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문제 정의
- IB). 이 결과로부터 사용한 한약재 중에서 NF-kB의 활성화를 가장 강력하게 억제하는 것으로 나타난 상산(常山, Dichroa feb剛®을 대상으로 NF-kB의 활성억제 작용과 IKKx와의 연관성을 연구하였다.
제안 방법
- 1B에서 상산(常山)을 80顷/戒의 농도로 투여했을 때 NIK에 의한 NF-kB의 활성화가 현저하게 억제됨을 알 수 있었다 이러한 억제 작용이 상산(常山)의 세포독성에 의한 세포증식억제로 인해 나타났을 가능성이 있으므로 상산(常山)이 cos 세포의 증식에 미치는 영향을 검토하였다. 상산(常山)의 물추출물을 400陽/m幻 800您/m。1, 200俸/畝의 농도로 cos 세포에 투여한 후 24시간 및 48시간 동안 배양한 뒤 세포의 수를 산정하였다. Fig.
- 배양하였다. DNA를 도입하기 위한 transfectione fugene 6 (Roche Molecular Biochemicals)를 사용하였으며 fugene 6와 혈청을 함유하지 않은 DMEM의 혼합액에 도입할 DNA를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 subconfluent (약 70-80% confluent )상태의 세포에 투여하였다. 3 * *
- Fig. 1B에서 상산(常山)을 80顷/戒의 농도로 투여했을 때 NIK에 의한 NF-kB의 활성화가 현저하게 억제됨을 알 수 있었다 이러한 억제 작용이 상산(常山)의 세포독성에 의한 세포증식억제로 인해 나타났을 가능성이 있으므로 상산(常山)이 cos 세포의 증식에 미치는 영향을 검토하였다. 상산(常山)의 물추출물을 400陽/m幻 800您/m。1, 200俸/畝의 농도로 cos 세포에 투여한 후 24시간 및 48시간 동안 배양한 뒤 세포의 수를 산정하였다.
- NF-kB는 활성화되었을 때 핵 내로 이동하여 NF-kB의 결합 부위를 가진 DNA에 특이적으로 결합하며 결합부위 주변의 유전자 발현을 촉진하는 것으로 알려져 있다 본 연구에서는 이러한 NF-kB의 활성화를 관찰하기 위하여 herpes simplex vims의 thymidine kinase promoter에 NF-kB결합부위 4개를 결합시키고그 뒤에 reporter gene으로서 bacteria의 cat 유전자를 연결시킨 pNF-KB-CAT plasmid를 reporter plasmid로 이용하였다(Fig. 1A). 또한 NF-kB의 활성화 과정의 초기에 작용하는 NIK(NF-kB inducing kinase)의 발현plasmid(pcmv-NIK)를 pNF-KB-CAT plasmid와 함께 세포 내에 co-transfection하여 NF-kB의 활성화 상태를 만들었다.
- 한 약재가 NF-kB 활성화에 미치는 영향을 검토하기 위해 다섯 종류의 한약재를 선정하여 실험하였다(Table 1). cos 세포에 pNF-KB-CAT plasmid 와 NIK 발현 plasmid 를 co-transfection하여 24시간 동안 CO2 incubatoi에人■] 배양한 후 Table 1의 각 한약재를 800 飓/戒되게 투여하였다. 한약재가 투여된 세포는 20시간 동안 더 배양한 뒤 세포를 수거하여 CAT assay를 실시하였다.
- 각 한약재 100g을 분쇄한 후 증류수 500畝를 첨가하여 2시간 동안 가열하였다.가열한 시료는 3M 여과지에서 여과한 후 3, 000rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 수거하였으며 3M 여과지와 pore size 0.
- 다음은 IKKx의 over expression이 NF-kB의 활성화에 미치는 영향을 검토하기 위해 cos세포에 pNF-KB-CAT plasmid, NIK 발현 plasmid 및 IKKy의 wild type 또는 AC mutant의 발현 plasmid를 다양한 조합으로 co-transfection하여 CAT assay를 실시하였다. Fig.
- 1A). 또한 NF-kB의 활성화 과정의 초기에 작용하는 NIK(NF-kB inducing kinase)의 발현plasmid(pcmv-NIK)를 pNF-KB-CAT plasmid와 함께 세포 내에 co-transfection하여 NF-kB의 활성화 상태를 만들었다. 한 약재가 NF-kB 활성화에 미치는 영향을 검토하기 위해 다섯 종류의 한약재를 선정하여 실험하였다(Table 1).
- membranee I* KK에 대한 mouse의 monoclonal antibody와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시키고 TBS-T용액으로 3번 세척한 후 peroxidase-conjugated anti-mouse IgG 항체와 함께 다시 실온에서 1 시간 반응시켰다. 반응시킨 membrane을 TBS-T 용액으로 3회 세척한 후 enhanced chemiluminescence (ECL)로 발광 시켜 분석하였다.
- 시료 단백질을 10%의 polyacrylamide gel에서 전기영동한 후 Hybond ECL membrane (Amersham)에 electrotransfer(63Vz 10 시간)하고 membrane 을 5% 탈지 분유로 bio 에dng 하였다. membranee I* KK에 대한 mouse의 monoclonal antibody와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시키고 TBS-T용액으로 3번 세척한 후 peroxidase-conjugated anti-mouse IgG 항체와 함께 다시 실온에서 1 시간 반응시켰다.
