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문제 정의
- DA는 세균에서 유래하여 사람을 포함한 진핵생물계에도 널리 존재하는 금속 이온의 수용부위인 cupin superfamily에 속하며, DB는 기능은 밝혀지지 않았으나 세균계에 잘 보존된 단백질의 하나로 나타났다. DA와 DB는 정확한 기능은 알 수 없으나 bFMO와 같은 전사단위로 발현되며 M. aminosulfidovorans SKI의 bFMO와 유연관계가 높은 단백질을 지니는 Mesorhiwbium loti 및 Sitiorhizobium melioti에서도 유사한 단백질이 존재하는 것으로 보아 bFMO와 함께 생체이물질의 산화에 관여할 가능성을 추측해 볼 수 있다.
- 본 연구는 M. aminosulfidovorans SKI이 난분해성 물질인 TMA를 산화하는 과정에서 bFMO가 어떤 역할을 하는지 규명하고자 수행되었다. 앞의 연구에서 M.
제안 방법
- E-FMO와 M-FMO 프라이머에 의해 증폭된 DNA 절편이 포함된 플라스미드를 pME, B-FMO와 A-FMO 프라이머에 의해 증폭된 DNA 절편이 포함된 플라스미드를 pAB, J-FMO와 I-FMO 프라이머에 의해 증폭된 DNA 절편이 포함된 플라스미드를 pU로 명명하였다. M. aminosulfidovorans SKI 유전자 절편이 클로닝 되어 있는 재조 합 플라스미드(pME, pAB, pU)를 정제하여 bfmo 유전자를 포함하여 총 8, 120bp의 염기서열을 결정하였다.
- M. aminosulfidovorans SKI에서 분리한 총 RNA를 주형으로 cDNA를 합성한 후 이 cDNA를 주형으로 PCR 반응을 수행하여 M. aminosulfidovorans SKI에서 발현되는 RNA를 증폭하였다. PCR 반응에 의해 증폭된 DNA는 아가로스 젤 전기영동으로 확인하였다.
- M. aminosulfidovorans SKI의 bfmo 유전자 상단부 및 하단부 DNA 절편은 PCR을 이용하여 클로닝하였다. 염기서열을 알고 있는 bfmo 유전자서열에서 제한효소자리를 분석한 후, 제한효소 자리를 기준으로 양쪽 방향을 향하는 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
- 염기서열을 알고 있는 bfmo 유전자서열에서 제한효소자리를 분석한 후, 제한효소 자리를 기준으로 양쪽 방향을 향하는 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. M. aminosulfidovorans SKI의 염색체 DNA를 적절한 제한효소로 자른 후 DNA 조각의 양 말단을 연결시켜 원형 DNA를 만들어 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 이때 서열을 알고 있는 부위의 제한효소자리를 기준으로 양쪽 방향을 향하는 올리고뉴클레오티드 2개를 프라이머로 사용하여, 특이적 산물이 충분하게 생성되는 조건의 잡종 DNA 형성 온도를 결정하였다 (Fig.
- 합성된 cDNA와 정방향 및 역방향프라이머를 PCR preMix 튜브에 20 pmole을 투여한 후 멸균된 증류수로 최종부 피를 20μl로 맞추었다. PCR 반응시 정방향 프라이머와 주형 DNA와의 혼성온도를 적절하게 조절하여 수행하였다. PCR 산물은 1.
- aminosulfidovorans SKI에서 발현되는 RNA를 증폭하였다. PCR 반응에 의해 증폭된 DNA는 아가로스 젤 전기영동으로 확인하였다. 이 세균의 유전체 DNA를 양성대조군으로 사용하였으며, 이 경우 PCR 반응 결과 모든 유전자내와 유전자간에서 예측된 크기의 DNA 밴드가 나타났다(Fig.
- PCR에 의해 증폭된 DNA 절편은 정제하여 각각 pGEM®-T Easy 벡터에 클로닝하였으며, 이를 E. coli DH5a 균주에 형질전환 시킨 후 원하는 클론을 선별하였다. E-FMO와 M-FMO 프라이머에 의해 증폭된 DNA 절편이 포함된 플라스미드를 pME, B-FMO와 A-FMO 프라이머에 의해 증폭된 DNA 절편이 포함된 플라스미드를 pAB, J-FMO와 I-FMO 프라이머에 의해 증폭된 DNA 절편이 포함된 플라스미드를 pU로 명명하였다.
