티올특이성 산화환원 단백질인 peroxiredoxin (thiolspecific peroxiredoxin, Prx) 은 거의 모든 생명체에 존재하며, reactive oxgen species (ROS)을 제거하는 역할을 수행한다. 전자현미경/image processing을 이용하여 세포의 방어기작에 중요한 기능을 수행하는 Prx의 구조를 분석하였다. Yeast-Prx는 크게 세 가지의 다른 형태 즉, 구 형태, ring 형태의 구조와 비 규칙적인 적은 입자로 구성되어 있음을 확인하였다. 또한 산화/환원 상태에서의 구조적 변화를 관찰하기위해 DTT와 $H_2O_2$를 처리 후 전자현미경을 관찰 하였다. 환원상태의(DTT 처리 후) yeast-Prx는 많은 decamer 구조를 보여주는 반면, 산화상태에서는 ($H_2O_2$ 처리 후) dimer나 구 형태의 구조를 보여 주고 있다. 또한 dimeric subunit간의 ionic interaction이 yeast-Prx의 oligomerization에 중요한 인자임을 확인하였다.
티올특이성 산화환원 단백질인 peroxiredoxin (thiolspecific peroxiredoxin, Prx) 은 거의 모든 생명체에 존재하며, reactive oxgen species (ROS)을 제거하는 역할을 수행한다. 전자현미경/image processing을 이용하여 세포의 방어기작에 중요한 기능을 수행하는 Prx의 구조를 분석하였다. Yeast-Prx는 크게 세 가지의 다른 형태 즉, 구 형태, ring 형태의 구조와 비 규칙적인 적은 입자로 구성되어 있음을 확인하였다. 또한 산화/환원 상태에서의 구조적 변화를 관찰하기위해 DTT와 $H_2O_2$를 처리 후 전자현미경을 관찰 하였다. 환원상태의(DTT 처리 후) yeast-Prx는 많은 decamer 구조를 보여주는 반면, 산화상태에서는 ($H_2O_2$ 처리 후) dimer나 구 형태의 구조를 보여 주고 있다. 또한 dimeric subunit간의 ionic interaction이 yeast-Prx의 oligomerization에 중요한 인자임을 확인하였다.
Peroxiredoxins (Prxs) are a superfamily of thiol-specific antioxidant proteins present in all organism and involved in the hydroperoxide detoxification of the cell. To determine the structural organization of yeast-Prx, electron microscopic analysis was performed. The average images of yeast-Prxs re...
Peroxiredoxins (Prxs) are a superfamily of thiol-specific antioxidant proteins present in all organism and involved in the hydroperoxide detoxification of the cell. To determine the structural organization of yeast-Prx, electron microscopic analysis was performed. The average images of yeast-Prxs revealed three different structure, i.e. spherical-shaped structure, ring-shaped structure and irregularly-shaped small particles. In order to analyze the conformational change of yeast-Prx by reduction and oxidation, Prxs were subjected to DTT and $H_2O_2$. In presence of DTT, yeast-Prx showed a high tendency to form a decamer. However, they changed into dimeric or spherical structure in the oxidized state. Here we also show ionic interaction between dimeric subunits is primarily responsible for yeast-Prx oligomerization.
Peroxiredoxins (Prxs) are a superfamily of thiol-specific antioxidant proteins present in all organism and involved in the hydroperoxide detoxification of the cell. To determine the structural organization of yeast-Prx, electron microscopic analysis was performed. The average images of yeast-Prxs revealed three different structure, i.e. spherical-shaped structure, ring-shaped structure and irregularly-shaped small particles. In order to analyze the conformational change of yeast-Prx by reduction and oxidation, Prxs were subjected to DTT and $H_2O_2$. In presence of DTT, yeast-Prx showed a high tendency to form a decamer. However, they changed into dimeric or spherical structure in the oxidized state. Here we also show ionic interaction between dimeric subunits is primarily responsible for yeast-Prx oligomerization.
