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문제 정의
- 백신접종은 개에서와 마찬가지로1 dose 씩 2회 접종하였으며 접종 후 6주까지 매주 채혈을 하여 혈청중화항체가 조사에 사용하였다. 각각의 동물접종에 사용한 백신은 가능하면 제조사별로 동일한 롯트의 백신을 사용하고자 하였다.
- 목적동물을 이용한 개 코로나바이러스 불활화 백신의 역가시험 수행상의 문제점을 개선하여 국가검정 뿐만 아니라 민간 백신제조회사의 자가검정의 편의성 및 효율성을 제공하고자 CCV 불활화 백신의 역가시험에 사용할 수 있는 실험 소동물을 선발하기 위하여 일련의 시험을 수행하였다. 우선 백신의 역가 시험용으로 가장 흔하게 사용되는 토끼와 기니픽에서 CCV 백신에 대한 항체 형성능 비교시험에서 백신의 제조회사와 백신접종 후 경과한 시간에 상관없이 토끼보다는 기니픽에서 더 높은 항체가가 유도되었다.
- 이상에서 언급한 CCV 백신의 국가검정 및 백신 제조사의 자가검정에서 발생하는 시험상의 문제점을 해결하고 국내 백신 제조회사의 품질관리에 도움을 주기 위하여 목적동물인 개를 대체하여 실험용 소 동물을 사용한 역가시험법을 개발하기 위하여 CCV 백신을 접종 받은 개와 실험소동물간의 항체 형성능을 비교 분석하는 일련의 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 개 코로나바이러스 백신 접종 후 매주 경시별로 개와기니픽에서 유도되는 항체역가의 변화를 비교 조사하기 위하여 Table 1에 나타난 4개 제조사별 기니픽에서의 항체역가의 기하평균과 Table 3에 나타난 백신 제조사별 개에서의 항체역가의 기하평균값을 각각 구하여 이들 두 동물간의 평균 항체가의 변화양상을 비교하였다(Fig. 1). 각 제조사별로 기니픽은 15두씩, 개는 3두씩 사용하였다.
- 면역항체 생산 또는 백신검정용 실험 소동물로 가장 흔하게 사용되는 토끼와 기니픽을 이용하여 시판되는 4개사의 제품들에 대한 항체형성능을 비교 조사하였다. 이 시험에서 CCV 불활화 백신에 대하여 더 우수한 면역반응을 나타내는 실험 소동물을 선발하기 위하여 예비 시험을 실시하였던 바 공시한 4개 제품 모두 백신접종 2주 후부터 중화항체가 검출되기 시작하여 4-5주 후에 가장 높은 항체가를 나타낸 후 항체 역가는 떨어지기 시작하였다.
- 백신접종 시험용 목적동물은 체중 약 2kg의 11주령의 소형 비글견(Beagle dog)으로서 시험을 시작하기 전에 CCV에 대한 항체검사를 실시하여 항체음성으로 확인한 후 대조군을 포함하여 총 15두의 개를 사용하였다. 백신을 1 dose(1 ml)를 근육접종한 후 2주 후에 동량을 2차 접종하였으며 5주 후까지 매주 채혈하여 CCV 에 대한 혈청중화 항체가를 조사하였다. 실험 소동물로는 충분한 양의 채혈을 할 수 있으며 다루기 편리한 토끼(뉴질랜드화이트, 약 2.
- 5 kg)와 기니픽(Hartley계, 300-350 g)을 사용하였다. 백신접종은 개에서와 마찬가지로1 dose 씩 2회 접종하였으며 접종 후 6주까지 매주 채혈을 하여 혈청중화항체가 조사에 사용하였다. 각각의 동물접종에 사용한 백신은 가능하면 제조사별로 동일한 롯트의 백신을 사용하고자 하였다.
- 단층배양 된 A-72 세포를 trypsin 처리하여 5% 혈청이 함유된 α-MEM 배지에 ml 당 약 15만개의 수가 되도록 세포를 부유시킨 후 microplate의 각 well에 100 µl 씩 첨가한 후 CO2 배양기에서 5일간 배양하였다. 세포변성효과(cytopathic effect; CPE)를 완전하게 억제하는 최종 혈청희석배수의 역수를 중화항체가로 산정하였다.
- 시판중인 CCV 불활화 백신 4개 제품에 대하여 제조회사별로 1로트씩 총 4로트에 대하여 백신을 각각 1 dose 씩 체중 약 2 kg의 소형 비글견에 각각 3두씩 근육 접종 한 후 2주 후에 동량으로 2차 접종을 하였다. 한편대조군 3두는 백신접종을 하지 않았다.