- 5%(v/v)가 되도록 첨가하였다. TMA는 휘발성이 강하므로 12시간마다 최종농도가 0.03%(v/v)가 되도록 재투여 하였다.
- 총 RNA는 Invitrogen의 trizol reagent 방법으로 정제하였다. cDNA합성을 위해 각각의 유전자 서열 중 적절한 부위에 28mer 정도 길이의 상보적인 서열을 지닌 역방향프라이머를 작성하였다. cDNA 합성은 Bioneer 사의 AccuPower RT PreMix를 사용하였으며 제조사의 실험방법을 따랐다.
- 형질전환된 세균은 암피실린이 포함된 LB 고체배지에서 선별한 다음, 플라스미드를 정제하여 염기서열을 결정하였다. 매번 3개의 클론을 독립적으로 선별하여 각각의 염기서열을 결정함으로 써 PCR을 이용한 클로닝 과정에서의 오류를 최소화 하였다. 염기서열은 한국기초과학지원연구원(광주분원)에 의뢰하여 결정하였으며 염기서열은 GenBank에 등록하였다(GenBank accession number AY772018).
- net)의 ORFinder를 이용하여 ORF를 찾은 후 염기서열을 아미노산서열로 번역하였다. 번역된 아미노산 서열은 Basic Local Alignment Search Tool (PHI- and PSI- BLAST, 1) 데이터베이스를 이용하여 유사한 단백질 서열을 조사하였으며 다른 생물과의 유연관계를 분석하였다. DNA 염기서열과 단백질의 아미노산서열 다중정렬(multiple alignment)에는 European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI, www.
- aminosulfidovorans SKI의 bfmo 유전자를 대장균에 형질전환하였을 때 그 유전자 산물이 TMA를 산화하는 활성을 높인다는 사실이 밝혀졌다(5). 본 연구에서는 먼저 M. aminosulfidovorans SKI 유전체에서 bfmo 유전자의 상단부와 하단부 염기서열을 결정한 다음, 이 부분의 유전 자가 실제로 발현되는지 확인하고 상단부에 인접해 존재하는 잠재적 조절유전자와 하단부에서 bfmo 유전자와 공동으로 전사되는 유전자를 확인하였다
- RT-PCR의 역방향 프라이머로 이용할 올리고뉴클레오티드는 각각의 ORF 개시코돈에서 하단부 방향으로 약 300-400bp 떨어진 위치에서 28mer의 길이로 합성하였다. 역방향 프라이머의 위치가 정해지면 유전자와 유전자 사이를 PCR하기 위해 역방향 프라이머가 위치하는 유전자의 상단부 유전자를 정방향 프라이 머를 위한 올리고뉴클레오티드의 주형으로 이용하였다. 증폭될 DNA 절편의 길이가 약 700bp 정도 되도록 유전자의 3말단부위 에서 정하였다.
- aminosulfidovorans SKI의 bfmo 유전자 상단부 및 하단부 DNA 절편은 PCR을 이용하여 클로닝하였다. 염기서열을 알고 있는 bfmo 유전자서열에서 제한효소자리를 분석한 후, 제한효소 자리를 기준으로 양쪽 방향을 향하는 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. M.
- 위의 과정에서 증폭된 DNA 절편의 염기서열을 결정한 다음 EcoRI 절편 내에 존재하는 제한효소 Sall 인식자리를 이용하여 만든 원형 DNA 주형과 M-FMO 및 E-FMO 프라이머로 PCR 반응을 하여 3, 201bp 길이의 DNA 절편을 증폭하였다(Fig. 2C, Fig. 3B).
- 증폭될 DNA 절편의 길이가 약 700bp 정도 되도록 유전자의 3말단부위 에서 정하였다. 유전자내를 PCR하기 위해 역방향프라이머가 위치하는 유전자의 개시코돈 부근에서, 증폭될 DNA 절편의 길이 가 300bp 정도 되도록 정방향 프라이머의 위치를 정하였다(Fig.4).
- 1과 같은 방법으로 클로닝하였으며 이때 사용한 프라이머 및 증폭된 DNA 산물의 크기는 Table 1에 나타내었다. 유전체 DNA를 분리하여 EcoRI으로 절단한 다음 양 끝을 이어 만든 원형 DNA를 주형으로, 서로 반대방향을 향하는 B-FMO와 A-FMO를 프라이머로 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과 l, 409bp 길이의 bjmo 유전자 상단부 DNA 절편이 증폭되었다(Fig.
