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제안 방법
- 이 세포 현탁액을 초음파를 이용하여(sonic & materials ING, USA) cell을 깨고(Output watts 5, 30초씩, 6회), 원심분리 (8, 000 rpm, 20분, 4°C) 후 싱층액에 ammonium sulfate를 50%까지 포화시키면서 첨가하였다. 그리고 다시 원심분리 (8, 000 rpm, 20분, 4。0 하여 그 침전물을 동량의 완충액 A에 용 해 시킨 후 동일한 완충액 A로 2번 투석하였다. 그 후, DEAE- Sephacel column chromatography(용출액 : 완충액 A, 0—L0M NaCl gradient, 용출 속도 : 2.
- 추출 후 EtOAc층을 수층과 분리하고, EtOAc 추출액에 Na2SO4< 넣어 여분의 수분을 제거한 후 감압 증류하여 EtOAc층을 농축하였다. EtOAc를 이용하여 1차적으로 분리한 물질을 chloroform : methanol=2 :1을 용출 용매로 silica gel column chromatography 하여 3개의 분획을 얻었다. 항균 활성이 높은 분획을 chloroform: methanol=20:1의 전개 용매로 silica gel preparative TLC 흐卜 여 각각의 다른 색을 나타내는 분획을 다시 EtOAc에 녹여 항균 활성 및 GTase 억제 활성을 조사하였다.
- 대조군으로는 100"의 GTase 대신 100以의 완충액 B를 첨가한 것으로 나머지는 동일한 시약을 넣어 같이 반응시킨 것을 사용하였다. GTase 억제 활성도는 각 시료와 Glkse를 미리 반응시킨 후 GTase 활성도를 측정하였으며 대조군으로는 시료를 녹인 용매 ethyl acetatef- 시료 대신 사용하였다.
- GTase 활성도& 는 기질인 sucrose로부터 glucose가 글루칸 증 합체(glucan polymer: dextran)로 편입되어 생성한 치석의 양을 측정하여 얻었다. 정제된 Glase 100 나을 0.
- 따라서 본 연구에서는 Streptomyces sp. M-20 균의 대사물을 추출 및 분획하고, 그 분획들의 S. 血에 대한 항균 활성과 S. 所誡ans의 GTase에 대한 저해 활성을 측정하여 충치 예방의 개발 가능성을 조사하였다.
- 2에서 보는바 와 같이 색을 나타내는 분획 중 노란색 (MY-20)을 나타내는 분 획과 붉은 색(MR-20)을 나타내는 분획을 각각 EtOAcS. 다시 추출하여 여러 가지 발색 시약으로 특성을 조사하였다. Table I에 서 보는 바와 같이 MY-20은 Bial's reagent, phosphomolybdic acid(PMA)에서 발색 반응이 나타났다.
- 5%로 접종하여 7일간 배양 (28°C, 120 rpm) 하여 보라색 상등액으로부터 다음과 같은 방법으로 대사물을 추출하였다. 대사물을 추출하기 위하여 filter paper(Whatman No. 4)를 이용하여 상등액과 세포을 분리하고, 상등액을 동량의 ethyl acetate(EtOAc)로 3회 추출하였다. 추출 후 EtOAc층을 수층과 분리하고, EtOAc 추출액에 Na2SO4< 넣어 여분의 수분을 제거한 후 감압 증류하여 EtOAc층을 농축하였다.
- 몽골의 흙에서 분리된 균종를 동정하기 위하여 균주에서 분리한 chromosomal DNA를 16s rDNA primer를 이용하여 PCR 반응 후 ThKaRa Korea의 유전자 해석센터에 의뢰하여 DNA 염기서열을 분석하였다. 분석된 서열은 NCBI의 Blast search program을 이용하여 상동성을 조사한 결과 Streptomyces lincol*瓜is와 95%~96% 일치하였으며 Streptomyces sp.
- PCR의 조건은 시작 denaturation 단계를 94°C에서 1분간 실시하였고, 94。。에서 1분, 51°C에서 1분, 72°C에서 1분씩 30 cycle 반응 후 마지므上 extention 단계는 72。0에서 7분간 더 실시하였다. 반응 후 0.8% agarose gel에 전기영동을 실시하여 분리된 PCR 산물을 Gel Extraction Kit(QIAquick®, Hilden, Germany)를 이용하여 설명서에 기재된 방법에 따라 gel로부터 추출하였다. 추출한 PCR 산 물을 agarose gel(1.
- 분리 주인 M-20에서 분리된 chromosomal DNA를 PCR premix(AccuPower®PCR PreMix, Bioneer)kit를 이용하여 16s rDNA forward primer(5七AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3, 20 pmol) 2 叫 16s rDNA reverse primer(5'-AAGGAGGTGAT- CCAGCCGCA-3', 20 pmol) 2 山, template 1 卩/, deionized water 15 B를 첨가하여 PCR을 실시하였다. PCR의 조건은 시작 denaturation 단계를 94°C에서 1분간 실시하였고, 94。。에서 1분, 51°C에서 1분, 72°C에서 1분씩 30 cycle 반응 후 마지므上 extention 단계는 72。0에서 7분간 더 실시하였다.
