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문제 정의
- aureus 균주를 유전자 수준에서 그 다양성을 분석하고자 PCR 기법에 기초하여 유전자 수준에서 특성분석을 수행하였다. 그리고 이 연구에서 수행한 5종의 PCR 기법들이 산생한 개별 성적들을 객관적으로 분석하여 가장 감별 능력이 뛰어나고 신뢰도 높은 PCR 기법을 선발할 수 있었기에 이 연구의 궁극적인 목적을 획득하였다. 비록 이 연구와 동시에 수행되었지만 지면관계상 함께 보고하지 못했던 RAPD, REP-PCR 및 ERIC-PCR 등의 총 8종의 PCR의 종합성적은 별도의 지면을 통하여 추가로 보고할 계획임을 밝혀 두고자 한다.
- aureus의 유전학적 분석을 위해 가장 많이 활용되고 있는 분석기법은 PCR에 기초한 분석기법으로 분석되었다. 따라서 우리의 연구에서는 단일한 축종에 국한되지 않고 가능하면 다종 다양한 동물 숙주에서 선발된 균주와 특히 사람환자에서 분리된 균주까지 확보하여 지금까지 S. aureus 균종의 유전학적 분석을 위해서 적용된 다양한 PCR 기법들을 선발하여 국내 분리주의 유전학적 특성을 구명하고, 또한 이들 분석기법 중에서 국내 분리주에 대해서 가장 감별 능력이 뛰어난 신뢰도 높은 분석 기법을 선발해보고자 하였다.
- 따라서 다종 다양한 분석기법들이 산출해낸 성적들 역시 다양할 수밖에 없기 때문에 객관적이고 과학적인 방법에 근거하여 분석기법들이 확보한 고유한 감별 능력 (Discriminative ability: DA)에 대한 비교분석 연구는 그동안 없었던 실정이다. 따라서 이 연구에서는 전술한 사항에 대한 성적을 확보하고자, 사람을 포함한 다종다양한 동물숙주유래의 공시균주들을 활용하여 S. aureus 균주의 유전학적 분석에 활용된 5종의 PCR 기법 중에서 가장 신뢰도 높은 DA을 확보한 PCR 기법을 선발하여 알리고자 하는데 연구의 궁극적인 목적을 두고 Hunter와 Gaston (15)이 활용했던 Simpson's index of diversity (SID)를 산출하여 개별 PCR 기법의 DA를 수치로서 비교하였던 바 흥미로운 성적을 얻었기에 이를 알리고자 하였다.
- aureus에서 도 aroA-gene가 존재하여 균종감별과 동시에 PCR-RFLP로서 유전자 수준에서 종이하의 역학적 분석목적까지 수행이 가능하다고 보고하였다. 따라서 이 유전자의 유용성이 현재의 공시균주들 에 대해서 어떠한 성적을 발현할지에 대해서도 조사하고자 하였다.
- 결과적으로 단일한 분석방법에 의존하지 않고 다양한 분석기법을 적용하고 그 성적들을 통계학적 분석방법으로 보다 객관적 및 과학적으로 분석할 경우에는 보다 공유하기 쉬운 해석을 이끌어낼 수 있다는 사실을 이 연구를 통하여 확인할 수 있었다. 우리의 연구에서는 국내 동물과 사람에서 분리된 S. aureus 균주를 유전자 수준에서 그 다양성을 분석하고자 PCR 기법에 기초하여 유전자 수준에서 특성분석을 수행하였다. 그리고 이 연구에서 수행한 5종의 PCR 기법들이 산생한 개별 성적들을 객관적으로 분석하여 가장 감별 능력이 뛰어나고 신뢰도 높은 PCR 기법을 선발할 수 있었기에 이 연구의 궁극적인 목적을 획득하였다.
제안 방법
- aureus 균주들이 산생하는 내독소(SE)의 분포양상의 조사는 Mehrotra(22)의 방법에 따라서 SEA (120 bp), SEB (478 bp), SEC (257 bp), SED (317 bp), SEE (170 bp), TSST (350 bp) 등의 6종의 SE 유전자를 동시에 증폭하기 위한 M-PCR 기법을 사용하였다. M-PCR용의 6쌍의 primer도 전자(22)의 정보에 따라 합성을 의뢰하여 사용하였고, 역시 PCR premix kit를 사용하였다. 그리고 PCR 반응이 완료된 후 증폭산물은 전자(22)의 성적과 대조균주 SE의 증폭산물의 크기와 비교하면서 SE의 분포양상을 분석하였다.
- 순수 정제된 DNA를 사용하여 aroA-gene PCR을 수행하였고, primer 쌍은 Marcos 등(21)의 정보에 따라서 FA1과 RA2 primer 의 합성을 의뢰(Bioneer, Korea)하여 사용하였다. PCR 반응은 시 험간의 편차를 줄이고 일관성 있는 성적의 산출을 위해서 상품화된 PCR premix kit (Bioneer, Korea)를 구입하여 사용하였다. PCR 장치는 Applied-Biosystem (Type 9700, USA) 장치를 사용 하였고, PCR 조건은 전자 등(21)의 방법에 따라서 수행하였으며, TAE buffer (Bioneer, Korea)를 사용하여 1.
- spa-gene의 증폭을 위한 PCR primer는 GeneBank (X61307)의 유전자 염기서열 중에서 forward primer는 1522~1544의 위치와 reverse primer로 1784-1806의 위치에서 결정하고 합성을 의뢰하여 사용하였고, PCR-premix kit를 사용하여 수행하였다. PCR 조건은 미리 95ºC에서 3분간 열변성과정을 우선 수행하고 이어서 총 30회의 본 반응으로서 94ºC에서 1분간 열변성과 60ºC에서 1분간 primers의 합성과정, 72ºC에서 1분간의 표적 DNA의 신장 과정을 수행하도록 구성하였고, 추가로 72ºC에서 10분간의 신장 반응을 1회 수행하고 프로그램을 종결하였다. 전기영동법으로 결과산물을 확인하였고, 다양한 크기로 검출된 spa-gene PCR 증폭 산물의 분석은 전술한 바와 동일한 절차로 수행하였다.
- PCR을 이용한 mecA-gene의 검줄용 primers는 Vannuffel 등(29)의 정보에 따라서 합성하여 사용하였다. PCR 증폭산물의 확인은 2% agarose gel을 사용하였고, 125 V에서 30분간 전기영동을 수행하고 자외선 조사장치로 533 bp 크기의 meM-gene의 특이증폭산물을 확인하였다. 그리고 MRSA 균주의 유전자 수준에서의 신속한 검증은 York 등(30)의 방법에 따라서 Hhal (Sigma, USA)의 제한효소로 증폭산물을 소화시켜서 332 bp와 201 bp 크기의 2개의 DNA band로 양분되는 균주를 MRSA 양성균주로 결정하였다.