- aminosulfidovorans SKI의 염색체 DNA를 적절한 제한효소로 자른 후 DNA 조각의 양 말단을 연결시켜 원형 DNA를 만들어 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 이때 서열을 알고 있는 부위의 제한효소자리를 기준으로 양쪽 방향을 향하는 올리고뉴클레오티드 2개를 프라이머로 사용하여, 특이적 산물이 충분하게 생성되는 조건의 잡종 DNA 형성 온도를 결정하였다 (Fig. 1).
- -T Easy Vector(Promega)와 pET28a(+)(Novagen) 플라스미드를 이용하였다. 재조합된 플라스미드는 E. coli DH5a 균주 또는 E. coli BL21 (DE3) 균주에 형질전환 하였다. 대장균의 배양에는 Luria-Bertani (LB) 배지를 사용하였다.
- 재조합플라스미드(pME, pAB, pU)에서 염기서열을 결정한 후, EnCyclon® (www.encyclon.net)의 ORFinder 를 이용하여 M. aminosulfidovorans SKI bfmo 유전자의 상단부 및 하단부 ORF를 분석하였다. pAB와 pME에 재조합된 DNA의 염기서열을 결정하여 조합한 결과 bftno 유전자 상단부에 네 개의 ORF가 존재함을 확인할 수 있었다.
- 재조합플라스미드를 이용하여 DNA 염기서 열이 결정되면 EnCyclon®(www.encyclon.net)의 ORFinder를 이용하여 ORF를 찾은 후 염기서열을 아미노산서열로 번역하였다. 번역된 아미노산 서열은 Basic Local Alignment Search Tool (PHI- and PSI- BLAST, 1) 데이터베이스를 이용하여 유사한 단백질 서열을 조사하였으며 다른 생물과의 유연관계를 분석하였다.
- pAB와 pME에 재조합된 DNA의 염기서열을 결정하여 조합한 결과 bftno 유전자 상단부에 네 개의 ORF가 존재함을 확인할 수 있었다. 하단부에 위치하는 유전자는 pIJ에 재조합된 DNA의 염기서열을 결정하여 세 개의 ORF를 확인하였다. 따라서 염기서열이 결정된 DNA는 bfmo 유전자를 포함하여 모두 8, 120bp이며 8개의 ORF로 이루어져 있음을 알 수 있었다.
- cDNA 합성은 Bioneer 사의 AccuPower RT PreMix를 사용하였으며 제조사의 실험방법을 따랐다. 합성된 cDNA와 정방향 및 역방향프라이머를 PCR preMix 튜브에 20 pmole을 투여한 후 멸균된 증류수로 최종부 피를 20μl로 맞추었다. PCR 반응시 정방향 프라이머와 주형 DNA와의 혼성온도를 적절하게 조절하여 수행하였다.
- 대장균의 배양에는 Luria-Bertani (LB) 배지를 사용하였다. 항생제는 필요에 따라 암피실린(최종농도 100mg/ml) 또는 카나마이신(최종농도 50mg/ml)을 첨가하였다.
- coli DH5a 균주에 형질전환하였다. 형질전환된 세균은 암피실린이 포함된 LB 고체배지에서 선별한 다음, 플라스미드를 정제하여 염기서열을 결정하였다. 매번 3개의 클론을 독립적으로 선별하여 각각의 염기서열을 결정함으로 써 PCR을 이용한 클로닝 과정에서의 오류를 최소화 하였다.
대상 데이터
- ud 유전자는 역방향으로 암호화되어 있으며, 아미노말단에서부터 683개의 아미노산이 확인되었으며 종결코돈은 서열이 결정된 부분에서 확인되지 않았다. bfmo 유전자의 하단부에 위치하는 da 및 db 유전자는 각각 115 및 164개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하였다. 이들 두 개의 유전자가 암호화하는 작은 단백질은 아직 기능은 밝혀지지 않았으나 세균계에 잘 보존된 단백질의 일종으로 나타났다.
- cDNA합성을 위해 각각의 유전자 서열 중 적절한 부위에 28mer 정도 길이의 상보적인 서열을 지닌 역방향프라이머를 작성하였다. cDNA 합성은 Bioneer 사의 AccuPower RT PreMix를 사용하였으며 제조사의 실험방법을 따랐다. 합성된 cDNA와 정방향 및 역방향프라이머를 PCR preMix 튜브에 20 pmole을 투여한 후 멸균된 증류수로 최종부 피를 20μl로 맞추었다.