- 시판중인 개 코로나바이러스 불활화 백신 4종에 대하여 제조회사 별로 2-3로트 씩 총 11개 로트에 대하여 백신을 각각 1 dose 씩 기니픽에 근육접종한 다음 2주 후에 동량을 각각 2차 접종하였으며, 2차 접종 3, 4, 5주 후에 각각 채혈하여 중화항체 형성능을 조사하여 제조사별, 제조 로트별 항체역가의 편차를 비교하였다. Table 1의 예비시험에서와 마찬가지로 1차 접종 3주 후부터 대부분의 경우 약 3(log2) 이상의 중화항체가 생성되기 시작하여 4-5주 후에 가장 높은 역가에 도달하였으며 이 시기의 항체가는 제조회사 및 제조 로트에 따라 다소 차이가 있었지만 평균적으로 4~5(log2)의 중화항체가를 나타냈다.
대상 데이터
- CCV의 배양 및 혈청중화시험을 위하여 Binn 등 [14]이 개의 대퇴부종양에서 작성한 A-72 cell line(ATCC ARL-1542)을 사용하였다. A-72 cell은 10%소 태아혈청(fetal calf serum, Gemini Bio-Products, USA)과 항생제가 첨가된 alpha minimum essential medium(α-MEM; Jeil Biotechservices, Korea)을 사용하여 5% CO2, 37ºC에서 배양하였다.
- 혈청중화시험(serum neutralization test; SN test)에 사용한 CCV는 Binn 등 [13]이 분리한 VR-809주를 ATCC(American type culture collection)로부터 구입하여 사용하였다. CCV의 배양 및 혈청중화시험을 위하여 Binn 등 [14]이 개의 대퇴부종양에서 작성한 A-72 cell line(ATCC ARL-1542)을 사용하였다. A-72 cell은 10%소 태아혈청(fetal calf serum, Gemini Bio-Products, USA)과 항생제가 첨가된 alpha minimum essential medium(α-MEM; Jeil Biotechservices, Korea)을 사용하여 5% CO2, 37ºC에서 배양하였다.
- 1). 각 제조사별로 기니픽은 15두씩, 개는 3두씩 사용하였다. 1차 접종 1주 후에는 개에서는 평균 1(log2) 이상의 중화항체가 유도되는 반면 기니픽에서는 항체가 검출되지 않았다.
- 국내에 시판되고 있는 4종의 CCV 불활화 백신을 사용하였다. A와 B사 제품은 국내제조 백신이며 C와 D사 제품은 수입백신으로서 A사 제품은 CPV.
- 그리고 백신 접종 후 경과한 시기와는 상관없이 토끼보다 기니픽에서 더 높은 항체가를 유도하였다(Table 1). 따라서 CCV 백신에 대한 항체역가 시험을 하기위한 실험 소동물로 기니픽을 선발하였다.
- 목적동물인 개를 이용한 CCV 불활화 백신의 역가시험을 대체하기 위하여 실험 소동물을 이용한 역가시험법을 개발하고자 일련의 시험을 수행하였던 바 실험 소동물로는 토끼보다는 기니픽이 CCV 불활화 백신에 대하여 더 높고 균일한 면역반응을 나타내어 기니픽을 실험 소동물로 선정하였다.
- 백신접종 시험용 목적동물은 체중 약 2kg의 11주령의 소형 비글견(Beagle dog)으로서 시험을 시작하기 전에 CCV에 대한 항체검사를 실시하여 항체음성으로 확인한 후 대조군을 포함하여 총 15두의 개를 사용하였다. 백신을 1 dose(1 ml)를 근육접종한 후 2주 후에 동량을 2차 접종하였으며 5주 후까지 매주 채혈하여 CCV 에 대한 혈청중화 항체가를 조사하였다.
- 백신을 1 dose(1 ml)를 근육접종한 후 2주 후에 동량을 2차 접종하였으며 5주 후까지 매주 채혈하여 CCV 에 대한 혈청중화 항체가를 조사하였다. 실험 소동물로는 충분한 양의 채혈을 할 수 있으며 다루기 편리한 토끼(뉴질랜드화이트, 약 2.5 kg)와 기니픽(Hartley계, 300-350 g)을 사용하였다. 백신접종은 개에서와 마찬가지로1 dose 씩 2회 접종하였으며 접종 후 6주까지 매주 채혈을 하여 혈청중화항체가 조사에 사용하였다.
- 파라인플루엔자.파보바이러스(DHPP) 생백신 및 CPV 생백신의 희석액으로 사용되는 액상의 CCV 불활화 백신 부분만을 사용하였다.