- 5%)을 이용하여 추출 여부를 확인한 후 TaKaRa Korea의 유전자 해석센터에 의뢰하여 DNA 염기서열을 분석하였다. 분석된 서열은 NCBI의 Blast search program을 이용하여 상동성 조사를 실시하였다.
- 01% thimerosal을 함유한 완충액 C에서 72시간 동안 배양한 후 1% periodic acid에서 2시간 동안 배양한 뒤, 15% acetic acid에서 2시간 동 안 세척하였다. 빛을 차단한 통에 Schiffs reagent를 적당량 첨가 후 겔을 4°C에서 2시간 반응시키고 10% acetic acid에서 탈색 시켜 관찰하였다.
- A)으로 1회 washing 한 후, cell pellet의 무게와 동량의 완충액 A에 현탁하였다. 이 세포 현탁액을 초음파를 이용하여(sonic & materials ING, USA) cell을 깨고(Output watts 5, 30초씩, 6회), 원심분리 (8, 000 rpm, 20분, 4°C) 후 싱층액에 ammonium sulfate를 50%까지 포화시키면서 첨가하였다. 그리고 다시 원심분리 (8, 000 rpm, 20분, 4。0 하여 그 침전물을 동량의 완충액 A에 용 해 시킨 후 동일한 완충액 A로 2번 투석하였다.
- 4)를 이용하여 상등액과 세포을 분리하고, 상등액을 동량의 ethyl acetate(EtOAc)로 3회 추출하였다. 추출 후 EtOAc층을 수층과 분리하고, EtOAc 추출액에 Na2SO4< 넣어 여분의 수분을 제거한 후 감압 증류하여 EtOAc층을 농축하였다. EtOAc를 이용하여 1차적으로 분리한 물질을 chloroform : methanol=2 :1을 용출 용매로 silica gel column chromatography 하여 3개의 분획을 얻었다.
- 8% agarose gel에 전기영동을 실시하여 분리된 PCR 산물을 Gel Extraction Kit(QIAquick®, Hilden, Germany)를 이용하여 설명서에 기재된 방법에 따라 gel로부터 추출하였다. 추출한 PCR 산 물을 agarose gel(1.5%)을 이용하여 추출 여부를 확인한 후 TaKaRa Korea의 유전자 해석센터에 의뢰하여 DNA 염기서열을 분석하였다. 분석된 서열은 NCBI의 Blast search program을 이용하여 상동성 조사를 실시하였다.
- EtOAc를 이용하여 1차적으로 분리한 물질을 chloroform : methanol=2 :1을 용출 용매로 silica gel column chromatography 하여 3개의 분획을 얻었다. 항균 활성이 높은 분획을 chloroform: methanol=20:1의 전개 용매로 silica gel preparative TLC 흐卜 여 각각의 다른 색을 나타내는 분획을 다시 EtOAc에 녹여 항균 활성 및 GTase 억제 활성을 조사하였다.
대상 데이터
- 반응 후 생성된 불용성 glucan 을 분광 광도계로 550 nm에서 측정하였다. 대조군으로는 100"의 GTase 대신 100以의 완충액 B를 첨가한 것으로 나머지는 동일한 시약을 넣어 같이 반응시킨 것을 사용하였다. GTase 억제 활성도는 각 시료와 Glkse를 미리 반응시킨 후 GTase 활성도를 측정하였으며 대조군으로는 시료를 녹인 용매 ethyl acetatef- 시료 대신 사용하였다.
- Sty어)tomyces sp. M-20 균은 본 실험실에서 몽골의 흙에서 분리한 균종으로 사용한 계대 배양을 위한 배지는 Tryptic Soy Broth(TSB)이며 대사물 생산에 사용된 배지는 0.5% glucose, 0.5% L-sodium glutamate, 0.25% iqHPQ와 0.05% MgSQ를 함유한 최소 배지 (PGI) 로 28°C에서 진탕 배양하였다.
- (Detroit, USA)에서 구입하였다. PCR premix 및 DNA 분리용 시약은 Bioneer (Korea)에서 구입하였으며, Gel extraction kit는 QIAgen(Hilden, Germany)에서 구입하였다. 그 외 실험에 사용한 시약 및 용매류는 국내외에서 시판하는 특급 시약을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 균주는 Streptococcus 冲成次(KCTC 3065) 이며 한국생명공학연구원 유전자은행 실에서 분양받아 1주에 한 번씩 계대배양 하였으며 배지는 Brain Heart Infusion(BHI) 을 사용하였다. Sty어)tomyces sp.
이론/모형
- 각 시료의 항균 활성의 측정은 평판배지 디스크 확산법 25)을 사용하였다. 멸균된 円per Disc(직경 8 mm)에 50也의 각 시료를 흡수시킨 후, S.
- 분리된 GEse의 전기영동은 6% SDS-PAGE를 이용하여 Laemmli 방법 23)으로 행하였으며 염색은 methanol-acetic acid- water(40:10:50, by volume)에 녹인 0.15%(w/v) Coomassie brilliant blue R-250를 이용하였으며, 탈색은 methanol-acetic acid-water(40:10:50, by volume) 용액을 이용하였다. Glased 활성 염색 24)을 위하여 SDS-PAGE 후 1% Triton x」00을 함유한 20 mM potassium phosphate buffer(pH 6.
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