- coli BL21 (DE3) 균주에 형질전환 하였다. 대장균의 배양에는 Luria-Bertani (LB) 배지를 사용하였다. 항생제는 필요에 따라 암피실린(최종농도 100mg/ml) 또는 카나마이신(최종농도 50mg/ml)을 첨가하였다.
- 실험에 사용된 균주인 M. aminosulfidovorans SK1(KCTC 10323 BP)은 3%(w/v)의 NaCl이 포함된 기본무기배지(standard mineral base medium, SMM)에 탄소원 및 에너지원을 첨가한 다음 호기적인 상태에서 30ºC로 배양하였다(16). 탄소 및 에너지원으로는 최종농도 1%(v/v)의 메탄올(Merck), 또는 0.
- 클로닝 벡터로는 pGEM®-T Easy Vector(Promega)와 pET28a(+)(Novagen) 플라스미드를 이용하였다. 재조합된 플라스미드는 E.
- aminosulfidovorans SK1(KCTC 10323 BP)은 3%(w/v)의 NaCl이 포함된 기본무기배지(standard mineral base medium, SMM)에 탄소원 및 에너지원을 첨가한 다음 호기적인 상태에서 30ºC로 배양하였다(16). 탄소 및 에너지원으로는 최종농도 1%(v/v)의 메탄올(Merck), 또는 0.03%(v/v)의 TMA를 사용하였다. 필요한 경우 0.
이론/모형
- 번역된 아미노산 서열은 Basic Local Alignment Search Tool (PHI- and PSI- BLAST, 1) 데이터베이스를 이용하여 유사한 단백질 서열을 조사하였으며 다른 생물과의 유연관계를 분석하였다. DNA 염기서열과 단백질의 아미노산서열 다중정렬(multiple alignment)에는 European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI, www.ebi.ac.uk) 웹사이트에서 제공하는 공개 소프트웨어인 CLUSIAL W(22)를 이용하였다.
- 매번 3개의 클론을 독립적으로 선별하여 각각의 염기서열을 결정함으로 써 PCR을 이용한 클로닝 과정에서의 오류를 최소화 하였다. 염기서열은 한국기초과학지원연구원(광주분원)에 의뢰하여 결정하였으며 염기서열은 GenBank에 등록하였다(GenBank accession number AY772018).
- aminosulfidovorans SKI을 회수하였다. 총 RNA는 Invitrogen의 trizol reagent 방법으로 정제하였다. cDNA합성을 위해 각각의 유전자 서열 중 적절한 부위에 28mer 정도 길이의 상보적인 서열을 지닌 역방향프라이머를 작성하였다.
성능/효과
- coli DH5a 균주에 형질전환 시킨 후 원하는 클론을 선별하였다. E-FMO와 M-FMO 프라이머에 의해 증폭된 DNA 절편이 포함된 플라스미드를 pME, B-FMO와 A-FMO 프라이머에 의해 증폭된 DNA 절편이 포함된 플라스미드를 pAB, J-FMO와 I-FMO 프라이머에 의해 증폭된 DNA 절편이 포함된 플라스미드를 pU로 명명하였다. M.
- 5). M. aminosulfidovorans SKI에서 전사된 RNA를 주형으로 각 ORF의 유전자의 내부를 PCR 반응 시킨 결과 모두 예측된 크기의 DNA 밴드가 나타났다. 유전자와 유전자 사이를 증폭한 반응에서는 uc와 ub 사이, fmo와 da 사이, da와 db 사이에서 예즉된 크기의 DNA 절편이 증폭되었다(Fig.
- M. aminosulfidovorans SKI의 유전체에서 bfmo 유전자의 상단부 및 하단부에 존재하는 유전자 염기서열을 분석한 결과 bfmo와 동일한 방향으로 전사되는 여섯 개의 ORF가 세 개의 전사단위로 발현됨을 확인하였다(Fig. 6). 이들 ORE가 각기 고유한 전 사단위를 이루며 mRNA로 전사되는 것은 이들 유전자가 M.
- 이들의 G+C 함유율은 43-49%이다(24). Methylophaga 속은 모두 11종이 발견되었다. 지금까지 6 종(M.
- aminosulfidovorans SKI bfmo 유전자의 상단부 및 하단부 ORF를 분석하였다. pAB와 pME에 재조합된 DNA의 염기서열을 결정하여 조합한 결과 bftno 유전자 상단부에 네 개의 ORF가 존재함을 확인할 수 있었다. 하단부에 위치하는 유전자는 pIJ에 재조합된 DNA의 염기서열을 결정하여 세 개의 ORF를 확인하였다.