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문제 정의
: 1992). 이와 같이 티옱 특이 성산화환원 단백질이 환원상태에서 oligomer로 존재함 올 단지 gd filtration의 결과만으로 추정하고 있을 뿐, 산화 상태에서 환원 상태로 어떻게 또 왜 구조적 변화룰 보이 는지 에 대한 연구는 전무한 상태 이다 따라서 본 연구에서는 전자현미경과 image processing 을 이용하여 yeast Prx의 구조와 산화/환원 상태에 따론구조적 변화, oligomerzation의 기작을 규명하고자 한다
제안 방법
2) 에서 보는 것처럼, monomer간의 상호 작용은 S-S 결합으로 이루어지나, dimer간의 interactione 아지 규명되지 않고 있다. Dimer간 또는 monomer간의상호작용올 이해하기위해 다론 pH (pH 3 ~10), 여러능도의 NaCl(lOO~3OOmM0] Yeast Prx를 배양 후 전자현미경/image processing으로 구조적 변화를 관찰하였다 먼저 dimer(또는 decamer)를 중성에서 강염기와 강산성으로 pH를 변화시켜도 oligomer형태의 변화를 전혀 관찰 되지 않았다(Fig. 3a, b). 이와 같은 결과는 thiol-specific antioxidant protein (TAS; 23 kDa)이 pH변화에 따론 oligomer형태의 변화를 HPLC gel filteration chromatography을 이용하여 보고한 결과 즉, pH 5.
Technai 12 전자현미경으로 120kV에서 51, 600 × 의 배율로 (nominal magnification : 52, 000x) Low-Does System을 이용하여 촬영하였으며, Kodak 4489 Film에 기록하였다. Optical diffractometer를 이용*여 흥 인화된 전자현미경 사진에 나타난 astigmatism (난시 현상)과 drift 현상들을 관찰하였으며 image analysis와 processing을 위해 적절한 사진을 선택하였다.
링 형태 (end-on view)의 Prx의 전자현미경 사진에서도 뚜렷하게 5개의 subunit으로 이루어져 있으며, 중앙에 stain이 채워진 hole이 있음을 알 수 있다. Top-on view의 image processing을 위해 409 개의 입자들을 선별하여 translation과 rotation시킨 후 alignment시킨 data set에서 얻은 eigenvector/eigen-value의 기초로 분석 및 correlation average를 구하였다, 가장 많은 information을 포함한 3개의 eigenvector 를 이용하여 유사한 형태별로 구분(classification) 즉 3개의 class로 나누었다 Symmetry를 시키지 않은 각 class average.들세서 5-fold symmetry를 뚜렷이 가지고 있음을 보여주고 있다.
알려져 있다(Wood etal, 2003). Yeast Prx의 산화, 환원에 따른 구조의 변화룰 고찰하기위해, DTT와 H2O2을 처리하여 전자현미경으로 관찰하였다 Dimer 형태의 Yeast Prx (Fig. 2a)에 lOmMDTT를 처리 (overneight)할 경우, monomer간의 S-S 결합(disulfide bond) 은 환원상태 (SH)로 변화될 것이며, 이때 Prx 는 dimer 형태에서 다론 어떤 oligomer 형태로 바뀔 것이다 DTT처리 후 전자현미경 사진 (Fig. 2b)에서 dimer 형태의 oligomer는 적은 비율(약 30% 미만) 로 관찰할 수 있는 반면, 규칙적 인 ring 형태의 oligomer 즉, decamer 형태는 70% 이상 관찰할 수 있었다. Prx 의 산화 상태에서의 구조의 변화룰 관찰하기 위해, DTT-1- 처리한 시료에 15mMH2C)2을 한 시간 처리한 후, 전자현미경을 관찰 하였다 Fig.
이것은 Yeast Prx가 여러 다론 형태의 구조를 가지며, 또한 grid위에 놓여진 상태에 따라 end-on view 와 side-on view의 형태를 보여주고 있는 것으로 추정 할 수 있다. 보다 정확한 구조를 분석하기 위하여, 같은 형태의 구조를 가지는 입자별로 선별하여 translation과 rotation시킨 후 alignment시 켰다. 선별한 입자들의 data set에서 얻은 eigenvector/eigenvalue의 기 초로 분석 및 correlation average를 구하였다.