- Montesinos (23)의 정보에 따라서 coa-gene의 변이유전자 영역 (variable region)에서 primer를 선발하였다. PCR의 수행은 우 등(4)이 이미 확립한 조건으로 수행하였고, PCR 연쇄반응은 전술한 방법과 동일하게 PCR premix kit를 사용하여 수행하였다. coa-gene PCR에서 출현하는 다양한 크기의 증폭산물들에 대해서는 전술한 바와 동일한 절차로 분석을 수행하였다.
- Hunter와 Gaston(15)의 방법에 따라서 우리의 연구에서 적용한 5종의 PCR 기법들이 생산한 결과성적을 기초로 하여 개별 분석 기법들이 확보하고 있는 DA을 알기 쉽고 보기 쉽도록 객관적인 수치로 변환하여 비교하고자, Simpson's index of diversity (SID)를 산출하여 평가하는 방법을 사용하였다. SID의 계산은 전자의 공식에 따라서 계산하여 산출하고, 또한 평가기준에 따라서 최종 SID 값이 0.900 이상을 확보한 분석기법은 신뢰도를 인정할 수 있는 DA을 확보한 기법으로 평가되지만, SID 값이 0.900 이하인 분석기법은 그렇지 못한 기법으로 평가하였다.
- PCR의 수행은 우 등(4)이 이미 확립한 조건으로 수행하였고, PCR 연쇄반응은 전술한 방법과 동일하게 PCR premix kit를 사용하여 수행하였다. coa-gene PCR에서 출현하는 다양한 크기의 증폭산물들에 대해서는 전술한 바와 동일한 절차로 분석을 수행하였다.
- spa-gene의 증폭을 위한 PCR primer는 GeneBank (X61307)의 유전자 염기서열 중에서 forward primer는 1522~1544의 위치와 reverse primer로 1784-1806의 위치에서 결정하고 합성을 의뢰하여 사용하였고, PCR-premix kit를 사용하여 수행하였다. PCR 조건은 미리 95ºC에서 3분간 열변성과정을 우선 수행하고 이어서 총 30회의 본 반응으로서 94ºC에서 1분간 열변성과 60ºC에서 1분간 primers의 합성과정, 72ºC에서 1분간의 표적 DNA의 신장 과정을 수행하도록 구성하였고, 추가로 72ºC에서 10분간의 신장 반응을 1회 수행하고 프로그램을 종결하였다.
- 각종 동물유래 균주는 물론 특히 경북 북부지역의한 종합병원의 사람유래 균주를 포함하여 총 116주의 S. aureus에 대하여 사람과 동물에서 공통적으로 약제내성균으로 치료에서 어려움을 겪고 있는 문제의 병원체인 MRSA 균주를 보다 신속하고 효율적으로 검색하고자 PCR로서 mecA-gene을 검출하는 방법을 적용하였다. Fig.
- 공시한 S. aurues 균주들을 유전자 수준에서 추가적인 분석을 위해서 coa-gene PCR 증폭산물을 Alul enzyme로 소화시켜 산생된 DNA 단편들의 분포양상에 근거하여 균주 상호간의 다양성을 분석한 성적을 Fig. 5에 나타내었다. 그림성적에서와 같이 전체적으로 약 700 bp에서부터 2~7개의 DNA 단편들로 구성되어 있으며, 대조균주인 S.
- M-PCR용의 6쌍의 primer도 전자(22)의 정보에 따라 합성을 의뢰하여 사용하였고, 역시 PCR premix kit를 사용하였다. 그리고 PCR 반응이 완료된 후 증폭산물은 전자(22)의 성적과 대조균주 SE의 증폭산물의 크기와 비교하면서 SE의 분포양상을 분석하였다.
- Hoefnagels-Schuermans 등 (14)에 따르면 spa-genee 고도로 다양성을 갖는 X-region이 다양한 수의 반복단위(24 bp크기)로 구성되어 이를 PCR로 증폭이 가능하고, PCR 증폭산물의 경우 9 repeats의 변이주의 경우 263 bp의 증폭산물을 산생하지만, 기타 변이주들은 반복단위의 수에 따라서 다양성을 보였다고 하였다. 따라서 우리의 성적에서도 이들의 분류기준을 적용하여 분석하였다.
- 순수 정제된 DNA를 사용하여 aroA-gene PCR을 수행하였고, primer 쌍은 Marcos 등(21)의 정보에 따라서 FA1과 RA2 primer 의 합성을 의뢰(Bioneer, Korea)하여 사용하였다. PCR 반응은 시 험간의 편차를 줄이고 일관성 있는 성적의 산출을 위해서 상품화된 PCR premix kit (Bioneer, Korea)를 구입하여 사용하였다.
- 신속한 균종감별 목적으로 nuc-gene PCR에서 양성으로 확인된 균주만 genomic DNA의 추출과 정제를 실시하였으며, lysozyme (Sigma, USA)과 lysostaphin (Sigma, USA)으로 소화시키고 proteinase K (GibcoBRL, USA)로 추가로 소화시킨 후, phenol을 이용한 DNA 추출법으로 순수하게 추출된 DNA를 PCR 시험에 사용하였다.
- 우리의 연구에서는 대조균주인 S. aureus ATCC 13565 균주의 coa-gene PCR 증폭산물의 크기가 728 bp이기에 이를 coa-gene (0 repeat; coa-2 type) 대조구로 설정하고, coa-gene의 경우 3'- end에서 81 bp repeat 만큼의 변이현상에 따라서 다양한 변이주가 발생되므로 이를 분류기준으로 설정하여, 국내 각종 동물과 사람유래 균주들 사이에 분포하는 변이주의 분포양상을 조사하였다(12, 13, 21). Hookey 등(13)은 제한효소로 AluI과 CfoI을 사용했다는 점에서 우리의 성적과 차이를 보였고, 또한 85주의 MRSA와 10주의 MSSA 균주에 대해서 PCR-RFLP를 실시하여 모두 10 type의 RFLP pattern이 존재함을 보고하였다.
- aureus에 대해서 spa-gene의 X-region에 존재하는 VNTR에 대하여 PCR을 실시하였을 때, 총 11 type (spa 1~11)의 genotype으로 세분되었다(Table 6).이 연구에서는 증폭산물의 크기의 정밀한 분석을 위해서 전문분석 프로그램을 적용하여 정밀하게 측정하여 그 성적에 근거하여 유전형을 분석하였다. 그 결과 공시균주 중에서 9 repeats (spa-7 type)의 변이 주 (263 bp)가 전체 112주 중에서 39주 (34.
- 이 연구에서는 표현형질보다는 보다 안정적인 유전자 수준에서 S. aureus의 분자역학적 특성구명을 위해서 PCR 기법을 적용하여 검출된 SSG의 다양성을 분석하였고, 추가적으로 RFLP (coa & aroA} 까지 적용하여 분석을 시도하였다. 그 결과 RFLP 의 적용이 안되는 SSG (spa & nuc) 보다는 RFLP의 적용이 가능한 SSG의 경우가 보다 신뢰도 높은 분석성적을 확보할 수 있었다(Table 9 참조).