- 혈청중화시험(serum neutralization test; SN test)에 사용한 CCV는 Binn 등 [13]이 분리한 VR-809주를 ATCC(American type culture collection)로부터 구입하여 사용하였다. CCV의 배양 및 혈청중화시험을 위하여 Binn 등 [14]이 개의 대퇴부종양에서 작성한 A-72 cell line(ATCC ARL-1542)을 사용하였다.
이론/모형
- 따라서 다루기 쉽고 CCV 백신에 대한 면역반응이 더 우수한 기니픽을 실험소 동물로 결정하였다. 백신접종 및 채혈은 기존의 개를 이용한 역가시험에 준하여 실시하였다.
성능/효과
- CCV 불활화 백신을 개(체중 약 2 kg, 비글)와 기니픽(300-350 g, Hartley계)에 각각 1 dose 씩 2회 투여한 후 이들 동물에서의 면역반응(중화항체역가)을 조사하였을때 개에서의 항체역가가 기니픽에서의 항체역가 보다 더 우수하게 나타났다. 그러나 백신접종 후 경과한 시간에 따른 이들 두 동물에서의 항체역가의 변화 추이는 높은 상관성을 나타냈다.
- 한편대조군 3두는 백신접종을 하지 않았다. 그 결과 4개 회사 제품 모두 백신접종된 개에서 1주 후에 중화항체가가 1(log2) 이상으로 유도되었으며 2주 후에는 대부분의 백신 접종견이 3(log2) 이상의 항체가를 나타내었으며 4주 후까지는 항체가가 지속적으로 상승하였다. 그리고 대부분의 백신접종군에서 평균항체가 5(log2) 이상의 높은 항체가를 나타냈다.
- CCV 불활화 백신을 개(체중 약 2 kg, 비글)와 기니픽(300-350 g, Hartley계)에 각각 1 dose 씩 2회 투여한 후 이들 동물에서의 면역반응(중화항체역가)을 조사하였을때 개에서의 항체역가가 기니픽에서의 항체역가 보다 더 우수하게 나타났다. 그러나 백신접종 후 경과한 시간에 따른 이들 두 동물에서의 항체역가의 변화 추이는 높은 상관성을 나타냈다. 따라서 현재의 국가검정기준에 CCV 백신에 대한 역가시험(potency test)에서 개에 대한 중화항체가가 1:4 이상으로 규정되어 있으므로, 목적동물인 개의 품종에 따른 체중의 차이가 큰 점 등을 고려하여 기니픽에서 중화항체가를 1:8 이상으로 설정한다면 중 .
- 그러나 전술한 바와 같이 CCV 역가시험을 위한 실험소 동물로 선택된 기니픽에 대하여 4개의 제조회사별로 각각 2-3롯트의 백신을 접종한 후 항체가 유도 정도의 차이를 조사하여 보았을 때 C 사의 1개 롯트의 백신을 제외하고는 2차 접종 2-3주 후에 동일 제조사 및 서로 다른 제조사와 롯트 별 항체역가는 2배 이상의 편차가 인정되지 않았다. 따라서 다양한 제조회사의 백신에 대해서 역가시험을 할 때 공통적으로 사용하여도 항체가 측정시험에는 문제가 되지 않을 것으로 판단되었다.
- 따라서 다양한 제조회사의 백신에 대해서 역가시험을 할 때 공통적으로 사용하여도 항체가 측정시험에는 문제가 되지 않을 것으로 판단되었다. 그리고 A사의 제품은 나머지 3개 회사의 제품과는 달리 adjuvant로 수산화알루미늄 젤[Al(OH)3 gel]을 사용하지 않고 mineral oil을 사용하는 것으로 확인되었다. 일반적으로 oil adjuvant는 gel adjuvant 보다 접종반응 등의 부작용이 다소 큰 반면 항체 유도능은 더 우수하게 나타나는 것으로 알려져 있다.
- 이 시험에서 CCV 불활화 백신에 대하여 더 우수한 면역반응을 나타내는 실험 소동물을 선발하기 위하여 예비 시험을 실시하였던 바 공시한 4개 제품 모두 백신접종 2주 후부터 중화항체가 검출되기 시작하여 4-5주 후에 가장 높은 항체가를 나타낸 후 항체 역가는 떨어지기 시작하였다. 그리고 백신 접종 후 경과한 시기와는 상관없이 토끼보다 기니픽에서 더 높은 항체가를 유도하였다(Table 1). 따라서 CCV 백신에 대한 항체역가 시험을 하기위한 실험 소동물로 기니픽을 선발하였다.
