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문제 정의
- 각종 산소 라디칼들이 생체내의 호흡 효소계나 산화 환원 계에서 생성되어 노화와 각종 질병과 유관한 사실이 밝혀져 감에 따라 이들의 소거를 위한 항산화 물질에 대한 관심이 높아지고 있는 시점에서, 본 논문에서는 차가버섯의 대표 유효성분인 항산화 성분을 최대로 추출해내기 위한 효과적인 추출법을 시도하고자 실행하였다. 차가버섯 건조분말을 80℃에서 8시간 추출한 것을 1차 추출물, 1차 추출 후 그 잔사물에 물을 첨가하여 100℃에서 8시간 추출한 것을 2차 추출물, 2차 추출 후 남은 잔사물에 물을 첨가하여 120℃에서 8시간 추출한 것을 3차 추출물로 흥]-여서, DPPH 자유 라디 칼에 대한 전자공여능, ABTS' 라디칼 양이온 소거능, 리놀레산 자동산화 저해 효과를 봄으로서 항산화능을 측정하였다.
- 이들 성분들은 물리 화학적 성질의 차이에 의해 용해성 이나 휘발성이 다르다고 볼 수 있으며, 특히 온도에 대한 용해성이 다르기 때문에 추출온도는 유효성분의 효과적인 용출을 위해서 매우 중요한 요인이라 사료된다. 따라서 차가 버섯의 유효성분을 섭취하기 위한 추출 가공방법이 중요하며 본 연구는 종래의 추출 방법을 개선함에 목적이 있다.
- 이러한 관점에서, 일차적으로 고온의 조건에서 파괴되거 나 휘 발성 등으로 인해 소실가능성이 높은 유효성 분은 저 온 추출하고, 고온에서만 추출 가능한 유효성분은 상대적으로 높은 온도에서 단계별로 회수한 후, 각 추출물에 대하여 라 디 칼 소거능을 가지는 항산화성 의 몇 가지 유효성 분들의 양을 비교 검토한다면 상기에 설명한 문제점을 해결할 수 있는 방안을 찾을 수 있을 것으로 사료된다. 또한 유효성분을 최대한 회수할 수 있는 효과적인 추출법을 시도하여 추출온도와 항산화성 물질들 간의 상호 관계를 규명하고 지방산화에 대한 억제정도를 밝힘으로서 유해 활성산소로 인해 야기되는 여러 질환에 대한 유효한 건강식품으로서의 기능성을 평가하고자 본 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 따라서 1차, 2차 및 3차 차가추출물 50 ppm에서 리놀레산의 자동 산화를 현저히 감소시킴을 알 수 있었다. 二L러나 각 추출물이 50 ppm에서는 자동산화 억제 효과에 있어 서로간의 차이가 보이지 않아 각 추출물별 차별성을 보기 위하여 각 시료를 10 ppm 농도로 조제하여 40℃에서 10일간 과산화물 생성 억제능(%)을 계산한 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 1 차, 2차, 및 3차 추출물 10 ppm의 농도에서지 방산화 억제효과가 각각 59.
- 각각의 추출물 시료 100 J1L에 2% Na2CO3 용액 2 mL를 가하고 3분 동안 방치한 다음 50% Folin-Ciocalteu 시 약을 100 11L 가하여 3분 후 720 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 각 추출물의 흡광도를 표준물질로 사용한 갈산 검 량선과총비교하여 총 페놀의 함량(Ug gallic acid equivalent/mL)을 구했으며 공시험 은 반응 혼합물에서 50% Folin-Ciocalteu 시약 대신 각 추출물을 녹인 용매를 가한 혼합액을 사용하였다. 실험 측정은 세번 반복 실험하여 평균값을 사용하였다.
- 이 혼합액을 실온에서 40분간 방치한 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 각 추출물의 흡광도를 표준물질로 사용한 케르세 틴 (quercetin) 검량선과 비교하여 총 플라보노이드의 함량을 구했으며, 공시험은 반응 혼합물에서 10% 암모늄 질산염 0.1 mL과 1 M 초산칼륨 0.1 mL 대신 각 추출물을 녹인 용매를 가한 혼합액을 사용하였다. 실험 측정은 세번 반복 실험하여 평균값을 사용하였다.
- DPPH 소 거능은 517 nm에서의 대조구과 처리구의 흡광도차를 대조 구의 흡광도로써 나눈 값을 백분율로 하여 나타내었다. 대조 구는 시료 용액 대신 시료를 녹인 용매를 가하여 흡광도를 측정하였다. 이때, 아스코르브산 50 ppm과 30 ppm 용액을 시료로 하여 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 비교하였다.
- 1 mL을 가하여 혼합한 후 정확히 3분 후에 500 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 대조구는 시료 대신 증류수를 사용하고 활성 비교를 위해 합성 항산화제인 BHA을 각각 10 ppm과 100 ppm 농도로 사용하여 비교하였다. 실험 측정은 세번 반복 실험하여 평균치를 사용하였다.