- coa-gene PCR 증폭산물 10μ1를 10 U의 AluL enzyme (Sigma, USA)으로 소화시켰다. 이렇게 소화된 DNA 단편들은 분석능을 향상시키고자 2% PFGE grade agarose gel (Bio-Rad, USA)를 사용하여 전기영동을 수행하고 사진촬영을 하였으며, 나머지의 절차는 전술한 방법과 동일하게 수행하였다.
- 이상과 같이 coa-gene PCR 성적을 토대로 국내 동물 및 사람 유래 S. aureus 균주에 대해서 분자역학적 다양성 분석을 수행하였지만, 이 연구에서 공시한 균주들에 대해서 전술한 방법이 얼마나 신뢰도 높고 효율적으로 감별하였는지에 대한 의문을 해결하고자, SID 값을 산출하여 비교하였다. 먼저 시야로 분석한 성적에 근거하여 SID 값을 산출하였을 경우 SID=0.
- 5-2% agarose gel을 사용하여 전기영동법으로 특이증폭산물을 확인하였다. 전기 영동법으로 해당크기에서 증폭산물이 확인된 균주의 aroA-gene PCR 증폭산물에 대해서는 Rsal (Invitrogen, USA) 효소를 적용하여 PCR 증폭산물 12μ1에 10 U의 RE와 10X reaction buffer 와 BSA를 각각 포함하도록 혼합하여 총 20μ1의 용량으로 조절한 후에 37ºC에서 8시간 배양으로 소화시킨 후, 2-2.5% agarose gel을 사용하여 소화된 DNA 단편들의 다양성을 확인하고 사진 촬영하였다. 성적의 분석은 사진촬영(Polaroid, Kodak)을 하고 이를 스캐너(HP Scanjet 35000, USA)를 이용하여 그림파일(TIFF Image)로 전환하고 전문분석 프로그램인 Bio-1D2+ software (Vilber Lourmat, France) 와 GelCompar II software (Applied Math, Belgium)를 사용하여 5%의 허용한계 범위에서 DNA bands의 상관성은 Dice coefficient 방법에 따라서 결정하였고, UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic averages) 방법으로 dendrogram을 작성하고 clustering(군집형성)분석을 실시하였다.
대상 데이터
- aureus) 균주들은 포함하여 총 116주를 공시하였다. 그리고 각종 실험의 대조를 위해서 S. aureus ATCC 25923, S. aureus NCTC 5663 및 S. aureus NCTC 9393과 S. epidermidis ATCC 12228 등의 균주도 함께 공시하였다.
- 이들 균주들은 임상증상이 발견되어 가축위생시험소 경북북부지소에 질병진단의 목적으로 의뢰된 환축에서 분리된 균주들이다. 반면 실험용 마우스 유래 균주는 사육 및 실험과정에서 관찰된 화농병소에서 분리된 균주이며, 김 등(1)이 제공한 사람유래 20주의 MRSA 및 MSSA (methicillin sensitive S. aureus) 균주들은 포함하여 총 116주를 공시하였다. 그리고 각종 실험의 대조를 위해서 S.
데이터처리
- S. aureus 균주에 대하여 적용하였던 총 5종의 PCR에 기초한 분석기법들이 산출한 개별 분석성적에 근거하여 SID 값을 산출하고 이를 토대로 객관적으로 평가하였으며 그 성적을 Table 8와 9에 나타내었다. 먼저 amA-gene PCR-RFLP 기법은 공시된 균주들을 모두 7 type의 유전형으로 분류하였고, 그 중 17주(73.
이론/모형
- Hunter와 Gaston(15)의 방법에 따라서 우리의 연구에서 적용한 5종의 PCR 기법들이 생산한 결과성적을 기초로 하여 개별 분석 기법들이 확보하고 있는 DA을 알기 쉽고 보기 쉽도록 객관적인 수치로 변환하여 비교하고자, Simpson's index of diversity (SID)를 산출하여 평가하는 방법을 사용하였다. SID의 계산은 전자의 공식에 따라서 계산하여 산출하고, 또한 평가기준에 따라서 최종 SID 값이 0.
- PCR 반응은 시 험간의 편차를 줄이고 일관성 있는 성적의 산출을 위해서 상품화된 PCR premix kit (Bioneer, Korea)를 구입하여 사용하였다. PCR 장치는 Applied-Biosystem (Type 9700, USA) 장치를 사용 하였고, PCR 조건은 전자 등(21)의 방법에 따라서 수행하였으며, TAE buffer (Bioneer, Korea)를 사용하여 1.5-2% agarose gel을 사용하여 전기영동법으로 특이증폭산물을 확인하였다. 전기 영동법으로 해당크기에서 증폭산물이 확인된 균주의 aroA-gene PCR 증폭산물에 대해서는 Rsal (Invitrogen, USA) 효소를 적용하여 PCR 증폭산물 12μ1에 10 U의 RE와 10X reaction buffer 와 BSA를 각각 포함하도록 혼합하여 총 20μ1의 용량으로 조절한 후에 37ºC에서 8시간 배양으로 소화시킨 후, 2-2.
- PCR을 이용한 mecA-gene의 검줄용 primers는 Vannuffel 등(29)의 정보에 따라서 합성하여 사용하였다. PCR 증폭산물의 확인은 2% agarose gel을 사용하였고, 125 V에서 30분간 전기영동을 수행하고 자외선 조사장치로 533 bp 크기의 meM-gene의 특이증폭산물을 확인하였다.
- 국내 사람과 각종 동물에서 분리한 S. aureus 균주들이 산생하는 내독소(SE)의 분포양상의 조사는 Mehrotra(22)의 방법에 따라서 SEA (120 bp), SEB (478 bp), SEC (257 bp), SED (317 bp), SEE (170 bp), TSST (350 bp) 등의 6종의 SE 유전자를 동시에 증폭하기 위한 M-PCR 기법을 사용하였다. M-PCR용의 6쌍의 primer도 전자(22)의 정보에 따라 합성을 의뢰하여 사용하였고, 역시 PCR premix kit를 사용하였다.
- PCR 증폭산물의 확인은 2% agarose gel을 사용하였고, 125 V에서 30분간 전기영동을 수행하고 자외선 조사장치로 533 bp 크기의 meM-gene의 특이증폭산물을 확인하였다. 그리고 MRSA 균주의 유전자 수준에서의 신속한 검증은 York 등(30)의 방법에 따라서 Hhal (Sigma, USA)의 제한효소로 증폭산물을 소화시켜서 332 bp와 201 bp 크기의 2개의 DNA band로 양분되는 균주를 MRSA 양성균주로 결정하였다.
- 이 연구에 사용된 균주들의 표현형질상 특성에 근거한 균종감별은 표준실험실 동정법으로 실시하였다. 보관상 및 실험절차상 오류로 인하여 추가로 동정이 필요한 균주들과 PCR 시험에서 재동정이 필요한 균주들에 대해서는 MacFaddin 등(20)의 표준실험실 동정법에 근거하여 균종감별을 재차 확인한 후에 시험에 사용하였다.
