirus를 작성하였다. 작성된 재조합 baculovirus에 의해 곤충세포에서 발현된 재조합 단백질은 대부분 12 kDa의 dimer형태였으며, 일부는 17 kDa의 trimer 형 태였다.
- ASFV ORF O61R을 포함하는 재조합 baculovirus는 발현벡터 pBacPAKASFVO61R와 BacPAK6 linear DNA (Bsu36I digested)(Clontech, USA를 Spodoptera frugipera (Sf9) 곤충세포(Invitrogen, USA)에 미국 Clontech사에서 권장하는 방법에 따라 co-transfection 시킨 후 곤충세 포를 27℃에서 저온배양하여 작성하였다. 재조합 baculoviruH co-transfection 72시간 후 곤충세포배양상 층액으로부터 채독하여 플라크법 (plaque assay Q 로 클로닝하였다.
- Remond로부터 제공받았다. ASFV p12에 대한 양성혈청은 본 연구에서 생산된 rASFVp12 단백질을 기니픽에 접종함으로서 연구자의 실험실에서 제조하였다. 즉, rASFVp12 단백질(두당 약 1 mg)을 기니픽 2두에 3주 간격 2회 피하 접종하였다.
- 또한 ORF O61R DNA의 효율적인 클로닝을 위하여 forward 및 reverse primer 5'말단에 제한효소 BamH1 과 Xba1 절단부위 염기서열을 삽입하였다. PCR에 의한 ORF O61R DNA 증폭산물은 BamH1 및 Xba1 절단하여 pUC19 plasmid(Gibco, USA)에 삽입하여 cloning하였다(pUC19/ ASFVO61R). 이렇게 cloning된 ORF O61R DNA는 동일한 제한효소로 절단하여 pUC19/ASFVO61R로부터 추출하여 pBacPAK8(Clontech, USA)에 삽입하여 유전자재 조합 발현벡터 (pBacPAKASFVO61R) 를 작성하였다.
- 그 후 ELISA plate는 492 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 검사 결과는 각 혈청의 흡광도를 T/P 비율(검사혈청 흡광도/양성대조혈청 흡광도)로 전환하여 계산하였다 만약 rASFVp12 항원 well에서 검사혈청의 T/P 비율이 0.3(음 성혈청의 평균 T/P비율의 2배)이상일 경우 ASFV 감염 Vro 세포 slide를 이용한 간접 형광항체법으로 ELISA 비특이반응 여부를 조사하였다.
- 그 다음 FITC conjugated ant-swine IgG(H+L) 용액 (Kirkegaard -Perry, USA; 1:500배 희석)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킴으로서 항원-항체 결합 산물을 검출하도록 하였다. 검사한 세포에서의 형광염색 여부는 암실에서 형광현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
- 4로 간단히 세척하였다. 그 다음 FITC conjugated ant-swine IgG(H+L) 용액 (Kirkegaard -Perry, USA; 1:500배 희석)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킴으로서 항원-항체 결합 산물을 검출하도록 하였다. 검사한 세포에서의 형광염색 여부는 암실에서 형광현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
- 1). 또한 ORF O61R DNA의 효율적인 클로닝을 위하여 forward 및 reverse primer 5'말단에 제한효소 BamH1 과 Xba1 절단부위 염기서열을 삽입하였다. PCR에 의한 ORF O61R DNA 증폭산물은 BamH1 및 Xba1 절단하여 pUC19 plasmid(Gibco, USA)에 삽입하여 cloning하였다(pUC19/ ASFVO61R).
- 또한 적정농도 조건의 rASFVp12 항원 및 검사혈청을 사용하여 간접 ELISA를 확립하여, rASFVp12 항원이 ASFV 특이항체를 검출할 수 있는지 여부를 조사하였 다(Fig. 5). 유효성 평가를 위하여 ASFV 항체양성 돼지 혈청 20점과 ASFV 항체음성 돼지혈청 210점을 사용하였다 ASFV 항체양성 돼지혈청 20점중 15점(75%)은 0.
- 본 연구에서 발현된 rASFVp12단백질의 발현확인을 위하여 ASFV 고도면역 양성혈청과 기니픽 항 p12 혈청을 사용하여 Western blot을 실시하였다. 먼저, NuPAGE® Novex Bis-Tris Gels에서 rASFVp12 단백질을 Xcell SureLockTM Mini-cell(Invitrogen, USA를 사용하여 제조사에서 권장하는 방법에 의거하여 전기영동을 실시하였다. 그 후, Xcell IITM Blot Module(Invitrogen, USA를 사용하여 단백질 분획들을 gel로부터 nitrocellulose 막으로 전이시켰다.