- 따라서 고형분 추출량의 관점에서 상기의 조건이 적절한 추출조건으로 사료되었다. 따라서 차가버섯 건조 분말 80 g에 증류수 700 mL를 가하여 80℃, 100℃, 및 120℃에서 연속하여 3차례에 걸쳐 추출하였으며, 그 결과를 Table 1에 나타내었다. 1차 추출에서 총 고형분의 63%가 추출되었으며 2차 추출에서 25%, 3차 추출물에서 약 12% 정도가 추출되었다.
- 이상과 같이 세 가지 측면에서의 항산화 효과를 검토한 결과 세 가지 방법 모두에서 3차 추출물이 가강 높은 항산화력을 나타내었음을 알 수 있었다. 따라서 페놀 화합물과 플라보노이드의 유효성 분과 3가지 항산화력과의 상호 관련성을 보기 위해 regression analysis를 행하였다. 페놀 화합물과 DPPH, ABTS, 및 리놀레산 자동산화 해효과와의 관련성은 각각 R=0.
- 대조 구는 시료 대신에 증류수를 가하여 같은 방법으로 측정하였다. 또한 차가버섯 추출물이 색소 성분을 가지고 있고 이 성분이 지방산화를 촉진시킬 수 있는 가능성이 있으므로 색소에 의한 흡광을 보정을 해주기 위 하여 공시험 은 반응 정 지 제인 BHT를 먼저 넣고 추출물을 첨가 한 다음 반응은 시키지 않고 바로 TBARS 분석을 행하였다.
- 상기와 같이 차가버섯 추출물을 온도별로 추출한 후 각 추출물을 혼합하여 동결건조하여 시료를 조제한 후 이 시료가 지방산화에 미치는 영향을 검토하였다. 먼저 활성산소종 자 체 가지 방산화에 어느 정도의 영향을 미치는 지를를 알아보기 위하여 활성 산소종 대신 증류수를 넣은 대조구와 각각의 활성산소종을 넣고 어유 유화액에서 반응을 시킨 후 TBARS 값을 측정 하였다(Fig. 4). 활성 산소가 첨가되지 않은 대조군에 비하여 ・OH 그 자체가 가장 강한 지방 산화 촉진작용을 나타내었고 그다음은 Fe財, Ci产, 氏。2, KOZ 순으로 촉진 시 켰다.
- 반응혼합물은 어 유 유화액 0.5 mL에 각종 산소종 {40 mM H2O2, 40 mM KO2, 50 ppm FeCh, 40 mM H2O2 + 50 ppm FeCl2( - OH), 50 ppm CuSO4} 0.1 mL를 가하고, 1차, 2차 및 3차 추출물을 모두 혼합한 차가버섯 추출물 0.1 mL씩을 첨가하여 전체 반응액 의 양이 1 mL가 되도록 증류수로 조정하여 2회 반복실험을 실시하였다. 활성산소종 자체가 지방 산화에 어느 정도 영향을 미치는가를 알아보기 위해서 산소 종 대신 증류수를 가하여 TBARS 분석을 행하였다.
- 상기와 같이 차가버섯 추출물을 온도별로 추출한 후 각 추출물을 혼합하여 동결건조하여 시료를 조제한 후 이 시료가 지방산화에 미치는 영향을 검토하였다. 먼저 활성산소종 자 체 가지 방산화에 어느 정도의 영향을 미치는 지를를 알아보기 위하여 활성 산소종 대신 증류수를 넣은 대조구와 각각의 활성산소종을 넣고 어유 유화액에서 반응을 시킨 후 TBARS 값을 측정 하였다(Fig.
- 0로 볼 때 동일농도의 시료의 ABTS 양이온(ABTS') 소거능을 나타낸 수치이다. 시료의 색깔을 보정하기 위하여 ABTS 용액 대신 증류수를 가하고 시료를 첨가한 혼합물을 사용하였다. 실험 측정은 세번 반복 실험하여 평균값을 사용하였다.
- 시료의 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 시약이 추출물의 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 정량 분석하였다(21). 각각의 추출물 시료 100 J1L에 2% Na2CO3 용액 2 mL를 가하고 3분 동안 방치한 다음 50% Folin-Ciocalteu 시 약을 100 11L 가하여 3분 후 720 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 2차 추출물은 1차 추출 후 남은 잔사에 같은 부피의 증류수를 가 하고 100℃에서 8시간 동안 진탕 추출 후 여과하여 얻었으며, 다시 같은 부피의 증류수를 남은 잔사에 가하여 120℃에서 8 hr 동안 추출 후 여과하여 3차 추출액을 얻었다. 얻어진 1차, 2차 및 3차 추출물을 각기 진공동결 건조한 후 -20℃의 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 이 희석액 1 mL에 시료 50 虬를 혼합하고 실온에서 90분간 반응시 킨 후 414 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 아스코르브산 50 ppm 용액 과30 ppm 용액을 시료로 하여 동일한 방법으로 흡광도 를 측정하여 비교하였다. 414 nm에서 대조구과 처리구의 흡광도차로 나타내고 시료의 항산화력은 아래의 식으로 계산되었다.