- 한편 기니픽의 경우 1차 접종 5주 후까지 지속적으로 항체가가 상승한후 6주후부터 항체가가 저하하기 시작하였다. 그리고 유도되는 항체역가에서도 전체적으로 백신접종 후 동일한 시기에 항체가를 측정하였을 때 목적동물인 개에서의 항체가가 기니픽에서의 항체가 보다 약 2배 정도 높게 나타남을 알 수 있었다. 이러한 사실은 시험에 사용한 동물의 체중만을 단순하게 비교하여 볼 때 이 백신의 항원성은 기니픽보다는 개에서 월등하게 우수함을 확인하였다.
- 4(log2)의 항체가 유도된 후 4-5주 후에는 5(log2) 이상의 항체가를 나타냈다. 따라서 CCV 불활화 백신 접종 후 개와 기니픽 간의 평균 항체역가를 비교해 볼 때 접종 후 2주 까지는 두 그룹간의 항체역가의 차이는 현저하게 나타났지만 3주 후부터 5주 사이에 개에서 유도되는 항체가는 기니픽에서의 항체가 보다 2배 정도 높게 유도되는 것을 알 수 있었다. 즉, 체중 약 2 kg의 소형견을 사용할 때 CCV 불활화 백신에 대한 면역반응은 기니픽보다 목적동물인 개가 더 우수함을 확인하였다.
- 이 연구의 결과에서도 CCV 불활화 백신 접종시 실험동물인 토끼와 기니픽 뿐만 아니라 목적동물인 개에서도 1차 접종 후 2주까지는 낮은 역가의 항체가 유도되기 시작한 후 memory cell의 면역기억에 의하여 2차 접종(booster inoculation) 후에는 항체가가 급격하게 상승하는 것을 관찰할 수 있었다. 생성된 항체가의 지속능에서는 개와 토끼의 경우 1차 접종 4주 후까지는 항체가가 지속적으로 상승하다가 5-6주 후에는 항체역가가 저하하는 것을 확인하였다. 한편 기니픽의 경우 1차 접종 5주 후까지 지속적으로 항체가가 상승한후 6주후부터 항체가가 저하하기 시작하였다.
- ) 이상인 경우 합격처리 할 수 있을 것으로 판단되었다. 실험 소 동물인 기니픽을 이용한 역가 시험에서 불합격되는 CCV 불활화 백신에 대해서는 최종 확인 시험으로 개를 사용하는 기존의 역가시험을 실시하여 적합여부를 결정하는 것이 타당할 것으로 사료된다. 기니픽을 사용하여 CCV 불활화 백신의 역가시험을 실시함으로써 국가검정 뿐만 아니라 백신제조회사의 자가검정 시에 편리하고 경제적으로 역가시험을 수행할 수 있을 것으로 기대된다.
- 목적동물을 이용한 개 코로나바이러스 불활화 백신의 역가시험 수행상의 문제점을 개선하여 국가검정 뿐만 아니라 민간 백신제조회사의 자가검정의 편의성 및 효율성을 제공하고자 CCV 불활화 백신의 역가시험에 사용할 수 있는 실험 소동물을 선발하기 위하여 일련의 시험을 수행하였다. 우선 백신의 역가 시험용으로 가장 흔하게 사용되는 토끼와 기니픽에서 CCV 백신에 대한 항체 형성능 비교시험에서 백신의 제조회사와 백신접종 후 경과한 시간에 상관없이 토끼보다는 기니픽에서 더 높은 항체가가 유도되었다. 이러한 이유 중의 하나로 동일한 설치동물로서 CCV 항원에 대한 이들 동물의 면역반응이 유사하다고 가정할 때 투여된 항원량이 동일할경우 항원투여 대상 동물의 체중과 면역항체 유도 간에는 상관성이 있으며, 체중이 작을수록 항체역가가 높게 유도되는 것이 일반적인 현상이다.
- 면역항체 생산 또는 백신검정용 실험 소동물로 가장 흔하게 사용되는 토끼와 기니픽을 이용하여 시판되는 4개사의 제품들에 대한 항체형성능을 비교 조사하였다. 이 시험에서 CCV 불활화 백신에 대하여 더 우수한 면역반응을 나타내는 실험 소동물을 선발하기 위하여 예비 시험을 실시하였던 바 공시한 4개 제품 모두 백신접종 2주 후부터 중화항체가 검출되기 시작하여 4-5주 후에 가장 높은 항체가를 나타낸 후 항체 역가는 떨어지기 시작하였다. 그리고 백신 접종 후 경과한 시기와는 상관없이 토끼보다 기니픽에서 더 높은 항체가를 유도하였다(Table 1).