- 본 연구에서 발현된 rASFVp12단백질의 발현확인을 위하여 ASFV 고도면역 양성혈청과 기니픽 항 p12 혈청을 사용하여 Western blot을 실시하였다. 먼저, NuPAGE® Novex Bis-Tris Gels에서 rASFVp12 단백질을 Xcell SureLockTM Mini-cell(Invitrogen, USA를 사용하여 제조사에서 권장하는 방법에 의거하여 전기영동을 실시하였다.
- 본 연구에서 발현한 rASFVp12 단백질이 돼지 혈청시 료로부터 ASF 항체를 검출할 수 있는지를 조사하기 위하여 간접 ELISA를 실시하였다. 우선 Maxisorp ELISA plate(NUNC, Denmark) 에 0.
- 05% Tween 20)로 적정하게 희석한 검사혈청을 rASFVp12 항원이 흡착된 plate에 각각 2반복으로 well당 50 μl씩 첨가하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 상기와 동일한 방법으로 ELISA plate 를 세척한 후 peroxidase-conjugated anti-swine IgG(H+L) 용액(Kirkegaard-Perry, USA; 1:1,500배 희석)을 well당 50 μl씩 첨가하여 3기에서 1시간동안 반응 시킴으로서 항원-항체 결합산물을 검출하게 하였다. 그 후 O-phenylenediamine(OPD) 기질용액 (Sigma, USA)을 well당 50 μl씩 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 다음 1.
- 재조합 baculoviruse 감염시킨 Sf9 곤충 세포에서의 p12 단백질의 발현 여부를 확인하기 위하여 간접 형광항 체법을 실시하였다. 우선, 재조합 baculovirus를 감염시킨 후 3일째에 감염세포를 수확하였다. 감염세포는 0.
- PCR에 의한 ORF O61R DNA 증폭산물은 BamH1 및 Xba1 절단하여 pUC19 plasmid(Gibco, USA)에 삽입하여 cloning하였다(pUC19/ ASFVO61R). 이렇게 cloning된 ORF O61R DNA는 동일한 제한효소로 절단하여 pUC19/ASFVO61R로부터 추출하여 pBacPAK8(Clontech, USA)에 삽입하여 유전자재 조합 발현벡터 (pBacPAKASFVO61R) 를 작성하였다. 발 현벡터내 ORF O61R DNA의 올바른 삽입여부는 PCR 법, 제한효소절단법 및 염기서열분석의 방법에 의하여 확인하였다.
- 재조합 ASFV p12 단백질 (rASFVp12) 항원은 BacPAK/ ORF61R 를 감염시킨 Sf9 곤충세포로부터 추출하여 제 조하였다. 즉, 미리 배양한 Sf9 세포에 5 M.
- 재조합 ASFV p12 단백질(rASFVp12)의 발현 ASFV p12 단백질을 암호화하는 genome 유전자 부위는 ASFV의 genome 중 EcoRI-XbaI 핵산절편 부위 내에 존재하며, 이 절편(913 bps) 중 ORF O61R DNA(183 bps) 를 포함하는 총 358 bp 크기의 DNA를 증폭하도록 하였다 (Fig. 1).
- R와 BacPAK6 linear DNA (Bsu36I digested)(Clontech, USA를 Spodoptera frugipera (Sf9) 곤충세포(Invitrogen, USA)에 미국 Clontech사에서 권장하는 방법에 따라 co-transfection 시킨 후 곤충세 포를 27℃에서 저온배양하여 작성하였다. 재조합 baculoviruH co-transfection 72시간 후 곤충세포배양상 층액으로부터 채독하여 플라크법 (plaque assay Q 로 클로닝하였다. ASFV p12단백질을 발현하는 재조합 baculovirus(BacPAK/ORF61Rfc 형광항체법으로 ASFV 고도면역 돼지혈청과의 반응여부를 확인함으로서 선발 하였다.
- 재조합 baculovirus BacPAK/ORF61R 감염 곤충세포로 부터 재조합 발현단백질 (rASFVp12)를 추출한 다음 그 항원성을 Western blot법과 간접 ELISA로 분석하였다. 발현단백질을 변성시켜 전기영동법으로 분획시킨 후 Western blot법으로 항 p12 기니픽 혈청과 반응시켰을 때, 약 12 kDa과 17 kDa의 단백질 분획들이 관찰되었다.