- 대조 구는 시료 용액 대신 시료를 녹인 용매를 가하여 흡광도를 측정하였다. 이때, 아스코르브산 50 ppm과 30 ppm 용액을 시료로 하여 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 비교하였다. 실험 측정은 세번 반복 실험하여 평균값을 사용하였다.
- 산화적 스트레스의 원인이 되는 유리기 소거효과를 확인하기 위하여 유리기인 DPPH 라디칼에 대한 차가버섯 물 추줄물의 전자 공여능(electron-donating ability) 또는 라디 칼 소거능(radical-scavenging activity)-®- Blois(17)의 수정 법 (18)으로 측정하였다. 즉, 빛을 차단 시 킨 용기 를 사용하고 99.9% 메탄올에 녹인 0.15 mM DPPH 용액 1 mL와 각각의 추출 시료액 0.25 mL을 가하여 잘 혼합한 후 30분 후에 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 추출 시료액은 3차 증류수에 250 ppm 농도로 녹여 실험에 사용하였다.
- 차가버섯 1차, 2차 및 3차 추출물의 건조획분을 동일한 250 ppm 농도로 조제하여 시료로 사용하여 ABTS-* 소거 능을 측정하였다(Table 2). ABTS 양이온ABTS】)에 대한 아스코르브산의 소거능을 1.
- 차가버섯 1차, 2차, 및 3차 추출물의 건조획분을 동일한 1,000 ppm 농도로 조제하여 갈산을 기준물질로 환산하여 총 페놀 함량을 측정하였으며 총 플라보노이드 농도는 케 르세 틴을 기준물질로 환산하였다(32)(Table 3). 그 결과 1차, 2차, 및 3차 추출물의 총 페놀 함량이 각각 263 + 5.
- 각종 산소 라디칼들이 생체내의 호흡 효소계나 산화 환원 계에서 생성되어 노화와 각종 질병과 유관한 사실이 밝혀져 감에 따라 이들의 소거를 위한 항산화 물질에 대한 관심이 높아지고 있는 시점에서, 본 논문에서는 차가버섯의 대표 유효성분인 항산화 성분을 최대로 추출해내기 위한 효과적인 추출법을 시도하고자 실행하였다. 차가버섯 건조분말을 80℃에서 8시간 추출한 것을 1차 추출물, 1차 추출 후 그 잔사물에 물을 첨가하여 100℃에서 8시간 추출한 것을 2차 추출물, 2차 추출 후 남은 잔사물에 물을 첨가하여 120℃에서 8시간 추출한 것을 3차 추출물로 흥]-여서, DPPH 자유 라디 칼에 대한 전자공여능, ABTS' 라디칼 양이온 소거능, 리놀레산 자동산화 저해 효과를 봄으로서 항산화능을 측정하였다. 결과에서 항산화력은 1차 추출물이 가장 낮았고 3차 추출물이 가장 높았고, 3차 추출물은 페놀 화합물과 플라보노 이 드 함량이 1차나 2차 추출물보다 유의 적 으로 많았고, 페놀 화합물 함량은 라디 칼 소거 능 및 리놀레산 자동산화 저 해효 과와 상관관계가 높은 것(r=0.
- 차가버섯의 온도별 물 추출물이 생체막 지질의 산화에 대한 저해 작용의 가능성을 추정하기 위하여 리놀레산에 대한 항산화 효과를 실험하였다. Osawa(20)의 방법에 따라 혼합 용액은 각각의 추출 시료액 0.
- 1 mL씩을 첨가하여 전체 반응액 의 양이 1 mL가 되도록 증류수로 조정하여 2회 반복실험을 실시하였다. 활성산소종 자체가 지방 산화에 어느 정도 영향을 미치는가를 알아보기 위해서 산소 종 대신 증류수를 가하여 TBARS 분석을 행하였다.
대상 데이터
- (USA) 의 제품을 사용하였고 linoleic acid(리놀레산)는 Kanto Chemical Co.(Japan)의 제품을 사용하였다. 말론디알데히 드(malonedialdehyde, MDA)는 1, 1, 3, 3-테트라메톡시-프로 ^.
- 본 실험에 사용한 차가버섯은 러시아에서 수입한 것으로, 선별, 수세 및 건조하여 분말로 만들어 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다. 차가버섯 건조 분말 80 g에 3차 증류수 700 mL를 가하여 80℃에서 8시간 동안 진탕 추출하고 여과지(Whatman No.
데이터처리
- 2) Values represent means ±SE of triplicate experiments and those with different alphabet letters are significantly different at p<0.05 using an ANOVA test and Scheffe' test.
