포르말린으로 유도된 통증 유발 쥐에서 무침주입기를 이용한 봉독약침의 진통효과 Comparative Study of Therapeutic Effect of Needle-free Bee Venom Aqua-acupuncture (BVA) into Zusanli (ST36) in the Rat Formalin Test원문보기
Bee Venom aqua-acupuncture (BVA) simultaneously exerts pharmacological effects of biologically active compounds, existed in the whole bee venom, and medicinal effect of the stimulation of acupuncture points. BVA has been considered as a promising therapeutic method for treating various chronic disea...
Bee Venom aqua-acupuncture (BVA) simultaneously exerts pharmacological effects of biologically active compounds, existed in the whole bee venom, and medicinal effect of the stimulation of acupuncture points. BVA has been considered as a promising therapeutic method for treating various chronic diseases, mainly accompanying severe pain and inflammation. As a painless injection device, jet injectors have been commercially marketed for various clinical applications including insulin injection and vaccination. Among them, a pressure-driven jet injector system could be used for intradermal delivery of a variety of drugs. The aim of this study was to investigate the analgesic effects of the BVA using a needle-free injector (Biojector $2000^{\circledR}$, Bioject Inc., OR, USA), compared to the conventional BV aqua-acupuncture using a typical syringe. Adult Sprague-Dawley rats were injected with bee venom $(0.08mg/kg,\;50{\mu}l)$ using Biojector $2000^{\circledR}$ (BVA-B) or a syringe (BVA-5) into the Zusanli (ST36) acupoint, 30 minutes before plantar injection of 2% formalin. It was found that BVA-B-, or BVA-5-treated rats, compared to controls, exhibited significantly less licking behavior during the late phase in the rat formalin test, when compared to controls. During early phase, however, those effects were not significant but substantial. The analgesic effect of BVA-B was also compatible with that of the conventional BVA-5. In the immunohistochemical studies, BVA-B significantly suppressed the expression of formalin-evoked c-fos, a biomarker of neuronal activity, in the lumbar dorsal horn of the spinal cord. These results indicated that BVA-B waseffective in the modulation of pain in the rat formalin test, compared to BVA-5. Taken together, the needle-free jet injector system could be substituted for the conventional aqua- acupuncture with the advantage of little pain.
Bee Venom aqua-acupuncture (BVA) simultaneously exerts pharmacological effects of biologically active compounds, existed in the whole bee venom, and medicinal effect of the stimulation of acupuncture points. BVA has been considered as a promising therapeutic method for treating various chronic diseases, mainly accompanying severe pain and inflammation. As a painless injection device, jet injectors have been commercially marketed for various clinical applications including insulin injection and vaccination. Among them, a pressure-driven jet injector system could be used for intradermal delivery of a variety of drugs. The aim of this study was to investigate the analgesic effects of the BVA using a needle-free injector (Biojector $2000^{\circledR}$, Bioject Inc., OR, USA), compared to the conventional BV aqua-acupuncture using a typical syringe. Adult Sprague-Dawley rats were injected with bee venom $(0.08mg/kg,\;50{\mu}l)$ using Biojector $2000^{\circledR}$ (BVA-B) or a syringe (BVA-5) into the Zusanli (ST36) acupoint, 30 minutes before plantar injection of 2% formalin. It was found that BVA-B-, or BVA-5-treated rats, compared to controls, exhibited significantly less licking behavior during the late phase in the rat formalin test, when compared to controls. During early phase, however, those effects were not significant but substantial. The analgesic effect of BVA-B was also compatible with that of the conventional BVA-5. In the immunohistochemical studies, BVA-B significantly suppressed the expression of formalin-evoked c-fos, a biomarker of neuronal activity, in the lumbar dorsal horn of the spinal cord. These results indicated that BVA-B waseffective in the modulation of pain in the rat formalin test, compared to BVA-5. Taken together, the needle-free jet injector system could be substituted for the conventional aqua- acupuncture with the advantage of little pain.
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문제 정의
이에 본 실험은 무침형 주사기를 이용한 족삼리(ST36) 봉독 약침 자극의 진통효과를 평가하기 위해 formalin-induced pain behavior를 관찰하여 통증 억제 효과를 분석하고 쥐의 척수의 신경세포 내 c-fos의 변화를 관찰하여 평가하였다.
제안 방법
주사 후 즉시 실험동물을 거울을 설치한 플라스틱 chamber(20x20x20)에 넣어 행동의 변화를 관찰하였다. formalin 을 투여한 우측의 발바닥을 입으로 핥거나 깨무는 등의 행동을 보이는 것을 fomailn-induced pain behavior로 간주하였으며 이러한 실험동물의 행동을 formalin 투여 후 60분 동안 video camera recording system으로 녹화하여 5분 간격으로 관찰 하여 licking time을 측정하였고 초기반응기(early phase, 0T0분) 와후기 반응기 (late phase, 10분~30분)로 나누어 관찰하였다.