- 그 후 500Xg로 20분간 원심분리하여 cell debris를 제거한 다음, rASFVp12 단백질이 함유된 상층액은 소분하여 실험에 사용하기 전까지 -70℃에 보관하였다. 정상 Sf9 곤충세포를 상기와 동일한 방법으로 추출하여 항원 음성 대조로 사용하였다.
- ASFV p12에 대한 양성혈청은 본 연구에서 생산된 rASFVp12 단백질을 기니픽에 접종함으로서 연구자의 실험실에서 제조하였다. 즉, rASFVp12 단백질(두당 약 1 mg)을 기니픽 2두에 3주 간격 2회 피하 접종하였다. 그 후 최종면역 2주에 채혈하여 혈청을 분리 한 다음 pool 하였다.
- 그 후 최종면역 2주에 채혈하여 혈청을 분리 한 다음 pool 하였다. 혈청에 곤충 세포 lysates(1X108/혈청 ml)를 첨가하여 실온에서 1시간 처리함으로서 혈청내 존재하는 비특이 세포단백질 항체를 제거하였다. 이들 혈청이외 에, 아프리카돼지콜레라 비발생 지역인 한국의 도축장에서 채취한 돼지 혈청 210점을 ASFV 음성 돼지 야외 혈청으로 사용하였다.
대상 데이터
- 재조합 baculoviruH co-transfection 72시간 후 곤충세포배양상 층액으로부터 채독하여 플라크법 (plaque assay Q 로 클로닝하였다. ASFV p12단백질을 발현하는 재조합 baculovirus(BacPAK/ORF61Rfc 형광항체법으로 ASFV 고도면역 돼지혈청과의 반응여부를 확인함으로서 선발 하였다.
- 음성대조를 위하여 정상 Sf9 곤충세포를 동일한 방법으로 고정시켰다. ASFV 감염 Vero세포 slide glass의 경우 미국 NVSL 의 Dr. J. House로부터 제공받았다. 고정된 슬라이드에 ASFV 고도면역 돼지혈청(1:5,000배 희석)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 비반응 산물들을 제거하기 위하여 0.
- ASFV 고도면역 돼지 혈청은 미국 National Veterinary Service Laboratory(NVSLeI Dr. A. House로부터 제공받았다. 이 혈청은 본 연구에서 양성 대조혈청으로 사용되었다.
- 이 혈청은 본 연구에서 양성 대조혈청으로 사용되었다. ASFV감염 야외돼지유래 혈청 20점은 프랑스 Agence Frangaise de Securite Sanitaire des Aliments (AFFSA) 연구소의 Dr. M. Remond로부터 제공받았다. ASFV p12에 대한 양성혈청은 본 연구에서 생산된 rASFVp12 단백질을 기니픽에 접종함으로서 연구자의 실험실에서 제조하였다.
- 발현벡터 pBacPAK/ASFV.O61R의 작성 ASFV ORF O61R 유전자가 삽입된 발현벡터 pBacPAKASFVO61R을 작성하기 위해 사용된 viral DNA는 불활화된 ASFV Brasil-78주(미국 National Veterinary Service Laboratory의 Dr. A. House제공)로부터 추출하였다. 중합효소연쇄반응법 (polymerase chain reaction, PCR) 에 의한 ORF O61R DNA의 증폭을 위하여 PCR primers O61R-F(5'-CGGGATCCAATACGCAAAATGGCAC-3') 및 O61R-R(5'-CTCTAGAGCGGACCATGTACTCTGAC- 3')가 사용되었다.
- 이 전염병의 병원체는 Asfarviridae과의 Asfivirus 에 속하는 아프리카돼지 콜레라바이 러 스(African swine fever virus, ASFV) 이다 [13]. 이 바이러스는 약 170 kb 의 DNA genome과, 초기 mRNA 생산에 필요한 효소, 그리고 50여개의 구조단백질로 구성되어 있다. [10, 24].
- 혈청에 곤충 세포 lysates(1X108/혈청 ml)를 첨가하여 실온에서 1시간 처리함으로서 혈청내 존재하는 비특이 세포단백질 항체를 제거하였다. 이들 혈청이외 에, 아프리카돼지콜레라 비발생 지역인 한국의 도축장에서 채취한 돼지 혈청 210점을 ASFV 음성 돼지 야외 혈청으로 사용하였다.