- ua 유전자에 의해 발현되는 단백질은 259개의 아미노산으로 구성되어 있으며 Methanosarcina mazei Gol의 메틸기 수용 화학구성 단백질(methyl-accepting chemotaxis protein)의 일부와 34%의 일치도를 보이나 단백질 전체의 유사도는 높지 않은 것으로 나타났다. ua 유전자의 상단부에 위치하는 ub 및 uC 유전자에 의해 발현되는 단백질은 E.
- 유전체 DNA를 분리하여 EcoRI으로 절단한 다음 양 끝을 이어 만든 원형 DNA를 주형으로, 서로 반대방향을 향하는 B-FMO와 A-FMO를 프라이머로 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과 l, 409bp 길이의 bjmo 유전자 상단부 DNA 절편이 증폭되었다(Fig. 2A, Fig. 3A). 또한 Sphl을 이용하여 만든 원형 DNA와 I-FMO와 J-FMO를 프라이머로 PCR 증폭 반응을 시킨 결과 l, 907bp 길이의 하단부 DNA 절편을 얻을 수 있었다(Fig.
- 하단부에 위치하는 유전자는 pIJ에 재조합된 DNA의 염기서열을 결정하여 세 개의 ORF를 확인하였다. 따라서 염기서열이 결정된 DNA는 bfmo 유전자를 포함하여 모두 8, 120bp이며 8개의 ORF로 이루어져 있음을 알 수 있었다. 상단부 ORF는 bfmo에 가까이 위치한 유전자부터 차례로 ua, ub, uc, ud로 명명하였으며 하단부 ORF는 da, db, de라고 명명하였다.
- 3A). 또한 Sphl을 이용하여 만든 원형 DNA와 I-FMO와 J-FMO를 프라이머로 PCR 증폭 반응을 시킨 결과 l, 907bp 길이의 하단부 DNA 절편을 얻을 수 있었다(Fig. 2B, Fig 3A).
- 이와 같은 RT-PCR의 결과로 uc 유전자와 ub 유전자는 동일한 전사단위로 구성되고, ua 유전자는 독립적으로 전사되는 것을 확인하였다. 또한 bfmo 유전자는 하단부에 위치하는 두 개의 유전자(da와 db)와 함께 동일한 오페론으로 전사됨을 알 수 있었다. 유전자내와 유전자간에서 RT-PCR에 의한 DNA 절편이 증폭된 것으로 보아 M.
- 또한 bfmo 유전자는 하단부에 위치하는 두 개의 유전자(da와 db)와 함께 동일한 오페론으로 전사됨을 알 수 있었다. 유전자내와 유전자간에서 RT-PCR에 의한 DNA 절편이 증폭된 것으로 보아 M. aminosulfidovorans SKI의 bfmo를 포함한 여덟 개의 0RF가 모두 기능을 지닌 단백질을 암호화하고 있는 것으로 판단된다.
- aminosulfidovorans SKI에서 전사된 RNA를 주형으로 각 ORF의 유전자의 내부를 PCR 반응 시킨 결과 모두 예측된 크기의 DNA 밴드가 나타났다. 유전자와 유전자 사이를 증폭한 반응에서는 uc와 ub 사이, fmo와 da 사이, da와 db 사이에서 예즉된 크기의 DNA 절편이 증폭되었다(Fig. 5). 이와 같은 RT-PCR의 결과로 uc 유전자와 ub 유전자는 동일한 전사단위로 구성되고, ua 유전자는 독립적으로 전사되는 것을 확인하였다.
- bfmo 유전자의 하단부에 위치하는 da 및 db 유전자는 각각 115 및 164개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하였다. 이들 두 개의 유전자가 암호화하는 작은 단백질은 아직 기능은 밝혀지지 않았으나 세균계에 잘 보존된 단백질의 일종으로 나타났다. de 유전자는 bfmo 유전자와 반대방향으로 암호화되어 있으며, 206개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호하였다.
- 5). 이와 같은 RT-PCR의 결과로 uc 유전자와 ub 유전자는 동일한 전사단위로 구성되고, ua 유전자는 독립적으로 전사되는 것을 확인하였다. 또한 bfmo 유전자는 하단부에 위치하는 두 개의 유전자(da와 db)와 함께 동일한 오페론으로 전사됨을 알 수 있었다.
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