001% keyhole limpet hemocyan 등이 들어있는 용액으로 1000배 희석하여 준비하였다 척수 조직은 4℃Z primary antiserum에서 72 시간 동안 배양하였다. 그 후조직을 PBST로 세척한 후 2시간 동안 실온에서 2% normal rabbit serum을 함유하는 PBST에서 200배로 희석한 biotinylated rabbit anti-sheep serum(Vector Laboratories, Burlingame, CA) 에 반응 시켰다. PBST로 5회 세척한 후 조직은 실온에서 1시간 동안 Vectastain ElitABC™ reagent (Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 담가 반응시켰다.
모든 동물은 일정한 환경(20±2℃, 오전 7 시부터 시작해서 12시간 간격으로 명암을 유지)을 유지 시켰다. 또한 신경세포의 활성에 영향을 미칠 수 있는 불필요한 요인을 배제하기 위해 실험은 오전 10시에서 오후5시 사이에 실시하였으며 실험동물의 체온은 일정하게 유지시키고 실험 30분전에 외부 환경을 23-25oC 를 유지할 수 있는 observation chamber로 옮겨 실험 하였다.
PBST로 세척한 후 조직을 착색제인 diaminobenzidine을 사용하여 발색시켰다. 발색이 끝난 조직은 2시간 동안 실온에서 건조 시킨 후 cover-slipped 한 후 광학현미경(Carl Zeiss, Germany, 50X)을 사용하여 superficial layers (SDH, laminal, 2)발현된 ofos를 관찰하여 발현된 c-fos의수틀 세어 그 결과를 통해 봉독 약침 자극 후를 평가하였다.
봉독 약침 사극이 formalin-induced pain behavior인 paw licking 행동을 관찰하여 통증 억제 효과를 평가하고 봉독 약침 주사 입기에 따른 효과를 평가 하고자 일반 주사기와 무침 주사기를 이용하여 족삼리에 봉독 약침 자극을 시행하여 아래와 같은 결론을 얻었다.
50μ1을 약침 자극하였다. 봉독 약침 자극은 봉독 약침 주사기(30gauge, 녹십자)와 Biojector2000® 를 이용하여 인체의 족삼리(ST36) 에 상응하는 부위에 주사하였다.
시험에 사용된 봉독 약침액은 약침 학회에서 제조하여 공급한 봉독액 50μ1를 사용하였고 formalin 투여 30분전에 시험 동물의 후지에 있는 tibia anterior tubercle의 외측 5mm에 tibia와 fibula 사이에 위치하고 있는 족삼리에 각기 다른 약침자극으로봉독약침액 50μ1을 약침 자극하였다. 봉독 약침 자극은 봉독 약침 주사기(30gauge, 녹십자)와 Biojector2000® 를 이용하여 인체의 족삼리(ST36) 에 상응하는 부위에 주사하였다.
차단되는 chamber에서 실시하였다. 실험동물을 실험 장소로 옮기고 1시간의 적응 기간을 거친 다음 봉독 약침 자극을 실시하고 30분 후에 동물실험의 우측 후지 발바닥에 2% formalin (0.37%formaldehyde) 50μ1을 피하주사(30gauge, 녹십자)로 주입하였다. 주사 후 즉시 실험동물을 거울을 설치한 플라스틱 chamber(20x20x20)에 넣어 행동의 변화를 관찰하였다.
실험동물의 봉독 약침 자극은 족삼리 (ST36)에 약침 자극 군과 무처치군으로 나누어 실시하였고 약침 자극군은 주사기를 이용한 약침 자극 군과 Biojector2000® 이용한 약침자극 군으로 나누었다.
37%formaldehyde) 50μ1을 피하주사(30gauge, 녹십자)로 주입하였다. 주사 후 즉시 실험동물을 거울을 설치한 플라스틱 chamber(20x20x20)에 넣어 행동의 변화를 관찰하였다. formalin 을 투여한 우측의 발바닥을 입으로 핥거나 깨무는 등의 행동을 보이는 것을 fomailn-induced pain behavior로 간주하였으며 이러한 실험동물의 행동을 formalin 투여 후 60분 동안 video camera recording system으로 녹화하여 5분 간격으로 관찰 하여 licking time을 측정하였고 초기반응기(early phase, 0T0분) 와후기 반응기 (late phase, 10분~30분)로 나누어 관찰하였다.
대상 데이터
통증의 인식에는 통각수용기와 신경조직, 척수, 시상, 대뇌피질 등이 관여하며, 지각신경의 말초가 물리적 혹은 화학적 자극인자에 의해 자극되면 그 자극이 척수 연수 시상 등의 통각 전도로를 따라 대뇌피질에 있는 통각 중추에 전달되어 일어난다切 통증 치료에 대한 연구는 약물, 신경차단, 전기 자극등의 활용 뿐 아니라 침구학 전분야 즉 체침, 전침, 약침 등에 걸쳐 다양한 실험을 통하여 이루어졌으며 침구 치료의 진통기전에 대한 연구도 병행되고 있다25). 본 실험에 사용된 족삼리(ST36)는 족양명위경의 합토혈로서 조화기혈, 통조경락한다고 하였으며 각종 위장질환 및 전신 질환 외에도 각기. 하지신경통, 반신불수 등 하지통에 응용한다고 한다對
체중 230~250g 인 SD(Sprague Dawley) 종 웅성 쥐 (Samtaco Co. Ltd., Korea)를 선별하여 실험 전후에 동물의 상태를 점검하여 외상의 여부와 질병상태를 분석한 후 정상적인 실험동물을 선별하여 사용하였다. 모든 동물은 일정한 환경(20±2℃, 오전 7 시부터 시작해서 12시간 간격으로 명암을 유지)을 유지 시켰다.