- 5% agarose gel을 사용하여 소화된 DNA 단편들의 다양성을 확인하고 사진 촬영하였다. 성적의 분석은 사진촬영(Polaroid, Kodak)을 하고 이를 스캐너(HP Scanjet 35000, USA)를 이용하여 그림파일(TIFF Image)로 전환하고 전문분석 프로그램인 Bio-1D2+ software (Vilber Lourmat, France) 와 GelCompar II software (Applied Math, Belgium)를 사용하여 5%의 허용한계 범위에서 DNA bands의 상관성은 Dice coefficient 방법에 따라서 결정하였고, UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic averages) 방법으로 dendrogram을 작성하고 clustering(군집형성)분석을 실시하였다. 이렇게 분석된 성적에 근거하여 객관적인 수치인 SID 값으로 산출하여 해당 분석기법이 확보하고 있는 감별능력 (Discriminatory ability: DA)을 최종적으로 평가하는 절차에 따랐다.
- 이 연구에 사용된 균주들의 표현형질상 특성에 근거한 균종감별은 표준실험실 동정법으로 실시하였다. 보관상 및 실험절차상 오류로 인하여 추가로 동정이 필요한 균주들과 PCR 시험에서 재동정이 필요한 균주들에 대해서는 MacFaddin 등(20)의 표준실험실 동정법에 근거하여 균종감별을 재차 확인한 후에 시험에 사용하였다.
- 성적의 분석은 사진촬영(Polaroid, Kodak)을 하고 이를 스캐너(HP Scanjet 35000, USA)를 이용하여 그림파일(TIFF Image)로 전환하고 전문분석 프로그램인 Bio-1D2+ software (Vilber Lourmat, France) 와 GelCompar II software (Applied Math, Belgium)를 사용하여 5%의 허용한계 범위에서 DNA bands의 상관성은 Dice coefficient 방법에 따라서 결정하였고, UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic averages) 방법으로 dendrogram을 작성하고 clustering(군집형성)분석을 실시하였다. 이렇게 분석된 성적에 근거하여 객관적인 수치인 SID 값으로 산출하여 해당 분석기법이 확보하고 있는 감별능력 (Discriminatory ability: DA)을 최종적으로 평가하는 절차에 따랐다.
성능/효과
- 0%)에서 다양한 크기의 양성의 coa-gene이 검출되었다. Fig. 3에서 나타낸바와 같이 coa-genee 약 650 bp~2.0 kb 크기로 분포하였고, 그 중 810-900 bp 크기의 PCR 증폭산물이 43주(39.4%)에서 확인되어 가장 대표적인 coa-type으로 결정되었으며, 이어서 710 -800 bp 크기의 증폭산물이 29주(26.6%)로 2번째로 많았다.
- aureus ATCC 25923 균주와 경북 북부지역의한 종합병원의 사람유래 균주에서만 mecA-gene이 확인되었을 뿐, 다행히 나머지 동물인 한우나 염소, 개, 돼지, 닭, 오리 및 마우스 유래의 어떠한 균주에서도 mecA-genee 검출되지 않았다. Fig. 7 (Panel A)의 성적에서는 mecA-PCR에서 증폭된 DNA band가 mecA-gene에 해당하는 것인지를 유전자 수준에서의 검증을 하였던 바, 현재의 연구에서 14주의 mecA-PCR 양성균주 모두(100%)는 전술한 바와 같은 2개의 DNA band로 양분되어, 이들 균주들은 유전자 수준에서 전형적인 MRSA 균주로 결정되었다 (Fig. 7; Panel B).
- aureus에 대하여 사람과 동물에서 공통적으로 약제내성균으로 치료에서 어려움을 겪고 있는 문제의 병원체인 MRSA 균주를 보다 신속하고 효율적으로 검색하고자 PCR로서 mecA-gene을 검출하는 방법을 적용하였다. Fig. 7에서 나타낸 바와 같이 공시 균주 중에서 mecA-gene PCR의 증폭산물(533 bp)은 116주의 공시균주 중에서 단지 14주(12.1%)에서만 확인되었다(Table 8). 대조균주인 S.
- 1에서 나타낸 바와 같이 약 1, 153 bp 크기에서 특이 적인 증폭산물을 확인할 수 있었다. PCR 성적에서는 공시균주 중 단지 99주(73.9%)만이 약 1, 153 bp 크기에서 양성의 단일한 증폭산물이 확인되었다. 이는 우리의 연구에서 수행한 PCR 기법 중 가장 저조한 양성율 성적으로 조사되었다.
- S. aureus의 SSG (coa 및 spa)로 알려져 있는 coa-gene (87.9 %)이나 spa-gene (91.4%)의 PCR 성적들과 비교할 때, aroA- gene PCRe 26.7%라는 상대적으로 저조한 양성율 성적을 보였다(Table 9 참조). 그리고 aroA-gene PCR의 민감도와 특이성을 비교했을 경우, 민감도는 47.
- 8%)로 가장 대표적인 유전형인 것으로 발견되었다. Table 4와 Fig. 8의 양자의 성적에서 나타낸 바와 같이 한우, 닭, 개, 염소, 마우스 등의 다양한 숙주들과 심지어 MRSA 균주에서도 마찬가지의 양상으로서 spa-7 type이 각각 가장 지배적인 genotype으로 조사되었다. 따라서 돼지와 사람유래 균주를 제외한 기타의 출처에서 분리된 균주들 모두에서 가장 지배적인 genotypee spa-7 type의 변이주로 조사되었다.
- 그리고 마우스에서 분리된 균주들은 3~4개의 DNA band로 소화되었지만, 역시 균주간에 비슷한 양상을 보였다. aroA-gene PCR-RFLP 기법이 확보하고 있는 DA을 객관적으로 분석 및 평가하기 위한 성적은 Fig. 2에 나타낸 바와 같았고, 분석프로그램으로 작성된 dendrogram에 근거하여 SID 값을 산출하였을 때 0.462의 성적으로 기준치에 훨씬 못 미치는 성적으로 비교대상 PCR 기법 중에서는 가장 신뢰도가 떨어지는 성적으로 조사되었다.
- 돼지유래 2주중 1주에서만 sec-gene 가 검출되었다. 개에서 분리된 4주중 2주에서 sea-gene가 검출되었고, 마우스유래 균주에서는 sea-gene가 16주(72.7%)에서 검출되어 가장 지배적인 양상으로 조사되었고, 닭유래 균주에서는 sea-gene이 10주(41.7%)로 가장 많았다. 한편, 사람유래 균주 중에서는 sea+sec의 2개의 유전자가 동시에 검출된 균주가 8주 (33.
- 8), 아마도 전자(23)등은 MRSA 균주만을 단독으로 사용하였기 때문일 것으로 생각되었다. 결과적으로 Table 10의 분석기법 상호간의 감별능력의 비교에서 coa-gene typinge 유전자 수준의 신뢰성 있는 분석기법으로 평가할 수 있었지만, spa-gene typinge 전자에 비하여 신뢰성이 다소 떨어지는 것으로 평가되어, Belkum 등(8)의 주장과 일치하는 성적으로 간주되었다.