- 5) Values represent means ±SE of triplicate experiments and those with different alphabet letters are significantly different at p<0.05 using an ANOVA test and Scheffe' test.
- OH, 5 ppm FeCl2-4 mM H2O2； 5 ppm FeCl2； 5 ppm CuSO4； 200 ppm Inonotus obliquus extract. Values represent means ± SE of duplicate experiments and those with different alphabet letters are significantly different at p<0.05 using an ANOVA test and Scheffe test. Large and small character are expressed in Inonotus obliquus extract absence and Inonotus obliquus extract presence, respectively.
- Each extract sample was used at the final concentration of 50 ppm in the reaction mixture. Values represent means ± SE of triplicate experiments and those with different alphabet letters are significantly different at p<0.05 using an ANOVA test and Scheffe' test. Symbols are as follows； 1, ascorbic acid 10 ppm； 2, ascorbic acid 6 ppm； 3, 1st extract； 4, 2nd extract； 5, 3rd extract.
- Values represent means ± SE of triplicate experiments and those with different alphabet letters are significantly different at p<0.05 using an ANOVA test and Scheffe* test. Concentration of test solution in the reaction mixture is 10 ppm.
- 모든 실험 결과는 Statview 512*통계 프로그램을 이용하여 Student's t-test, regression analysis, 또는 ANOVA test를 한 후 post hoc Scheffe, test에 의하여 각 실험군간의 유의적인 차이를 p<0.05에서 검증하였다.
- 이때, 아스코르브산 50 ppm과 30 ppm 용액을 시료로 하여 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 비교하였다. 실험 측정은 세번 반복 실험하여 평균값을 사용하였다.
- 대조구는 시료 대신 증류수를 사용하고 활성 비교를 위해 합성 항산화제인 BHA을 각각 10 ppm과 100 ppm 농도로 사용하여 비교하였다. 실험 측정은 세번 반복 실험하여 평균치를 사용하였다. 각 추출물별 항산화성에 대한 차별성을 보기 위해서 40℃에서 반응 10일후의 과산화물 생성 억제 능(%, lipid peroxidation inhibition)<■ 다음의 식에 따라 계산하였다.
이론/모형
- 2. Antioxidative activity of water-soluble extracts from Inonotus obliquus and BHA in linoleic acid system measured by the thiocyanate method.
- Leong과 Shui(19)의 방법에 따라 차가버섯물 추출물의 항산화력의 측정은 ABTS 양이온의 소거능을 실험하였다. ABTS는 유리기들(hydroxyl, peroxy 1, alkoxyl, inorganic radicals)과 반응하여 414 nm에서 흡광하는 상대적으로 안 정한 양이온(ABTS')을 생성한다.
- 3. Lipid peroxidation inhibitory activities of each water-soluble extraction from Inonotus obliquus by ferric thiocyanate method.
- 차가버섯의 온도별 물 추출물이 생체막 지질의 산화에 대한 저해 작용의 가능성을 추정하기 위하여 리놀레산에 대한 항산화 효과를 실험하였다. Osawa(20)의 방법에 따라 혼합 용액은 각각의 추출 시료액 0.2 mL, 99.9% 에탄올에 녹인 2.5% 리놀레산 0.2 mL, 0.2 M 인산완충액 (pH 7.0) 0.4 mL, 증류수 0.2 mL을 가하여 반응 혼합물을 만든 후 밀봉을 하여 40℃ 암소에 보관하면서 반응 후 13일까지 측정하였다. 이 반응 혼합물 0.
- Thiobabituric acid reacitive substances(TBARSBuege 와 Aust(23)의 방법에 따라서 반응혼합물당 생성된 말론디 알데히드(malonedialdehyde, mg)량을 측정하였다. 1 mL 반 응혼합물이 채워진 시험관을 37℃ 수조에서 1시간 동안 반응 시 켰다.
- 산화적 스트레스의 원인이 되는 유리기 소거효과를 확인하기 위하여 유리기인 DPPH 라디칼에 대한 차가버섯 물 추줄물의 전자 공여능(electron-donating ability) 또는 라디 칼 소거능(radical-scavenging activity)-®- Blois(17)의 수정 법 (18)으로 측정하였다. 즉, 빛을 차단 시 킨 용기 를 사용하고 99.
- 시료 중의 플라보노이드 함량은 Moreno 등(22)의 방법에 따라 측정하였다. 각 추출물 시료 0.
- Miller 등(25)은 ABTS: 발생 방법으로서 메트미오글로빈 (metmyoglobin)의 과산화효소(peroxidase)를 사용하였고 이것이 페릴미오글로빈(ferryl myoglobin)과 반응하여 생성 되는 ABTS 는 650 nm, 734 nm, 820 nm 에서 최대 흡광도를 나타내는 것을 이용하였다. 이후 Roberta 등(26)는 ABTS 용액과 과황산칼륨 용액을 반응시 켜 생 성 되는 ABTS는 415 nm, 645 nm, 734 nm, 815 nm에서 유의적인 흡광도를 나타낸다고 하였는데 본 실험에서는 Leong과 Shui(19)의 방법에 따라 414 nm에서 최대의 흡광도를 나타내는 것을 이용하였다.