이론/모형
- 이렇게 cloning된 ORF O61R DNA는 동일한 제한효소로 절단하여 pUC19/ASFVO61R로부터 추출하여 pBacPAK8(Clontech, USA)에 삽입하여 유전자재 조합 발현벡터 (pBacPAKASFVO61R) 를 작성하였다. 발 현벡터내 ORF O61R DNA의 올바른 삽입여부는 PCR 법, 제한효소절단법 및 염기서열분석의 방법에 의하여 확인하였다.
- 재조합 baculoviruse 감염시킨 Sf9 곤충 세포에서의 p12 단백질의 발현 여부를 확인하기 위하여 간접 형광항 체법을 실시하였다. 우선, 재조합 baculovirus를 감염시킨 후 3일째에 감염세포를 수확하였다.
- House제공)로부터 추출하였다. 중합효소연쇄반응법 (polymerase chain reaction, PCR) 에 의한 ORF O61R DNA의 증폭을 위하여 PCR primers O61R-F(5'-CGGGATCCAATACGCAAAATGGCAC-3') 및 O61R-R(5'-CTCTAGAGCGGACCATGTACTCTGAC- 3')가 사용되었다. 이들 primer는 ORF O61R이 있는 EcoRI-XbaI 핵산절편 내 ORF O61R 유전자 전체를 포함하여 증폭되도록 디자인하여 합성되었다 (Fig.
성능/효과
- (2) 재조합 baculovirus에 의해 발현된 재조합 p12 단백질을 간접 ELISA의 진단항원으로 사용한 결과 ASFV 항체양성 돼지혈청은 T/P비율 0.5이상을 나타내어, 0.5 미만의 T/P 비율을 나타낸 ASFV 항체음성 돼지혈청과 의 감별이 가능하였다. 그러므로, 본 연구에서 생산한 재조합 p12단백질은 ASFV 항체진단용 ELISA의 진단항 원으로서 유용할 것으로 판단된다.
- O61R 벡터와 BacPAK6 linear DNA간의 유전자 재조합에 의하여 성공적으로 작성되었다. BacPAK/ORF61R에 감염된 곤충세 포는 감염 3일째 뚜렷한 세포변성효과가 관찰되기 시작하였으며 (Fig. 2A right), 바이러스 수거일인 감염 5일째에는 곤충세포의 90% 이상이 세포변성효과를 나타내었다. 그러나 정상세포에서는 세포변성효과가 관찰되지 않았다(Fig.
- 본 연구에서 발현한 재조합 p12단백질이 ASFV 항체를 검출하기 위한 진단항원으로서 유용한지 여부를 간접 ELISA로 조사하였다. Checkerboard titration법을 실시한 결과 재조합 p12 항원과 검사 혈청의 적정한 희석 배수는 각각 1:150 및 1:100이었다(Fig. 4).
- 셋째, baculovirus를 이용하여 생산하는 p12 단백질 항원은 고농도로 쉽게 생산할 수 있기 때문에 항원생산비가 저렴하다 [10]. 결론적으로, 본 연구에서 발현된 재조합 p12 단백질 항원은 진단항원으로서 항원성이 우수하고, 안전하며, 쉽게 생산할 수 있는 장점을 가지고 있다. 다만, 본 연구에서 적용한 p12 단백질 항원을 이용한 ELISA 을 ASF 진단이나 예찰 목적으로 사용하기 위해서는 보다 다양한 야외혈청 시료들을 확보하여 추가적인 유효성 평가가 필요하다.
- 첫째, 불활화바이러스 항원과 달리 재조합 p12 단백질 항원은 항원생산과정에서 전염성이 있는 ASFV 를 취급하지 않으므로 일반 실험실에서도 쉽게 진단 항원을 생산할 수 있다. 둘째, 불활화 바이러스항원을 제조하기 위하여 BEI(binary ethyleneimmine)와 같은 발암성 불활화제의 취급이 필수적이나, 재조합 p12단백질 항원의 제조과정에서는 그러한 발암성 화학제를 사용하지 않으므로 취급자에 대한 생체위해도가 매우 낮다. 셋째, baculovirus를 이용하여 생산하는 p12 단백질 항원은 고농도로 쉽게 생산할 수 있기 때문에 항원생산비가 저렴하다 [10].