대상 데이터
BL21)에서 발현시켰으며, size exculsion chromatography 동을 이용하여 순수분리 하였다 순수 분리 한 Yeast Prx는 Cheong et aL (1993)의 방법에 따라 염색하였다 간단히 요약하면, 탄소 막을 입힌 grid에 3분 동안 홉착시킨 후 여과지로 조심스럽게 상등 액을 제거 후 증류수로 2 ~ 3회 씻은 다옴 2% uranyl acetate로 착색시켰다. Technai 12 전자현미경으로 120kV에서 51, 600 × 의 배율로 (nominal magnification : 52, 000x) Low-Does System을 이용하여 촬영하였으며, Kodak 4489 Film에 기록하였다. Optical diffractometer를 이용*여 흥 인화된 전자현미경 사진에 나타난 astigmatism (난시 현상)과 drift 현상들을 관찰하였으며 image analysis와 processing을 위해 적절한 사진을 선택하였다.
데이터처리
보다 정확한 구조를 분석하기 위하여, 같은 형태의 구조를 가지는 입자별로 선별하여 translation과 rotation시킨 후 alignment시 켰다. 선별한 입자들의 data set에서 얻은 eigenvector/eigenvalue의 기 초로 분석 및 correlation average를 구하였다. 또한, eigenvector를 이용하여 유사한 형태별로 구분 (classification)하였다 먼저, 구 형태의 구조를 가지는 입자 (Fig.
임의로 선택된 image를 reference로 사*여 용층 correlation average (Phipps et al; 1991)를 구하였다. 이 결과로 얻은 average를 다옴 cycle의 reference로 사용하여 average 를 구하였다. 또 multi variation statistical 분석법 (Kim et al.
이론/모형
Yeast Prx는 Cheong et al. (1999)의 방법에 따라 pGEX expression vector을 이용하여 대장균(E coll. BL21)에서 발현시켰으며, size exculsion chromatography 동을 이용하여 순수분리 하였다 순수 분리 한 Yeast Prx는 Cheong et aL (1993)의 방법에 따라 염색하였다 간단히 요약하면, 탄소 막을 입힌 grid에 3분 동안 홉착시킨 후 여과지로 조심스럽게 상등 액을 제거 후 증류수로 2 ~ 3회 씻은 다옴 2% uranyl acetate로 착색시켰다. Technai 12 전자현미경으로 120kV에서 51, 600 × 의 배율로 (nominal magnification : 52, 000x) Low-Does System을 이용하여 촬영하였으며, Kodak 4489 Film에 기록하였다.
; 1979) 등의 software package를 이용하였다. 계수화된 전자현미경 image를 64×64pixel 의 크기로 각각의 입자룰 자론 후 Kang etaL (2003)의 방법에 따라 translation과 rotation시킨 후 alignment 시켰다. 임의로 선택된 image를 reference로 사*여 용층 correlation average (Phipps et al; 1991)를 구하였다.
이 결과로 얻은 average를 다옴 cycle의 reference로 사용하여 average 를 구하였다. 또 multi variation statistical 분석법 (Kim et al.: 2000) 즉, 모든 image를 각각 비교하여 얻은 eigenvector와 eigenvalue값을 이용하여 유사한 형태로 분류(classification) 하였다 이와 같은 방법으로 얻은 class의 average와 모든 입자의 average 는 angular correlation coefficients (Diirr; 1991)에 기 초로 symmetry를 결정하였다.
전자현미 경사진을 Leafscan (LS45, USA)을 사용하여 1024X 1024pixels 20 ㎛ pixel 크기 (실제 object 에 대해 0.38 nm)로 계수화(digitalize)시켰다 Image analysis 와 processinge EM (Hergel; 1996) 과 SEMPER (Saxton et al.; 1979) 등의 software package를 이용하였다. 계수화된 전자현미경 image를 64×64pixel 의 크기로 각각의 입자룰 자론 후 Kang etaL (2003)의 방법에 따라 translation과 rotation시킨 후 alignment 시켰다.
성능/효과
pH 변화에 따른 yeast Prx의 oligomer 구조의 변화가 없음은 non -ionic interaction 이 oligomerization에 영 향을 주지 못함 올 알 수 있다. Ionic strength에 의해 conformation 의 변화를 관찰하기 위해, Prx을 NaCl의 다른 능도 (100~300mN)에 15분간 배양 후 전자현미경으로 관찰 하였다 dimer형태의 Prx(Fig.3c)에 염으로 처리 후 dimer 형 태는 급격히 감소하는 반면, decamer 형태의 oligomer가 중가됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 3d). 또한, 염의 능도가 중가 (150~300 mM)할수록 Prx는 decamer의 형태로 conformation의 변화가 중가됨올보여주고 있다.
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