성능/효과
- 980, regression anal- ysis)으로 나타났다. 또한 각 온도에서의 추출물을 혼합하여 지방 산화 촉진인자인 3종의 활성산소종(KO2, H2O2, -OH) 과 금속이 온 Fe*, Cu") 존재 하에서 항산화 효과를 TBARS 값으로 측정한 결과, 차가추출물이 모두의 경우에서 TBARS 값을 낮추었으며 특히 ・OH와 Fe2+ 이온에 대하여 탁월한 항산화능을 보였다. 이상의 결과로 미 루어 보아 자유 라디 칼 로 인해 야기되는 지방을 비롯한 그 산화물에 대하여 3단계 온도 추출법 에 의한 차가버 섯 추출물은 매우 유효한 항산화제로서 작용할 수 있을 것으로 사료되어진다.
- 3에 나타내었다. 1 차, 2차, 및 3차 추출물 10 ppm의 농도에서지 방산화 억제효과가 각각 59.3+1.6%, 80.0 + 0.1%, 및 87.5 ± 0.3%로 나타났으며 추출온도가 높을수록 리놀레산 지방산 화에 대한 저해효과가 높은 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 BHA의 경우 91.
- 따라서 차가버섯 건조 분말 80 g에 증류수 700 mL를 가하여 80℃, 100℃, 및 120℃에서 연속하여 3차례에 걸쳐 추출하였으며, 그 결과를 Table 1에 나타내었다. 1차 추출에서 총 고형분의 63%가 추출되었으며 2차 추출에서 25%, 3차 추출물에서 약 12% 정도가 추출되었다. 이상의 결과로 보아 80℃에서 1차 추출할 경우 반 이상의 고형분이 나옴을 알 수 있으며 추출횟수가 증가함에 따라 고형분의 양은 현저히 감소함을 알 수 있었다.
- 차가버섯 1차, 2차 및 3차 추출물의 건조획분을 동일한 250 ppm 농도로 조제하여 시료로 사용하여 ABTS-* 소거 능을 측정하였다(Table 2). ABTS 양이온ABTS】)에 대한 아스코르브산의 소거능을 1.0로 볼 때 동일농도의 1차, 2차 및 3차 추출물은 각각 0.237 + 0.001, 0.388 ± 0.005 및 0.432 ± 0.003의 ABTS 양이온(ABTS') 소거능을 나타내었고, 앞의 DPPH 자유 라디칼 소거효과와 마찬가지로 1차 추출물의 항산화력은 상대적으로 높은 온도에서 추출되는 2차, 3차 추출물의 항산화력에 비하여 월등히 낮음을 알 수 있었다. 상기 두 가지의 방법의 항산화력을 비교해 보면 3차 추출물의 경우 DPPH 법 에 의해 측정한 것이 아스코르브산의 항산 화력의 약 20%인데 반하여, ABTS법에 의하면 약 43%가 나와 ABTS 에 의한 방법으로 측정한 항산화력 이 다소 높게 나왔다.
- 2에 나타내었다. BHA 또는 차가 버섯 추출물 대신 증류수를 첨가한 대조군은 2일 경과 후부터 12일까지 과산화물이 급격히 증가한데 반하여 반응 혼합물에서의 최종 농도가 BHA 10 ppm, 100 ppm, 그리고 각 차가 추출물을 50 ppm 되도록 첨가하였을 때 12일까지 다소의 과산화물의 증가를 보였을 뿐 90% 이상의 지방 산화 억 제효과가 나타났다. 따라서 1차, 2차 및 3차 차가추출물 50 ppm에서 리놀레산의 자동 산화를 현저히 감소시킴을 알 수 있었다.
- 각 온도별 차가버섯 물추출물을 동일한 시료농도 250 ppm(반응물에서의 실제 최종 농도는 50 ppm)으로 조제하여 전자공여능(electron-donating ability)을 측정한 결과 1차, 2차, 및 3차 추출물은 각각 56.5+1.9%, 76.7 ±0.5%, 및 83.9 ±0.9%를 나타내어 유의성 있게 증가하였다(Fig. 1). 이와 같은 사실은 온도가 낮은 상태에서 추출한 것보다 높은 곳에서 추출한 경우 항산화력 이 더 높은 물질이 추출됨을 시 사한다.