- 결과적으로 단일한 분석방법에 의존하지 않고 다양한 분석기법을 적용하고 그 성적들을 통계학적 분석방법으로 보다 객관적 및 과학적으로 분석할 경우에는 보다 공유하기 쉬운 해석을 이끌어낼 수 있다는 사실을 이 연구를 통하여 확인할 수 있었다. 우리의 연구에서는 국내 동물과 사람에서 분리된 S.
- 그리고 SEB와 SEC의 2종 동시 산생균주가 SEA+SED의 동시 산생균주 보다는 훨씬 더 많았다고 하였다. 결국 우리의 성적에서 소유래 균주의 68.4%(13/19)의 균주가 SE 독소를 산생하여 인도의 성적과 거의 유사한 성적으로 분석되었다. 한편 Kato 등(17)은 도쿄 중심가에 위치한 14개 빌딩의 레스토랑에서 포획된 910두의 쥐 (rat)에서 SEA, SEB, SEC 및 SED에 해당하는 독소를 35주에서 확인하였고, 그 중 SEA와 SEB가 각각 13주로 가장 많았다고 하였다.
- 그 결과 RFLP 의 적용이 안되는 SSG (spa & nuc) 보다는 RFLP의 적용이 가능한 SSG의 경우가 보다 신뢰도 높은 분석성적을 확보할 수 있었다(Table 9 참조). 결국 총 113주의 S. aureus 균주에 적용되었던 coa-PCR-RFLP 기법이 발현한 SID 값은 0.894로서 이 연구에서 적용한 PCR 기법 중에서는 가장 신뢰도 높은 성적으로 평가되었다. 일반적으로 coa-gene PCR 성적은 단조로운 하나 이상의 81 bp repeat에 해당하는 유전자의 변이현상과 Alul enzyme 의 인식부위의 차이에 따른 다양성에 근거한 분석방법이기 때문에 다종 다양한 출처유래의 많은 균주들을 효과적으로 감별하기에는 다소 감별 능력이 미흡한 측면이 있다.
- 공시된 총 116주의 S. aureus에 대해서 spa-gene의 X-region에 존재하는 VNTR에 대하여 PCR을 실시하였을 때, 총 11 type (spa 1~11)의 genotype으로 세분되었다(Table 6).이 연구에서는 증폭산물의 크기의 정밀한 분석을 위해서 전문분석 프로그램을 적용하여 정밀하게 측정하여 그 성적에 근거하여 유전형을 분석하였다.
- 이 연구에서는 증폭산물의 크기의 정밀한 분석을 위해서 전문분석 프로그램을 적용하여 정밀하게 측정하여 그 성적에 근거하여 유전형을 분석하였다. 그 결과 공시균주 중에서 9 repeats (spa-7 type)의 변이 주 (263 bp)가 전체 112주 중에서 39주 (34.8%)로 가장 대표적인 유전형인 것으로 발견되었다. Table 4와 Fig.
- 8%가 SE를 산생하였고, SE의 유형도 SED 단일형이라고 하였다. 그러나 우리의 성적에서 오리를 포함한 계육에서 선발된 24주에서는 SEA가 10주(41.7%)로 가장 많았고 SED가 검출된 균주는 전혀 확인되지 않아 현저한 차이를 보였다. 다만 정(5)은 독소의 검출방법으로 MGDT (microslide gel double diffusion test)와 RPLA (rapid plate latex agglutination test) kit를 사용하였다는 점에서 차이가 있었는바, 분석방법의 차이로 인해서 동일한 동물숙주유래 균주에서 성적에 현저한 차이가 발생할 수 있는지에 대해서는 추가적인 검토가 필요할 것으로 보인다(Fig.
- Montesinos 등(23)도 스페인에서 124주의 MRSA 균주에 대해서 AluI과 HaeⅢ를 사용하여 4 type의 RFLP pattern을 확인하였지만, 2주는 coa-gene PCR 증폭산물을 산생하지 않았다고 하였다. 그리고 89%(114주)에 해당하는 균주들이 coa-1 type으로서 가장 대표적인 genotype이었고, 이 성적은 PFGE 성적과도 높은 상관성을 보였다고 하였다. Schwarzkopf와 Karch(26)는 coa-gene내에 존재하는 C-말단을 지배하는 유전자 좌에서의 유전학적 변이현상을 밝히고자 coa-gene의 다양성을 분석하였지만, coa-gene typing 기법의 감별능력은 S.
- 8%)만이 양성반응을 보여 가장 낮은 양성율 성적을 나타내었다. 그리고 MRSA 균주를 포함된 사람유래 총 45주 중 32주(71.7%)에서만 양성의 PCR 증폭산물이 확인되었다.
- 7%라는 상대적으로 저조한 양성율 성적을 보였다(Table 9 참조). 그리고 aroA-gene PCR의 민감도와 특이성을 비교했을 경우, 민감도는 47.6%였고, 특이성도 29.2%로 저조한 성적을 보여 S. aureus의 종특이 유전자(SSG)의 검출을 위한 진단기법으로는 감별 능력이 미흡한 것으로 보였다. 한편 Marcos 등(21)도 전술한 방법을 신뢰도 높은 분석기법으로 판정하지는 않았는데, 이는 결국 우리의 연구에서도 aroA-gene PCR 기법이 가장 낮은 SID 값을 산생한 성적으로도 충분히 짐작할 수 있었다.
- 894로 가장 높은 수치를 발현하였다. 그리고 coa-gene PCRe 모두 10 type의 genotype으로 분류하였고, 그 중 36주(33.0%)가 대표적인 그룹에 포함되었고, SID 값은 0.883으로 확인되었다. 반면에 spa-gene PCRe 공시 균주를 모두 11 type의 genotype으로 분류하였고 39주(34.
- 그리고 spa-6 type에는 소와 닭유래 균주가 각각 4주로 가장 많았고, spa-8 type도 역시 소와 사람유래의 3주에서 각각 확인되었다. 그리고 ll-repeats (spa-9; 311 bp)의 균주도 16 주 (14.3%)나 되었으며, 7 repeats (spa-5; 215 bp)의 균주도 12 주 (10.7%)나 발견되었고, 기타의 genotype들도 확인되었지만 이들이 차지하는 비중은 낮은 것으로 분석되었다. 그리고 특히 spa-type과 MRSA 균주와의 관련성에 있어서는 다만 spa-7 type 이 MRSA 균주 중에서 가장 많았다는 사시이 이 연구에서 확인 되었다.
- 2%)로서 두 번째로 많은 빈도를 보였다. 그리고 spa-6 type에는 소와 닭유래 균주가 각각 4주로 가장 많았고, spa-8 type도 역시 소와 사람유래의 3주에서 각각 확인되었다. 그리고 ll-repeats (spa-9; 311 bp)의 균주도 16 주 (14.