- 일반적으로 알려진 바와 같이 생 백신을 접종할 때와는 달리 불활화 백신을 접종할 때에는 효과적인 면역반응을 유도하기 위해서는 반드시 추가접종(booster inoculation)이 필요하며 이렇게 하여 유도된 항체가는 시간이 경과하면 서서히 떨어지기 때문에 대부분의 불활화 백신은 6개월 내지 1년마다 추가접종을 실시하도록 권장하고 있다 [26]. 이 연구의 결과에서도 CCV 불활화 백신 접종시 실험동물인 토끼와 기니픽 뿐만 아니라 목적동물인 개에서도 1차 접종 후 2주까지는 낮은 역가의 항체가 유도되기 시작한 후 memory cell의 면역기억에 의하여 2차 접종(booster inoculation) 후에는 항체가가 급격하게 상승하는 것을 관찰할 수 있었다. 생성된 항체가의 지속능에서는 개와 토끼의 경우 1차 접종 4주 후까지는 항체가가 지속적으로 상승하다가 5-6주 후에는 항체역가가 저하하는 것을 확인하였다.
- 그리고 유도되는 항체역가에서도 전체적으로 백신접종 후 동일한 시기에 항체가를 측정하였을 때 목적동물인 개에서의 항체가가 기니픽에서의 항체가 보다 약 2배 정도 높게 나타남을 알 수 있었다. 이러한 사실은 시험에 사용한 동물의 체중만을 단순하게 비교하여 볼 때 이 백신의 항원성은 기니픽보다는 개에서 월등하게 우수함을 확인하였다. 한편 추가적인 고려 사항으로 이 시험에서는 체중약 2 kg의 소형견을 사용하였으나 대형견을 사용할 경우에는 면역반응이 소형견에 비하여 낮은 수준으로 나타날 수 있음을 고려하여야 할 것으로 생각되었다.
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때 시판되는 4종류의 CCV 불활화 백신의 역가시험을 수행할 때 목적동물인 개를 대신하여 기니픽을 사용할 수 있음을 확인하였으며, CCV 불활화 백신에 대한 개와 기니픽간의 항체형성능 및 개의 체중에 따른 안전범위 등을 고려하여 1차 접종 4주후에 항체가를 측정하여 평균항체가 3(log2) 이상인 경우 합격처리 할 수 있을 것으로 판단되었다. 실험 소 동물인 기니픽을 이용한 역가 시험에서 불합격되는 CCV 불활화 백신에 대해서는 최종 확인 시험으로 개를 사용하는 기존의 역가시험을 실시하여 적합여부를 결정하는 것이 타당할 것으로 사료된다.
- 이상의 결론을 근거로 CCV 불활화 백신의 역가시험을 개를 대신하여 기니픽을 사용하여 실시한다면 실험동물의 안정적인 확보, 간편한 사육 시설, 동물의 관리 및 실험의 편의성을 도모할 수 있을 것으로 생각되었다.
- 따라서 CCV 불활화 백신 접종 후 개와 기니픽 간의 평균 항체역가를 비교해 볼 때 접종 후 2주 까지는 두 그룹간의 항체역가의 차이는 현저하게 나타났지만 3주 후부터 5주 사이에 개에서 유도되는 항체가는 기니픽에서의 항체가 보다 2배 정도 높게 유도되는 것을 알 수 있었다. 즉, 체중 약 2 kg의 소형견을 사용할 때 CCV 불활화 백신에 대한 면역반응은 기니픽보다 목적동물인 개가 더 우수함을 확인하였다.
후속연구
- 실험 소 동물인 기니픽을 이용한 역가 시험에서 불합격되는 CCV 불활화 백신에 대해서는 최종 확인 시험으로 개를 사용하는 기존의 역가시험을 실시하여 적합여부를 결정하는 것이 타당할 것으로 사료된다. 기니픽을 사용하여 CCV 불활화 백신의 역가시험을 실시함으로써 국가검정 뿐만 아니라 백신제조회사의 자가검정 시에 편리하고 경제적으로 역가시험을 수행할 수 있을 것으로 기대된다.
- 이러한 사실은 시험에 사용한 동물의 체중만을 단순하게 비교하여 볼 때 이 백신의 항원성은 기니픽보다는 개에서 월등하게 우수함을 확인하였다. 한편 추가적인 고려 사항으로 이 시험에서는 체중약 2 kg의 소형견을 사용하였으나 대형견을 사용할 경우에는 면역반응이 소형견에 비하여 낮은 수준으로 나타날 수 있음을 고려하여야 할 것으로 생각되었다.
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