- 차가버섯 건조분말을 80℃에서 8시간 추출한 것을 1차 추출물, 1차 추출 후 그 잔사물에 물을 첨가하여 100℃에서 8시간 추출한 것을 2차 추출물, 2차 추출 후 남은 잔사물에 물을 첨가하여 120℃에서 8시간 추출한 것을 3차 추출물로 흥]-여서, DPPH 자유 라디 칼에 대한 전자공여능, ABTS' 라디칼 양이온 소거능, 리놀레산 자동산화 저해 효과를 봄으로서 항산화능을 측정하였다. 결과에서 항산화력은 1차 추출물이 가장 낮았고 3차 추출물이 가장 높았고, 3차 추출물은 페놀 화합물과 플라보노 이 드 함량이 1차나 2차 추출물보다 유의 적 으로 많았고, 페놀 화합물 함량은 라디 칼 소거 능 및 리놀레산 자동산화 저 해효 과와 상관관계가 높은 것(r=0.960 ~0.980, regression anal- ysis)으로 나타났다. 또한 각 온도에서의 추출물을 혼합하여 지방 산화 촉진인자인 3종의 활성산소종(KO2, H2O2, -OH) 과 금속이 온 Fe*, Cu") 존재 하에서 항산화 효과를 TBARS 값으로 측정한 결과, 차가추출물이 모두의 경우에서 TBARS 값을 낮추었으며 특히 ・OH와 Fe2+ 이온에 대하여 탁월한 항산화능을 보였다.
- 차가버섯 1차, 2차, 및 3차 추출물의 건조획분을 동일한 1,000 ppm 농도로 조제하여 갈산을 기준물질로 환산하여 총 페놀 함량을 측정하였으며 총 플라보노이드 농도는 케 르세 틴을 기준물질로 환산하였다(32)(Table 3). 그 결과 1차, 2차, 및 3차 추출물의 총 페놀 함량이 각각 263 + 5.8, 372 ±6.6, 417 ±16.4 ug/mL으로서 온도가 높아질수록 페놀 화합물의 농도가 증가하였다. 폴리 페놀의 대표적인 성분인 플라보노이드의 함량에 있어서도 15.
- 0014를 나타내었다. 그 결과 플라보노이드보다는 페놀성 물질과 항산화력과의 상관관계가 더 높은 것으로 나타났으며 항산 화력을 나타내는 물질은 총페놀의 함량이 크게 기여함을 알 수 있었斗.
- BHA 또는 차가 버섯 추출물 대신 증류수를 첨가한 대조군은 2일 경과 후부터 12일까지 과산화물이 급격히 증가한데 반하여 반응 혼합물에서의 최종 농도가 BHA 10 ppm, 100 ppm, 그리고 각 차가 추출물을 50 ppm 되도록 첨가하였을 때 12일까지 다소의 과산화물의 증가를 보였을 뿐 90% 이상의 지방 산화 억 제효과가 나타났다. 따라서 1차, 2차 및 3차 차가추출물 50 ppm에서 리놀레산의 자동 산화를 현저히 감소시킴을 알 수 있었다. 二L러나 각 추출물이 50 ppm에서는 자동산화 억제 효과에 있어 서로간의 차이가 보이지 않아 각 추출물별 차별성을 보기 위하여 각 시료를 10 ppm 농도로 조제하여 40℃에서 10일간 과산화물 생성 억제능(%)을 계산한 결과를 Fig.
- 3%를 나타내었다. 따라서 50 ppm 농도의 2와 3차 추출물 시료의 수소공 여능은 아스코르브산 6 ppm에서 10 ppm 정도의 수소 공여 능 을 보였으며 그 중 수소공여능이 가장 높은 3차 추출물인 경우 RCa)(자유 라디칼의 50% 저해시키는데 요구되는 농도) 이 약 30 ppm 정도로서 Cho 등(24)이 보고한 식용식물의 항산화 효과를를 검색한 결과의 경우와 비교해 보아도 참취 잎을 제외하고 여타 식용식물에 비하여 차가버섯 추출물이 월등히 높은 항산화력을 나타내었다.
- 003의 ABTS 양이온(ABTS') 소거능을 나타내었고, 앞의 DPPH 자유 라디칼 소거효과와 마찬가지로 1차 추출물의 항산화력은 상대적으로 높은 온도에서 추출되는 2차, 3차 추출물의 항산화력에 비하여 월등히 낮음을 알 수 있었다. 상기 두 가지의 방법의 항산화력을 비교해 보면 3차 추출물의 경우 DPPH 법 에 의해 측정한 것이 아스코르브산의 항산 화력의 약 20%인데 반하여, ABTS법에 의하면 약 43%가 나와 ABTS 에 의한 방법으로 측정한 항산화력 이 다소 높게 나왔다. 이것은 라디칼이라는 점에서는 같으나 DPPH 경우는 자유 라디 칼이 지만 ABTS는 양이 온 라디칼이 라는 점 에서 또는 페놀 물질의 종류가 다름에 따라 두 기질에 결합하는 정도가 다르며 결국 라디 칼을 제거하는 능력이 차이가 나는 데 기인하는 것으로 사료된다(27).
