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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 지금까지 버려져 왔던 폐기물로서의 산삼배양액을 산업동물에 적용하여 최근에 널리 연구되고 있는 프로테오믹스 기술을 이용하여, 산삼배양액을 투여한 육계와 투여하지 않은 육계의 긴비골근(fibularis longus muscle)과 얕은흉근(superficial pectoral muscle)에서 단백질 발현의 변화를 조사하였다. 또한 발현양이 현저한 차이를 보이는 단백질들을 분리, 동정함으로써 육계에서의 산삼배양액의 효과 규명에 기초 자료를 제공하고자 본 연구를 수행하였다.
- 본 연구는 폐기물로서의 산삼배양액을 산업동물로서의 육계에 적용하여 프로테오믹스 기술을 이용하여, 산삼배양액을 투여한 육계와 투여하지 않은 육계의 근육에서 단백질 발현 양상을 조사하였다. 또한 발현양의 차이를 보이는 단백질들을 분리, 동정하고 그 기능을 고찰함으로써 육계에서의 산삼배양액의 효과 규명에 기초자료를 제공하고자 본 실험을 수행하였다. 산삼배양액을 투여한 육계의 긴비골근과 얕은 흉근 모두에서 동일한 단백질 발현 변화를 보이는 spot들을 선정한 이차원전기영동 결과, 총 10개의 spot에서 유의성 있는 변화를 보였다.
- 따라서 본 연구에서는 지금까지 버려져 왔던 폐기물로서의 산삼배양액을 산업동물에 적용하여 최근에 널리 연구되고 있는 프로테오믹스 기술을 이용하여, 산삼배양액을 투여한 육계와 투여하지 않은 육계의 긴비골근(fibularis longus muscle)과 얕은흉근(superficial pectoral muscle)에서 단백질 발현의 변화를 조사하였다. 또한 발현양이 현저한 차이를 보이는 단백질들을 분리, 동정함으로써 육계에서의 산삼배양액의 효과 규명에 기초 자료를 제공하고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 이차원 전기영동(2-Dimensional Gel Electrophoresis; 2-DE)을 한 후에 gel에서 단백질 spot을 검출하기 위하여 염색을 실시하였다. Gel을 2% phosphoric acid, 10% ammonium sulphate와 20% methanol을 포함한 0.1% colloidial Coomassie Briliant Blue G-250을 이용하여 48시간동안 염색하였다 [11].
- MALDI-MS spectra는 delayed-extraction reflectron time-of-flight mass spectrometer(Model MALDI-R; Micromass, UK)를 이용하여 얻었다. Peptide masses는 MASCOT software와 Profound software를 사용하여 NCBI database에서 단백질을 동정하였다.
- 각 근육으로부터 추출한 총 단백질을 Yan et al. [20]의 방법에 준하여 2차원 전기영동을 실시하였고, gel을 가시화 시키기 위하여 0.1% colloidial Coomassie Briliant Blue G-250를 이용하여 염색을 실시하였으며 가시화된 gel image는 PD Quest software를 이용하여 분석하였다, 그 결과 긴비골근과 얕은 흉근의 gel image에서 총 900개의 spot들을 관찰하였다(Fig. 1A, B). 이 spot들 중 대조군에 비하여 산삼배양액을 투여한 육계의 긴비골근과 얕은 흉근 모두에서 동일한 변화를 보이는 spot들을 선정한 결과, 총 10개의 spot density가 유의성 있게 차이를 보였으며, 이중에서 5개의 spot은 증가하는 경향을 보였고, 5개의 spot은 감소하는 경향을 나타내었다(Fig.
- 가시화된 단백질은 2DE 이미지 분석용 프로그램인 PD Quest(Bio-Rad, USA)를 이용하여 분석하였고, 산삼 배양액 비투여군과 투여군간의 발현의 차이를 보이는 단백질들을 선발하였다. 이 중에 관심있는 단백질을 동정하기 위해서 관련 spot을 1 mm3으로 자르고 30 mM potassium ferricyanide와 100 mM sodium thiosulfate(1:1)을 혼합한 용액에 넣어 탈염색한 후에 세척하였다.
- Peptide의 추출을 위해 acetonitrile 20 µl를 넣고 30분간 vortex시킨 후에 상층액만 수거하여 vacuum centrifuge를 이용하여 건조시켰다. 다음에 MALDI-TOF 분석을 위하여 건조시킨 sample과 matrix solution(15-20 g/L α-cyanon-4-hydrosycinnamic acd; CHCA in 70% acetonitrile)을 혼합하고, MALDI target에 2 µl를 분주한 후 건조시켜서 MALDI-TOF을 실시하였다[16]. MALDI-MS spectra는 delayed-extraction reflectron time-of-flight mass spectrometer(Model MALDI-R; Micromass, UK)를 이용하여 얻었다.