- 그리고 전자 등(18)은 소유래 균주에서 SE 산생균주는 0~1개 정도로 낮은 빈도였고, 양과 염소유래 균주들은 70~80%로 상당히 높은 빈도였고, 소, 양 및 염소에서는 SEC 산생균주들이 가장 많았다고 하였다. 그리고 스페인의 성적에서도 양과 염소유래 균주들은 역시 SEC 산생균주가 가장 많았다고 하였는데, 우리의 성적에서 염소유래 3주중 SEA와 SEC 2종의 독소를 동시에 산생하는 균주가 2주고, 나머지 1주는 SEC 산생균주로서 전자의 성적과 일치하는 성적으로 분석되었고, 또한 우리나라 소유래 균주들은 SEA 산생균주가 7주(36.8%)로 가장 많아 전자(18)들의 성적과 일치하는 경향이었다. 한편 전자 등(18)은 가금에서도 S.
- 7%)나 발견되었고, 기타의 genotype들도 확인되었지만 이들이 차지하는 비중은 낮은 것으로 분석되었다. 그리고 특히 spa-type과 MRSA 균주와의 관련성에 있어서는 다만 spa-7 type 이 MRSA 균주 중에서 가장 많았다는 사시이 이 연구에서 확인 되었다.
- 5에 나타내었다. 그림성적에서와 같이 전체적으로 약 700 bp에서부터 2~7개의 DNA 단편들로 구성되어 있으며, 대조균주인 S. aureus ATCC 13565와 상동성을 비교하였을 때, 20주가 유전자 수준에서 50%의 상동율성적(similarity)으로 유전학적인 관련성을 보였고, 또한 S. aureus NCTC 5663 균주와도 50%범위에서 유전학적 상동성을 나타내었지만, 나머지 균주들과는 유전자 수준에서 어떠한 관련성도 보이지 않았다. 이상의 성적을 토대로 하여 전문분석 프로그램을 사용하여 DNA 단편들의 분자량을 측정하고 덴드로그람을 작성하여 SID 값을 산출하였을 때, 총 113주에 대한 coa-PCR-RFLP 성적의 SID 값은 0.
- 다종 다양한 동물과 사람유래의 총 116주의 S. aureus 균주들이 보유하고 있는 am4-gene의 신속한 검출을 위한 PCR에서 양성 균주는 Fig. 1에서 나타낸 바와 같이 약 1, 153 bp 크기에서 특이 적인 증폭산물을 확인할 수 있었다. PCR 성적에서는 공시균주 중 단지 99주(73.
- 1%)에서만 확인되었다(Table 8). 대조균주인 S. aureus ATCC 25923 균주와 경북 북부지역의한 종합병원의 사람유래 균주에서만 mecA-gene이 확인되었을 뿐, 다행히 나머지 동물인 한우나 염소, 개, 돼지, 닭, 오리 및 마우스 유래의 어떠한 균주에서도 mecA-genee 검출되지 않았다. Fig.
- aureus ATCC 13565 (728 bp) 등의 균주들은 각각 다양한 크기의 coa-gene이 검출되었다. 따라서 coa-gene PCR 기법의 특이성을 확인할 수 있었으며, 공시한 총 116주에 적용하였을 때 , 총 109주(94.0%)에서 다양한 크기의 양성의 coa-gene이 검출되었다. Fig.
- 8의 양자의 성적에서 나타낸 바와 같이 한우, 닭, 개, 염소, 마우스 등의 다양한 숙주들과 심지어 MRSA 균주에서도 마찬가지의 양상으로서 spa-7 type이 각각 가장 지배적인 genotype으로 조사되었다. 따라서 돼지와 사람유래 균주를 제외한 기타의 출처에서 분리된 균주들 모두에서 가장 지배적인 genotypee spa-7 type의 변이주로 조사되었다. 이어서 8 repeats (spa-6; 239 bp}와 10 repeats (spa- 8; 287 bp)의 균주가 각각 17주(15.
- 883으로 보다 향상된 성적이 산출되었다(Table 9). 따라서 유전자 수준의 성적의 분석을 위해서는 전문 분석프로그램을 적용하는 것이 결과성적의 올바른 분석을 위해 필요함을 알 수 있었다.
- 894로 현재까지 가장 높은 SID 값을 산생하였다(Table 9). 따라서 이 PCR 기법이 우리의 연구에서 적용했던 기법 중에서는 가장 신뢰도가 높고 감별 능력이 뛰어난 것으로 평가되었다.
- 또한 Montesinos 등(23)도 스페인에서 분리된 총 124주의 MRSA 균주에서 4 type의 spa-type을 확인하였고, 스페인에서는 11 repeats의 변이주가 92주(72%)로 가장 대표적인 유전형으로 보고하였다. 따라서 이들의 성적과 비교하면 9 repeats가 가장 많았던 우리의 성적과는 차이가 있는데(Table 3 & 4 및 Fig. 8), 아마도 전자(23)등은 MRSA 균주만을 단독으로 사용하였기 때문일 것으로 생각되었다. 결과적으로 Table 10의 분석기법 상호간의 감별능력의 비교에서 coa-gene typinge 유전자 수준의 신뢰성 있는 분석기법으로 평가할 수 있었지만, spa-gene typinge 전자에 비하여 신뢰성이 다소 떨어지는 것으로 평가되어, Belkum 등(8)의 주장과 일치하는 성적으로 간주되었다.
- 806으로 coa-gene PCR 보다는 저조한 성적을 보였다. 따라서 현재의 연구에서 적용한 분석기법 중에서는 coa-gene PCR-RFLP 기법이 다종다양한 줄처유래의 S. aureus 균주들 상호간을 유전자 수준에서 가장 효율적이며 신뢰도 높은 분석기법으로 선발되었다.
- 2%)나 발견되었다. 또한 하나 이상의 내독소산생 유전자가 동시에 검출되었는 바, 먼저 sea+seb-gene의 2종의 유전자가 동시에 검출된 균주가 2주(2.8%)나 확인되었고, sea+sec-gene가 동시에 검출된 균주는 11주(15.9%)로서 2종이상의 유전자가 동시에 검출된 균주 중에서는 가장 많아 특이적인 성적으로 확인되었다. 아울러 seb+see-gene가 동시에 검출된 균주도 1주 발견되었다.
- aureus 균주가 산생하는 내독소의 분포양상을 조사하고자, M-PCR 기법을 수행한 성적은 Table 5, 6 및 7에 나타내었다. 먼저 SEA 독소산생을 지배하는 sea-gene (120 bp)이 검줄된 균주는 대조균주로 공시하였던 S. aureus ATCC 13515, S. aureus NCTC 5663 및 S. aureus NCTC 9393를 비롯하여 총 44주(63.7%)에서 검출되어 가장 대표적인 유전형으로 확인되었다. 이어서 seb-gene(478 bp)가 검출된 균주가 총 7주(10.