데이터처리
실험 결과는 모두 Mean+/-S.D (Standard deviation)으로 표현하였으며, 통계처리는 one-way ANOVA 를 사용하였으며, probability values# 측정하기 위해 Tukey test 를 실시하였다. p-value가 최소 0.
성능/효과
있었다. (Fig. 3. 참조) 봉독 약침 자극 후의 통증 억제 효과를 평가한 결과를 보면 대조군에서 발현된 신경세포수는 189.75 ±9.0 개이고 일반주사기 사용한 봉독약침 자극 군 (BVB-N)의 경우는 106.44±2.41개이며 Biojector 2000® 를 사용한 봉독약침 자극군 (BVB-B)에서는 117.8±2.06으로 봉독약침 자극 군에서 유의적인 감소를 보이고 있다. (Fig.
formalin으로 통증을 유발시키기 30분전에 봉독 약침 액으로 약침 자극을 한 후 통증 행동을 관찰 한 결과 대조군에 비해서 일반 약침 자극군과 Biojector2000®을 사용한 약침자극 군 모두 통증 행동이 발현되는 paw licking time에서 유의한 감소를 보였다.
유의성 있는.감소를 보였고 일반 주사기를 이용한 봉독 약침 자극군에 비해 무침주사기틀 이용한 봉독 약침 자극 군에서 통증 억제 효과가 다소 높게 나타났다.
광학 현미경 (Carl Zeiss, Germany, 50X)을 사용하여 척수의 L3~L4 사이의 superficial dorsal horn layers (SDH, lamina I z II) 에 발현된 C-fos의 수를 세어 분석한 결과 대조군에서의 발현 정도 보다 bee vonom 처치 군에의 발현 정도가 감소 된 것을 볼 수 있었다. (Fig.
둘째, 척수의 L3~L4 사이의 superficial dorsal horn layers (SDH, laminae I, H) 에 발현된 c-fos 발현 신경세포의 수적 변화는 대조군에 비해 일반 주사기 사용 봉독약침군과 Biojector2000 ®를 사용한 봉독 약침 자극군에서 유의성 있게 감소하였다.
또한 c-fos 신경세포의 발현에 관한 분석결과 역시 무처치군인 대조군에 비해 일반 주사기와 무침주사기를 이용한 봉독 약침 처치군 모두에서 유의성 있는 억제 효과를 보여 봉독약침이 진통 효과가 있음을 알 수 있었다.
발바닥에 formalin 을 주입 후 나타나는 행동을 60분 동안 관찰하였을 때 form이in-induced paw licking time의 변화는 대조군과 봉독약침 자극군 모두 비슷한 경향을 보였는데 주입 직후부터 5분 동안에는 활발한 행동을 나타내다가(89.81±8.88 sec) 주입 후 5 분에서 10 분 사이에서는 formaiin-induced pain behavior를 거의 나타내지 않거나 매우 낮은 수준으로 관찰 되었다. (3.
본 실험에서는 formalin-induced pain 모델에서 일반 주사기를 이용한 봉독 약침 자극과 무침주사기를 이용한 봉독 약침 자극에 따른 진통 효과를 평가한 결과 pain behavior인 paw licking time의 분석에서 무처치군에 비해 봉독 약침 자극 군 모두가 유의성 있는.감소를 보였고 일반 주사기를 이용한 봉독 약침 자극군에 비해 무침주사기틀 이용한 봉독 약침 자극 군에서 통증 억제 효과가 다소 높게 나타났다.
봉독 약침 주입기에 따른 통증 억제 효과는 일반 주사기 자극 군과 무침성 주사기 자극군 사이에는 큰 차이를 보이지 않았다.
첫째, 족삼리(ST36) 봉독 약침 자극군에서 대조군에 비하 여유 의성 있는 통증 억제 효과를 보였으며 억제 효과는 early phase 보다 late phase에서 강한 통증 억제 효과가 나타났다,
통증행동 양상이 억제되는 결과가 formalin 주입 직후부터 10 분간 나타나는 초기 반응기(early phase)보다는 10분 이후부터 40분 사이에 나타나는 후기 반응기 (late phase) 에서 강하게 관찰 되었다.
후속연구
이로써 봉독 약침 자극 시에 주사기에 대한 통증 유발과 그에 따른 공포감에 의한 약한 순응도의 단점을 개선하여 무침성약침 요법에 활용할 수 있으며 앞으로 무침성 약침 요법에 필요한 무침성 주사기의 개발에 기초가 되어 무침성 주사기의 활용에 많은 기여가 될 것이라고 사료 된다.
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