- 예비 실험을 통하여 차가버섯으로부터 주줄되는 고형분을 차가버섯 농도 및 추출 시간별로 검토한 결과 버섯의 약 10배 량 정도에서 가장 많은 고형분의 양이 추출되었으며 추출 시간별로 추출되는 고형분의 함량을 측정한 결과 추출시간을 8시간보다 더 길게 하였을 경우에도 고형분 함량은 거의 증가하지 않았다. 따라서 고형분 추출량의 관점에서 상기의 조건이 적절한 추출조건으로 사료되었다.
- 이상과 같이 세 가지 측면에서의 항산화 효과를 검토한 결과 세 가지 방법 모두에서 3차 추출물이 가강 높은 항산화력을 나타내었음을 알 수 있었다. 따라서 페놀 화합물과 플라보노이드의 유효성 분과 3가지 항산화력과의 상호 관련성을 보기 위해 regression analysis를 행하였다.
- 또한 각 온도에서의 추출물을 혼합하여 지방 산화 촉진인자인 3종의 활성산소종(KO2, H2O2, -OH) 과 금속이 온 Fe*, Cu") 존재 하에서 항산화 효과를 TBARS 값으로 측정한 결과, 차가추출물이 모두의 경우에서 TBARS 값을 낮추었으며 특히 ・OH와 Fe2+ 이온에 대하여 탁월한 항산화능을 보였다. 이상의 결과로 미 루어 보아 자유 라디 칼 로 인해 야기되는 지방을 비롯한 그 산화물에 대하여 3단계 온도 추출법 에 의한 차가버 섯 추출물은 매우 유효한 항산화제로서 작용할 수 있을 것으로 사료되어진다.
- 일반적으로 추출 용매 에 있어 극성 이 낮은 획 분들이 높은 획 분들에 비해 반응기질 인 리놀레산에 대한 친화성 및 용해성이 크기 때문에 항산화력이 높은 것으로 나타나는데(28, 30) 본 실험에서는 추출을 위한 용매가 극성이 가장 높은 물임에도 불구하고 리놀레산에 대한 항산화력이 높게 나타난 결과는 괄목할만한 것으로 사료된다. 이상의 결과로 미루어 보아 차가버섯 3차 추출물 속에 리놀레산이 산화된 주 생성물인 과수산옥타카데킨산 (hydroperoxy-octadecadienoic acid) 이성질체와 옥소옥타 카데킨 산(oxooctadecadienoic acid) 이성질체 등에 대하여 수소공여체로 작용하는 물질이 가장 많이 함유되어 있으며 이와 같은 결과는 생체막을 구성하는 지질의 과산화를 가장 효과적으로 억제할 수 있는 가능성이 높은 것으로 사료된다(31).
- 8 Ug/mL으로 나타나 온도가 높아질수록 플라보노이드의 농도도 증가함을 알 수 있었다. 이상의 결과로 미루어 보아 추출온도가 높아질수록 추출되는 여 타 물질에 비하여 페놀 화합물 및 플라보노이드의 양이 상대적으로 증가하는 것으로 사료된다. 그러나 회수된 총 고형분에 함유된 총 페 놀 화합물 및 플라보노이드의 양은 1차 추출물, 2차 추출물, 3차 추출물의 순으로 적어졌다.
- 1차 추출에서 총 고형분의 63%가 추출되었으며 2차 추출에서 25%, 3차 추출물에서 약 12% 정도가 추출되었다. 이상의 결과로 보아 80℃에서 1차 추출할 경우 반 이상의 고형분이 나옴을 알 수 있으며 추출횟수가 증가함에 따라 고형분의 양은 현저히 감소함을 알 수 있었다.
- OH이 다른 산소종에 비해 지방산화를 일으키는데 결정적인 역할을 한다는 내용과 잘 일치한다고 볼 수 있다. 이상의 여러 가지 산소종 및 금속 이온과 차가추출물이 공존하는 상태에서 지방산화의 정도를 측정한 결과 공히 차가 추출물이 첨가되지 않은 구에 비하여 모두 횔씬 낮은 TBARS값을 나타내 어 지 방산화를 억제 하는 효과가 우수한 것으로 나타났다. 활성산소종 중에서 ・OH에 대한 영향을 보면 이 라디칼과의 높은 포집능으로 인해 대조군 1.
- 활성 산소가 첨가되지 않은 대조군에 비하여 ・OH 그 자체가 가장 강한 지방 산화 촉진작용을 나타내었고 그다음은 Fe財, Ci产, 氏。2, KOZ 순으로 촉진 시 켰다. 이와 같은 결과는 정도의 차이는 있으나 Kim 등(36)이 실험한 결과와 비슷한 결과로서 활성산소를 전혀 넣지 않은 대조 구(0.39 MDA ppm)에 비하여 -OH 첨가구의 경우 1.30 MDA ppm으로서 약 3배 정도 지 방산화를 증가 시 키는 효과가 있었고 H2O2 첨가구는 0.45 MDA ppm로서 대조구에 비해 다소 증가 효과가 있었으며 4 mM 농도의 KO2 첨가구는 0.30 MDA ppm으로서 오히려 다소 지방 산화를 억제하는 효과가 있었다. 이와 같은 결과는 Halliwell과 Gutteridge(3) 가 보고한 .