- aureus 균주에 대하여 적용하였던 총 5종의 PCR에 기초한 분석기법들이 산출한 개별 분석성적에 근거하여 SID 값을 산출하고 이를 토대로 객관적으로 평가하였으며 그 성적을 Table 8와 9에 나타내었다. 먼저 amA-gene PCR-RFLP 기법은 공시된 균주들을 모두 7 type의 유전형으로 분류하였고, 그 중 17주(73.9%)가 대표적인 그룹으로 감별하였지만, SID 값은 0.462로서 현재의 연구에서 활용한 PCR 기법 중에서는 가장 낮은 수치였다. 한편 지금까지 가장 많은 연구자들이 활용해왔던 분석기법의 하나인 coa-gene PCR-RFLP 기법은 공시균주들을 모두 11 type 의 genotype으로 분류하였고, 그 중 대표적인 그룹에는 19주(16.
- aureus 균주에 대해서 분자역학적 다양성 분석을 수행하였지만, 이 연구에서 공시한 균주들에 대해서 전술한 방법이 얼마나 신뢰도 높고 효율적으로 감별하였는지에 대한 의문을 해결하고자, SID 값을 산출하여 비교하였다. 먼저 시야로 분석한 성적에 근거하여 SID 값을 산출하였을 경우 SID=0.796으로 저조하였지만, 컴퓨터 프로그램으로 덴드로그람을 작성하여 보다 과학적으로 분석한 성적에 근거한 SID 값은 0.883으로 보다 향상된 성적이 산출되었다(Table 9). 따라서 유전자 수준의 성적의 분석을 위해서는 전문 분석프로그램을 적용하는 것이 결과성적의 올바른 분석을 위해 필요함을 알 수 있었다.
- 1에서와 같았다. 먼저 젖소 유방염유래 균주와 한우에서 분리된 균주에 대한 PCR-RFLP pattern에서는 약 900 bp에서부터 총 7개의 DNA 단편으로 소화되었으며, 시야로는 균주간에 거의 유사한 양상을 보여 균주간의 명확한 감별은 곤란하였다. 한편 사람유래 균주의 경우 2~7개의 DNA 단편들로 소화되었지만, 대부분 균주의 유전자 양상이 비슷하여 균주간의 뚜렷한 감 별은 분명하지 않았다.
- Table 2에서는 다양한 동물종과 사람유래 분리주에 대해서 coa-gene 분포양상의 성적을 토대로 분자역학적 다양성을 종합적으로 정리한 성적이다. 먼저 한우유래 균주의 경우 coa-5 type (3 repeats)이 9주(47.4%)로 가장 대표적인 유전형으로 확인되었고, 닭유래 균주에서는 coa-3 type (1 repeat)이 8주(33.3%)로 가장 지배적이었다. 반면 오리에서 분리된 2주는 공히 8 repeats 이상(2, 381 및 1, 920 bp)의 변이를 나타낸 균주로 확인되었다.
- epidemidis ATCC 12228 균주는 coa-gene PCR에서 어떠한 증폭산물도 인정되지 않았다. 반면에 S. aureus ATCC 13515 (743 bp), S. aureus NCTC 5663 (1, 164 bp), S. aureus NCTC 9393 (853 bp) 및 S. aureus ATCC 13565 (728 bp) 등의 균주들은 각각 다양한 크기의 coa-gene이 검출되었다. 따라서 coa-gene PCR 기법의 특이성을 확인할 수 있었으며, 공시한 총 116주에 적용하였을 때 , 총 109주(94.
- 6%)나 발견되었다. 반면에 S. aureus NCTC 5663 균주는 1, 164 bp 크기의 증폭산물을 산생하여 S. aureus ATCC 13565 균주에 대해 6 repeats의 변이주로 판단되며 S. aureus NCTC 9393 균주는 2 repeats의 변이주였고, S. aureus ATCC 13515 균주는 743 bp 크기의 증폭 산물로서 S. aureus ATCC 13565 균주와 일치하는 유전형으로 분류할 수 있었다(Table 1).
- 5%)로 3번째로 많은 빈도를 차지하였다. 반면에 coa-3 typee S. aureus ATCC 13565 균주 보다는 81 bp repeat의 유전자가 하나 더 추가된 1 repeat 균주로서 36주(33.0%)로서 가장 지배적인 유전형이었다. 한편 2 repeats (840-920 bp; coa-4 type)의 균주는 26주(23.
- 883으로 확인되었다. 반면에 spa-gene PCRe 공시 균주를 모두 11 type의 genotype으로 분류하였고 39주(34.8%)가 대표형의 구룹에 포함되었으며, SID 값은 0.806으로 coa-gene PCR 보다는 저조한 성적을 보였다. 따라서 현재의 연구에서 적용한 분석기법 중에서는 coa-gene PCR-RFLP 기법이 다종다양한 줄처유래의 S.
- 사람에서 S. aureus의 주요 보균장소는 비강점막이며 보균율은 20~60%이고 어른보다는 어린이에서 더욱 높은 보균율을 보이며 건강한 사람에서 분리된 균주의 절반(50%)이 SE를 산생하였고, 특히 SEA가 가장 지배적이라고 하였다. 식중독 발생의 경우 SEA가 가장 빈번하게 증명되고 있으며 식중독과 관련된 주요 보균매체는 주로 오염된 육류와 낙농제품들이 대부분의 경우에 관련된 것으로 보고되어 있다.
- 우리의 연구에서 공시한 S. aureus ATCC 13515와 NCTC 5663 균주는 공히 288 bp의 증폭산물을 산생하여 spa-8 type (10 repeats)으로 결정되었고, S. aureus NCTC 9393 균주도 296 bp의 증폭산물이 확인되어 동일한 spa-8 type으로 분류되었다 (Table 3 & 4 참조). 반면에 S.
- 이 연구에서는 Brakstad 등(9)의 성적과 같이 내열성의 효소인 nuclease를 지배하는 유전자인 nuc-gene(270 bp)과 coa-gene을 동시에 확인하고자 duplex-PCR을 실시하였던 바, 시험에 공시한 모든 균주(100%)에서 270 bp 크기의 nuc-gene의 증폭산물이 확인되었지만, coa-gene PCR 증폭산물은 전술된 성적과 같이 다양한 크기에서 확인되었고 음성균주는 쉽게 구분이 되어 duplex- PCR 기법의 실용성을 확인할 수 있었다.
- 900 이상의 SID 값을 확보하여야 바람직한 분석기법으로 평가할 수 있다고 하였다. 이들의 기준에 근거할 때 coa-PCR-RFLP 기법SID(0.894)은 비록 충분하지는 못했지만 우리가 수행한 분석기법 중에서는 가장 신뢰도가 높은 것으로 평가되었다(Table 9).
- aureus NCTC 5663 균주와도 50%범위에서 유전학적 상동성을 나타내었지만, 나머지 균주들과는 유전자 수준에서 어떠한 관련성도 보이지 않았다. 이상의 성적을 토대로 하여 전문분석 프로그램을 사용하여 DNA 단편들의 분자량을 측정하고 덴드로그람을 작성하여 SID 값을 산출하였을 때, 총 113주에 대한 coa-PCR-RFLP 성적의 SID 값은 0.894로 현재까지 가장 높은 SID 값을 산생하였다(Table 9). 따라서 이 PCR 기법이 우리의 연구에서 적용했던 기법 중에서는 가장 신뢰도가 높고 감별 능력이 뛰어난 것으로 평가되었다.