- 산삼배양액은 음수로 급여하였다. 대조군과 실험군에 5주 동안 처리한 육계를 방혈 폐사시킨 후 대조군과 투여군의 긴비골근과 얕은 흉근 부위에서 1×2×1 cm의 크기로 조직을 절제하여 시료를 채취하였으며 실험에 사용전까지 액체질소에 보관하였다.
- 2). 변화를 보이는 spot들은 단백질 동정을 위하여 MALDI-TOF 분석을 실시하였다. Fig.
- 본 연구는 폐기물로서의 산삼배양액을 산업동물로서의 육계에 적용하여 프로테오믹스 기술을 이용하여, 산삼배양액을 투여한 육계와 투여하지 않은 육계의 근육에서 단백질 발현 양상을 조사하였다. 또한 발현양의 차이를 보이는 단백질들을 분리, 동정하고 그 기능을 고찰함으로써 육계에서의 산삼배양액의 효과 규명에 기초자료를 제공하고자 본 실험을 수행하였다.
- 본 연구에서 우리는 산삼배양액을 투여한 육계와 투여하지 않은 육계의 긴비골근과 얕은 흉근 부위에서 최근 널리 인식되어진 proteomics 기술을 이용하여 산삼배양액 투여시 변화를 보이는 단백질들을 동정하였다. 이차원전기영동 실험결과 총 10개의 spot이 대조군에 비해 산삼배양액 투여 육계에서 유의성 있는 변화를 보였으며, 이 spot들의 단백질을 동정하기 위하여 MALDITOF을 실시한 결과 desmin, myosin light chain 1, actin polymerization inhibitor(heat shock 25 kDa protein), collapsin response mediator protein-2A, alpha enolase, vimentin, actin alpha 1, my023 protein, pyruvate kinase 그리고 troponin T 등 10개의 단백질이 동정되었다.
- 산삼배양액 투여로 인한 근육 내 단백질 발현 양상을 분석하기 위하여 대조군과 실험군으로 나누고 산삼배양액을 음수로 급여하였다. 산삼배양액 투여 5주 후에 긴 비골근과 얕은 흉근 부위에서 1×2×1 cm의 크기로 조직을 절제하여 시료를 채취하였다.
- (주)하림으로부터 1일령 Ross 수컷을 구입하여 5주간 사양실험을 시행하였다. 육계를 60수씩 산삼배약액을 처리하지 않는 그룹(대조군)과 산삼배양액을 0.8%씩 처리한 그룹(실험군)으로 나누었다. 산삼배양액은 음수로 급여하였다.
- 이차원 전기영동(2-Dimensional Gel Electrophoresis; 2-DE)을 한 후에 gel에서 단백질 spot을 검출하기 위하여 염색을 실시하였다. Gel을 2% phosphoric acid, 10% ammonium sulphate와 20% methanol을 포함한 0.
대상 데이터
- (주)하림으로부터 1일령 Ross 수컷을 구입하여 5주간 사양실험을 시행하였다. 육계를 60수씩 산삼배약액을 처리하지 않는 그룹(대조군)과 산삼배양액을 0.
- 산삼배양액 투여로 인한 근육 내 단백질 발현 양상을 분석하기 위하여 대조군과 실험군으로 나누고 산삼배양액을 음수로 급여하였다. 산삼배양액 투여 5주 후에 긴 비골근과 얕은 흉근 부위에서 1×2×1 cm의 크기로 조직을 절제하여 시료를 채취하였다. 각 근육으로부터 추출한 총 단백질을 Yan et al.
이론/모형
- 2-DE는 Yan et al. [20]에서 서술한 방법에 준하여 실시하였다. 시료에 lysis buffer(7M urea, 2M thiourea, 2% CHAPS, 1% DTT와 0.
- 균질화된 용해물을 1분 동안 잘 혼합해 주고 30분 동안 실온에서 rotational shaking 해 주었다. 이 용해물을 20℃에서 1시간동안 4000×g로 centrifuge하고 상층액의 2번째 층을 취한 후에 단백질 농도를 Bradford 법을 이용하여 측정한 후 최종 단백질 농도가 3~10 mg/ml이 되도록 희석시켰다. 정량된 시료는 rehydration buffer(8 M urea, 0.