- 본 연구 결과 ASFV 항체양성 혈청과 ASFV 항체음 성혈청간에 재조합 p12 단백질(rASFVp12)와의 뚜렷한 ELISA 반응 정도의 차이가 관찰되었다. ASFV감염 돼지혈청의 경우 대부분 p12 단백질과 강한 반응 (0.
- 본 연구에서 생산한 재조합 rASFVp12 단백질은 검사 방법에 따라 항원성의 차이가 관찰되었다. 즉, 간접 ELISA에서의 반응 결과와 달리, Western blot에서는 ASFV 고도면역 돼지혈청과 매우 약한 반응을 나타내었다.
- 이것은 재조합 baculovirus 에 의해 발현된 p12단백질이 진단항원으로서 적합함을 제시하는 것이다. 본 연구에서 재조합 baculovirus에 의해 생산된 재조합 rASFVp12 단백질은 대부분 약 12 kDa 에 해당하는 단백질 형태로 발현되었으며, 일부 17 kDa 의 단백질 형태도 발현되었다. 아미노산 61개로 구성되어 있는 p12단백질은 예상 분자량이 6.
- 본 연구에서 재조합 baculovirus에 의해 생산된 재조합 rASFVp12 단백질은 대부분 약 12 kDa 에 해당하는 단백질 형태로 발현되었으며, 일부 17 kDa 의 단백질 형태도 발현되었다. 아미노산 61개로 구성되어 있는 p12단백질은 예상 분자량이 6.5 kDa [2]임 을 고려해 볼 때 본 연구에서 발현된 재조합 p12 단백질은 monomer 형태보다는 dimer(12 kDa) 나 trimer(17 kDa) 형태로 발현됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 Angulo 등 [6] 등이 보고한 재조합 p12 단백질의 immunoprecipitaion 결과와 일치하였고, 대장균발현 p12 단백질에서도 관찰되 었다 [1].
- 5). 유효성 평가를 위하여 ASFV 항체양성 돼지 혈청 20점과 ASFV 항체음성 돼지혈청 210점을 사용하였다 ASFV 항체양성 돼지혈청 20점중 15점(75%)은 0.90 이상의 높은 T/P 비율을 나타내었다. 가장 낮은 반응성을 보인 양성혈청의 T/P 비율은 0.
- 결론적으로 본 연구에서 생산한 재조합 p12단백질은 ASFV 항체진단용 ELISA의 진단항 원으로서 유용할 것으로 판단된다. 이 연구 결과는 재조합 rASFVp12 항원이 ELISA 진단항원으로서 적용 가능하다는 것을 처음으로 제시하였다는 점에서 진단학적으 로 중요한 의의를 지니고 있다.
후속연구
- 상대적으로 높은 T/P 비율을 보인 돼 지 음성 혈청들은 간접 형광항체법에서 ASFV와의 항원 항체반응이 관찰되지 않은 것으로 보아 비특이 ELISA 반응에 의해 상대적으로 높은 ELISA 발색반응을 나타낸 것으로 사료된다. 결론적으로 본 연구에서 생산한 재조합 p12단백질은 ASFV 항체진단용 ELISA의 진단항 원으로서 유용할 것으로 판단된다. 이 연구 결과는 재조합 rASFVp12 항원이 ELISA 진단항원으로서 적용 가능하다는 것을 처음으로 제시하였다는 점에서 진단학적으 로 중요한 의의를 지니고 있다.
- 하겠다. 그러므로, conformational epitop*〕항원구조를 파괴시킬 수 있는 단백질 항원변성 처리과정을 거치지 않는 진단방법을 고려한다면, 재조합 p12 단백질의 진단적 적용은 매우 유용할 것으로 판단된다.
- 5 미만의 T/P 비율을 나타낸 ASFV 항체음성 돼지혈청과 의 감별이 가능하였다. 그러므로, 본 연구에서 생산한 재조합 p12단백질은 ASFV 항체진단용 ELISA의 진단항 원으로서 유용할 것으로 판단된다.
- 결론적으로, 본 연구에서 발현된 재조합 p12 단백질 항원은 진단항원으로서 항원성이 우수하고, 안전하며, 쉽게 생산할 수 있는 장점을 가지고 있다. 다만, 본 연구에서 적용한 p12 단백질 항원을 이용한 ELISA 을 ASF 진단이나 예찰 목적으로 사용하기 위해서는 보다 다양한 야외혈청 시료들을 확보하여 추가적인 유효성 평가가 필요하다.
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