- 따라서 페놀 화합물과 플라보노이드의 유효성 분과 3가지 항산화력과의 상호 관련성을 보기 위해 regression analysis를 행하였다. 페놀 화합물과 DPPH, ABTS, 및 리놀레산 자동산화 해효과와의 관련성은 각각 R=0.960, 0.977, 0.967이었고 세 가지 경우 모두 p= 0.0001 나타났다. 또한 플라보노이드와 각 항산화성과의 관련성은 R=0.
- 4 ug/mL으로서 온도가 높아질수록 페놀 화합물의 농도가 증가하였다. 폴리 페놀의 대표적인 성분인 플라보노이드의 함량에 있어서도 15.7± 1.5 Ug/mL, 22.4±1.7 Ug/mL, 32.9 ±1.8 Ug/mL으로 나타나 온도가 높아질수록 플라보노이드의 농도도 증가함을 알 수 있었다. 이상의 결과로 미루어 보아 추출온도가 높아질수록 추출되는 여 타 물질에 비하여 페놀 화합물 및 플라보노이드의 양이 상대적으로 증가하는 것으로 사료된다.
- 이상의 여러 가지 산소종 및 금속 이온과 차가추출물이 공존하는 상태에서 지방산화의 정도를 측정한 결과 공히 차가 추출물이 첨가되지 않은 구에 비하여 모두 횔씬 낮은 TBARS값을 나타내 어 지 방산화를 억제 하는 효과가 우수한 것으로 나타났다. 활성산소종 중에서 ・OH에 대한 영향을 보면 이 라디칼과의 높은 포집능으로 인해 대조군 1.30 mg MDA/L을 0.16 mg MDA/L 정도로 낮추어 다른 활성 종에 비해 효과적으로 과산화물의 생성을 억제시켰다. Fe"은 그 자체가 강한 지방산화촉진작용을 나타내며 이들 이온에 의한 지방산화의 정도는 추출물이 이들 금속 이온에 대한 결합 능이 우수할수록 지방산화를 억제하는 항산화력 이 높게 나타내는 것으로 알려져 있는데 차가추출물이 Fe2+ 이온에 대한 결합력은 매우 우수하여 높은 항산화능을 보인 것으로 사료된다.
후속연구
- Fe"은 그 자체가 강한 지방산화촉진작용을 나타내며 이들 이온에 의한 지방산화의 정도는 추출물이 이들 금속 이온에 대한 결합 능이 우수할수록 지방산화를 억제하는 항산화력 이 높게 나타내는 것으로 알려져 있는데 차가추출물이 Fe2+ 이온에 대한 결합력은 매우 우수하여 높은 항산화능을 보인 것으로 사료된다. 실제 생체 내에서의 차가버섯의 항산화 효과를 현재 실험 중이며 이 결과가 나온다면 향후 생체 내의 조건에서 만들어지는 라디칼에 의해 생성되는 지방산화물을 포함한 부분 산화된 유해물질을 보호하기 위한 항산화제로서의 역할이 보다 명확해지리라 사료되어진다.
- 이러한 관점에서, 일차적으로 고온의 조건에서 파괴되거 나 휘 발성 등으로 인해 소실가능성이 높은 유효성 분은 저 온 추출하고, 고온에서만 추출 가능한 유효성분은 상대적으로 높은 온도에서 단계별로 회수한 후, 각 추출물에 대하여 라 디 칼 소거능을 가지는 항산화성 의 몇 가지 유효성 분들의 양을 비교 검토한다면 상기에 설명한 문제점을 해결할 수 있는 방안을 찾을 수 있을 것으로 사료된다. 또한 유효성분을 최대한 회수할 수 있는 효과적인 추출법을 시도하여 추출온도와 항산화성 물질들 간의 상호 관계를 규명하고 지방산화에 대한 억제정도를 밝힘으로서 유해 활성산소로 인해 야기되는 여러 질환에 대한 유효한 건강식품으로서의 기능성을 평가하고자 본 실험을 수행하였다.
- 플라보 노이드는 페놀화합물 중에서 자연적으로 생성되는 가장 큰 그룹의 하나로서 이것은 다시 안 토시 아닌(anthocyanins), 칼 콘(chaicones), 오론(aurones), 플라본(flavones), 플라보놀 (flavonols) 및 이들의 유도체 등으로 나눌 수 있다. 현재까지 페놀 화합물 및 플라보노이드의 구체적인 구조에 따른 항산 화 활성과의 상관성에 대한 연구도 있으나 (34, 35) 추출온도에 따라 추출되는 페놀 화합물의 구조적 다양성에 대한 연구 도 추가적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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