성능/효과
- W)을 나타내었다. 동정된 단백질 중에서 desmin은 약 5.2배, myosin light chain 1은 약 7.5배, Actin polymerization inhibitor(heat shock 25 kDa protein)은 약 1.8배, collapsin response mediator protein-2A는 약 8.1배 그리고 alpha enolase는 약 2.1배씩 대조군에 비해 산삼배양액을 투여한 육계의 긴비골근과 얕은 흉근에서 감소하는 경향을 보였고, vimentin은 약 2배, actin alpha 1은 약 2.3배, my023 protein은 약 1.7배, pyruvate kinase는 약 8.5배 그리고 troponin T는 약 900배씩 대조군에 비해 산삼배양액을 처리한 육계의 긴비골근과 얕은 흉근에서 유의성 있게 증가하는 경향을 보였다. 이중에서 근육의 수축과 이완에 관련된 alpha actin, 가로무늬근의 칼슘 조절 단백질인 트로포닌(troponin)중의 하나인 troponin T와 생체에서 각종 물질의 대사 경로를 잇는데 중요한 중간 생성물인 pyruvate에 영향을 주는 pyruvate kinase와 같은 단백질들이 산삼배양액 비투여군에 비하여 투여군에서 유의성있는 증가를 보였다.
- 동정된 단백질들의 생체내 기능들을 보면 desmin은 주로 세포의 전체적인 구조 유지와 세포외 물질과의 연결을 해주는 중간미세섬유에 출현하는 단백질이며, vimentin은 상피세포를 제외한 모든 간엽세포(mesenchymal cell)에서 발현되는 중간세사이며 육종에 양성이어서 분화가 나쁜 암종을 감별하는데 유용하게 쓰인다. 또한 근육의 수축과 이완에 관련된 alpha actin, 그리고 생체에서 각종 물질의 대사 경로를 잇는데 중요한 중간 생성물인 pyruvate에 영향을 주는 pyruvate kinase와 같은 단백질들이 산삼배양액 비투여군에 비하여 투여군에서 유의성 있는 증가를 보였다. 특히 가로무늬근의 칼슘 조절 단백질인 troponin T는 대조군에 비해 산삼배양액 투여군에서 많은 발현을 보였다.
- 이차원전기영동(Two-dimensional electrophoresis; 2-DE)은 한 개체내에서 발현되는 단백질의 발현 양상과 생리적, 환경적 변화에 따른 발현정도의 변화도 관찰할 수 있다[12, 19]. 또한 분석 대상 단백질들을 세포의 특정 생리조건에 따라 제조하여 특정한 spot들의 양적인 변화를 보이는 단백질들을 적당한 크기로 잘라 The matrixassisted laser desorption ionization time of fight(MALDI-TOF) mass spectrometry(MS) 등의 단백질 질량 분석기로 분석하여 아미노산 서열을 결정하고 단백질의 정체를 확인할 수 있다.
- 또한 발현양의 차이를 보이는 단백질들을 분리, 동정하고 그 기능을 고찰함으로써 육계에서의 산삼배양액의 효과 규명에 기초자료를 제공하고자 본 실험을 수행하였다. 산삼배양액을 투여한 육계의 긴비골근과 얕은 흉근 모두에서 동일한 단백질 발현 변화를 보이는 spot들을 선정한 이차원전기영동 결과, 총 10개의 spot에서 유의성 있는 변화를 보였다. 이 spot들의 단백질을 동정하기 위하여 MALDITOF을 실시한 결과 desmin, myosin light chain 1, actin polymerization inhibitor(heat shock 25 kDa protein), collapsin response mediator protein-2A, alpha enolase, vimentin, actin alpha 1, my023 protein, pyruvate kinase 그리고 troponin T 등 10개의 단백질이 동정되었다.
- 1A, B). 이 spot들 중 대조군에 비하여 산삼배양액을 투여한 육계의 긴비골근과 얕은 흉근 모두에서 동일한 변화를 보이는 spot들을 선정한 결과, 총 10개의 spot density가 유의성 있게 차이를 보였으며, 이중에서 5개의 spot은 증가하는 경향을 보였고, 5개의 spot은 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 2). 변화를 보이는 spot들은 단백질 동정을 위하여 MALDI-TOF 분석을 실시하였다.