- 7%)에서 검출되어 가장 대표적인 유전형으로 확인되었다. 이어서 seb-gene(478 bp)가 검출된 균주가 총 7주(10.0%)였고, sec-gene가 검출된 균주도 5주(7.2%)나 발견되었다. 또한 하나 이상의 내독소산생 유전자가 동시에 검출되었는 바, 먼저 sea+seb-gene의 2종의 유전자가 동시에 검출된 균주가 2주(2.
- PCR 조건은 미리 95ºC에서 3분간 열변성과정을 우선 수행하고 이어서 총 30회의 본 반응으로서 94ºC에서 1분간 열변성과 60ºC에서 1분간 primers의 합성과정, 72ºC에서 1분간의 표적 DNA의 신장 과정을 수행하도록 구성하였고, 추가로 72ºC에서 10분간의 신장 반응을 1회 수행하고 프로그램을 종결하였다. 전기영동법으로 결과산물을 확인하였고, 다양한 크기로 검출된 spa-gene PCR 증폭 산물의 분석은 전술한 바와 동일한 절차로 수행하였다.
- 5%)로 거의 비슷한 양상으로 확인되었다. 한편 경북북부지역의 사람유래 균주 중에서 MRSA 균주의 경우 coa-3 type (1 repeat)이 5주 (45.5 %)로 가장 많았고, coa-4 type (2 repeats)도 4주 (36.4%)나 발견되었다. 반면에 사람유래 전체 균주의 경우에서는 coa-3 type (1 repeat)0] 11주 (45.
- 아울러 seb+see-gene가 동시에 검출된 균주도 1주 발견되었다. 한편 내독소산생 유전자의 분포양상을 동물 숙주별로 조사하였던 바 (Table 7), 한우에서는 sea-gene이 검출된 균주가 7주(36.8%)로 가장 지배적인 양상이었으며, seb-gene이 4주(21.1%), seb+see-gene이 동시에 검출된 균주도 1주(5.3%)가 분포하는 것으로 분석되었다. 흑염소의 경우 sea+sec-gene의 2종의 유전자가 동시에 검출된 균주가 3주중에서 2주(66.
- 한편 Kato 등(17)은 도쿄 중심가에 위치한 14개 빌딩의 레스토랑에서 포획된 910두의 쥐 (rat)에서 SEA, SEB, SEC 및 SED에 해당하는 독소를 35주에서 확인하였고, 그 중 SEA와 SEB가 각각 13주로 가장 많았다고 하였다. 한편 우리의 성적에서도 마우스유래 22주 중에서 SEA 산생균주가 16주(72.7%)로 가장 많아 일본의 성적과 일치하는 양상이었다(Table 6).
- aureus 이외의 균종도 SE를 산생하였다고 하였다. 한편 우리의 성적에서도 특 이한 성적으로서 S. epidermidis ATCC 12228 균주에서 sea와 sed-gene이 동시에 검출되어 전자의 성적과 일치하는 흥미로운 사실을 발견할 수 있었다. 또한 전자 등(18)은 S.
- 7%)로 가장 많았다. 한편, 사람유래 균주 중에서는 sea+sec의 2개의 유전자가 동시에 검출된 균주가 8주 (33.3%)로 가장 지배적인 양상이었고, 특히 사람유래 MRSA 균주 12주에 대해서 별도로 구분하여 조사하였을 경우, 역시 sea+ sec-gene가 동시에 검출된 균주가 5주(41.7%)로 가장 많았던 것이 특이적인 성적이었다.
후속연구
- aureus와 MRSA 균주를 비롯한 다양한 균종을 유전자 수준에서 subtyping 하려고 할 경우 그 분석기법이 감별 능력이 뛰어나고, 각종 역학정보와 상호관련성이 높은 분석기법이라면 임상 미생물을 취급하는 연구자에게는 가장 바람직한 분석기법이라 할 것이다. 그러나 염색체 DNA에 대한 전체 염기서열 분석법을 제외하면 아직도 전술한 요구사항을 충족시켜줄 방법은 추가적인 개발이 필요한 실정이다. 한편 최근 들어 chromosomal DNA 의 분석이 가능한 PFGE (Pulsed field gel electrophoresis) 기법을 활용한 macro-restriction 기법이 현재까지 적용한 방법들 중에서는 "Gold standard”로 인정되고 있는 실정이다 (7, 8, 23).
- 그래서 PCR 수행 후 그 증폭산물을 제한효소로 소화처리한 후 그 단편들의 다양성을 분석하는 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 기법이 많은 연구자들의 관심의 대상이 되고 있다(13, 21). 그러므로 전술한 분석기법을 국내 각종 동물유래 균주에 대해서 그 감별능력을 객관적으로 평가해 볼 필요가 있을 것으로 사료되었다.
- 7%)로 가장 많았고 SED가 검출된 균주는 전혀 확인되지 않아 현저한 차이를 보였다. 다만 정(5)은 독소의 검출방법으로 MGDT (microslide gel double diffusion test)와 RPLA (rapid plate latex agglutination test) kit를 사용하였다는 점에서 차이가 있었는바, 분석방법의 차이로 인해서 동일한 동물숙주유래 균주에서 성적에 현저한 차이가 발생할 수 있는지에 대해서는 추가적인 검토가 필요할 것으로 보인다(Fig. 9 및 Table 5 & 6 참조).
- 일반적으로 coa-gene PCR 성적은 단조로운 하나 이상의 81 bp repeat에 해당하는 유전자의 변이현상과 Alul enzyme 의 인식부위의 차이에 따른 다양성에 근거한 분석방법이기 때문에 다종 다양한 출처유래의 많은 균주들을 효과적으로 감별하기에는 다소 감별 능력이 미흡한 측면이 있다. 따라서 보다 감별 능력이 뛰어난 REP-PCR 및 PFGE 등과 같은 유전학적 분석기법의 도입이 필요할 것으로 사료되었다.
- aureus NCTC 9393 균주도 296 bp의 증폭산물이 확인되어 동일한 spa-8 type으로 분류되었다 (Table 3 & 4 참조). 반면에 S. aureus ATCC 13565 균주는 322 bp의 증폭산물을 산생하여 spa-9 type(ll repeats)으로 확인되었는데, 이는 추후로 동일한 실험을 하고자 할 때 실험실 간 성적을 비교할 경우에 유용한 정보로 활용될 수 있을 것으로 보인다.
- 그리고 이 연구에서 수행한 5종의 PCR 기법들이 산생한 개별 성적들을 객관적으로 분석하여 가장 감별 능력이 뛰어나고 신뢰도 높은 PCR 기법을 선발할 수 있었기에 이 연구의 궁극적인 목적을 획득하였다. 비록 이 연구와 동시에 수행되었지만 지면관계상 함께 보고하지 못했던 RAPD, REP-PCR 및 ERIC-PCR 등의 총 8종의 PCR의 종합성적은 별도의 지면을 통하여 추가로 보고할 계획임을 밝혀 두고자 한다.
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