- 본 연구에서 우리는 산삼배양액을 투여한 육계와 투여하지 않은 육계의 긴비골근과 얕은 흉근 부위에서 최근 널리 인식되어진 proteomics 기술을 이용하여 산삼배양액 투여시 변화를 보이는 단백질들을 동정하였다. 이차원전기영동 실험결과 총 10개의 spot이 대조군에 비해 산삼배양액 투여 육계에서 유의성 있는 변화를 보였으며, 이 spot들의 단백질을 동정하기 위하여 MALDITOF을 실시한 결과 desmin, myosin light chain 1, actin polymerization inhibitor(heat shock 25 kDa protein), collapsin response mediator protein-2A, alpha enolase, vimentin, actin alpha 1, my023 protein, pyruvate kinase 그리고 troponin T 등 10개의 단백질이 동정되었다. 동정된 단백질들의 생체내 기능들을 보면 desmin은 주로 세포의 전체적인 구조 유지와 세포외 물질과의 연결을 해주는 중간미세섬유에 출현하는 단백질이며, vimentin은 상피세포를 제외한 모든 간엽세포(mesenchymal cell)에서 발현되는 중간세사이며 육종에 양성이어서 분화가 나쁜 암종을 감별하는데 유용하게 쓰인다.
- 5배 그리고 troponin T는 약 900배씩 대조군에 비해 산삼배양액을 처리한 육계의 긴비골근과 얕은 흉근에서 유의성 있게 증가하는 경향을 보였다. 이중에서 근육의 수축과 이완에 관련된 alpha actin, 가로무늬근의 칼슘 조절 단백질인 트로포닌(troponin)중의 하나인 troponin T와 생체에서 각종 물질의 대사 경로를 잇는데 중요한 중간 생성물인 pyruvate에 영향을 주는 pyruvate kinase와 같은 단백질들이 산삼배양액 비투여군에 비하여 투여군에서 유의성있는 증가를 보였다.
- 본 연구에서 우리는 산삼배양액을 투여한 육계와 투여하지 않은 육계의 긴비골근과 얕은 흉근 부위에서 최근 널리 인식되어진 proteomics 기술을 이용하여 산삼배양액 투여시 변화를 보이는 단백질들을 동정하였다. 이차원전기영동 실험결과 총 10개의 spot이 대조군에 비해 산삼배양액 투여 육계에서 유의성 있는 변화를 보였으며, 이 spot들의 단백질을 동정하기 위하여 MALDITOF을 실시한 결과 desmin, myosin light chain 1, actin polymerization inhibitor(heat shock 25 kDa protein), collapsin response mediator protein-2A, alpha enolase, vimentin, actin alpha 1, my023 protein, pyruvate kinase 그리고 troponin T 등 10개의 단백질이 동정되었다. 동정된 단백질들의 생체내 기능들을 보면 desmin은 주로 세포의 전체적인 구조 유지와 세포외 물질과의 연결을 해주는 중간미세섬유에 출현하는 단백질이며, vimentin은 상피세포를 제외한 모든 간엽세포(mesenchymal cell)에서 발현되는 중간세사이며 육종에 양성이어서 분화가 나쁜 암종을 감별하는데 유용하게 쓰인다.
후속연구
- 이 spot들의 단백질을 동정하기 위하여 MALDITOF을 실시한 결과 desmin, myosin light chain 1, actin polymerization inhibitor(heat shock 25 kDa protein), collapsin response mediator protein-2A, alpha enolase, vimentin, actin alpha 1, my023 protein, pyruvate kinase 그리고 troponin T 등 10개의 단백질이 동정되었다. 동정된 단백질들의 기능을 고찰한 결과 산삼배양액의 투여로 고품질 육계를 생산할 수 있을 것으로 판단되며, 사료첨가제로서 산삼배양액을 개발하는데 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
- 이러한 결과는 산삼배양액의 투여로 인한 고품질 육계의 생산을 제시해 주며, 더 나아가 지금까지는 버려져왔던 폐기물로서의 산삼배양액을 이용하여 축산업의 사료첨가제로서 활용한다면 질병 예방 및 고품질 축산물의 생산에 기여할 것으로 판단된다.
- 특히 가로무늬근의 칼슘 조절 단백질인 troponin T는 대조군에 비해 산삼배양액 투여군에서 많은 발현을 보였다. 이러한 단백질들은 육계에서 고품질 축산물의 평가 가치가 되는 육색과 수분손실 등과 관련된 단백질들이며, 산삼배양액 투여로 인해 생체 내에서 단백질들의 활성을 변화시켜 다양한 생리적 변화를 가져올 것이다.
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