- 지금까지 IKKx를 세포로부터 제거한 후발생되는 세포 내의 변화에 대해서는 많은 연구결과가 보고 되었으나 IKKx틀 over expression시켰을 때 나타나는 변화에 대한 보고는 거의 없는 상태이다. 그러므로 본 연구에서는 IKKy 의 over expression이 NF-kB의 활성화에 미치는 영향을 검토하기 위하여 wild type의 IKKx와 c-말단의 10。아미노산을 제거하여 leucine zipper motif 부분이 결손된 IKKy의 deletion mutant (AC)를 발현하는 plasmid를 제작하였다(Fig. 2A). 이 빌현 plasmid 들을 cos 세포에 transfection하여 IKKx의 expression을 관찰한 결과 IKKy 의 N-말단을 인식하는 항체를 이용한 Western blotting에서는 예상한 크기의 IKKx 단백질이 검출되었고(Fig.
- 3). 이러한 상산(常山)과 IKKx의 NF-kB 활성 억제 작용의 상호 연관성을 검토하기 위해 cos세포에 pNF-K B-CAT plasmid와 NIK 발현 plasmid 및 IKKy 발 현 plasmid를 co-transfection 하고 24시간 후에 상산(常山)을 80喚/【汹의 농도로 투여하여 20시간 더 배양한 뒤 CAT assay를 실시하였다. 그 결과 Fig.
- 반응생성물은 li戒의 ethylac바ate로써 추출한 다음 speed vacuum dryei■로써 농축시킨 후 TLC plate에 점적하고 chloroform : methanol (95:5)의 용매를 이용하여 전개시켰다. 전개한 TLC plate는 autoradiography# 하여 결과를 관찰하였으며 GS-700 Imaging Densitom어:er(Bio-Red) 를 이용하여 density 분석을 하였다
- cos 세포에 pNF-KB-CAT plasmid 와 NIK 발현 plasmid 를 co-transfection하여 24시간 동안 CO2 incubatoi에人■] 배양한 후 Table 1의 각 한약재를 800 飓/戒되게 투여하였다. 한약재가 투여된 세포는 20시간 동안 더 배양한 뒤 세포를 수거하여 CAT assay를 실시하였다. 그 결과 현삼, 상산, 질경은 NF-kB의 활성화를 강하게 억제하는 것으로 나타났으며 생지황과 우슬은 NF-k B의 활성화를 억제하지 않는 것으로 나타났다(Fig.
- 상산(常山)은 학질 치료작용이 있어 예로부터 학질치료 전문약으로 이용되었으며 민간에서는류마티스와 설사에 사용하기도 하고 물로 우려서 습성 습진에 바르기도 한 한약재이다噸5). 한편 iKKx는 NF-kB활성조절 과정의 중요한 인자로 작용하며 IKKx 자체가 조건에 따라서는 NF-kB의활성억제작용도 하므로 상산(常山)의 억제 작용과 IKKx와의 연관성을 검토함으로써 상산(常山)의 NF-kB활성억제 효과를 상승 시킬 수 있는 방안을 모색하였다
대상 데이터
- African green monkey kidney cell 에 SV40의 T항원이 항시 발현되고 있는 cos-7세포를 실험에 이용하였으며 세포의 배양은 FBS가 10% 함유된 DMEM을 배지로 사용하여 37℃, 5% C6의 incubator에서 배양하였다. DNA를 도입하기 위한 transfectione fugene 6 (Roche Molecular Biochemicals)를 사용하였으며 fugene 6와 혈청을 함유하지 않은 DMEM의 혼합액에 도입할 DNA를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 subconfluent (약 70-80% confluent )상태의 세포에 투여하였다.
- 45㈣의 membrane filter로 여과한 후 동결건조 하였다. 동결건조된 분말은 멸균된 증류수에 용해하여 실험에 사용하였다.
- 8) 200/必에 현탁한 다음 dry ice를 이용하여 6회의 freezing-thawing 으로 세포틀파쇄하였다. 세포 파쇄액은 4℃Z L500rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 수거하여 CAT assay틀 위한 세포 추출물로 이용하였다. CAT의 반응은 세포추출물을 Bradford 방법으로 단백질을 정량하여 동일한 단백 질양을 함유하는 각 세 포추출물에 [14C]-chloramphenicol (54mCi/mnio!) 6以 4mM acetyl CoA 60必 및 Tris-HCl(pH7.
- 또한 NF-kB의 활성화 과정의 초기에 작용하는 NIK(NF-kB inducing kinase)의 발현plasmid(pcmv-NIK)를 pNF-KB-CAT plasmid와 함께 세포 내에 co-transfection하여 NF-kB의 활성화 상태를 만들었다. 한 약재가 NF-kB 활성화에 미치는 영향을 검토하기 위해 다섯 종류의 한약재를 선정하여 실험하였다(Table 1). cos 세포에 pNF-KB-CAT plasmid 와 NIK 발현 plasmid 를 co-transfection하여 24시간 동안 CO2 incubatoi에人■] 배양한 후 Table 1의 각 한약재를 800 飓/戒되게 투여하였다.
성능/효과
- Fig. 3에서 나타난 바와 같이 NIK발현 plasmid의 첨가에 의해 NF-kB의 활성이 약 2배 증가하여 NF-kB의 활성화가 유도되었음을 알 수 있었고 이러한 NIK에 의한 NF-kB의 활성화는 wild type IKKy의 over expression에 의해 현저히 억제되는 것으로 나타났다. wild type IKKy의 발현 후의 NF-kB의 활성이 NIK에 의해 활성화되기 전보다 낮게 나타났으므로 wild type IKKx는 활성화되지 않은 basal lev이의 NF-kB활성도 억제하는 것을 알 수 있었다(Fig.
- 3에서 나타난 바와 같이 NIK발현 plasmid의 첨가에 의해 NF-kB의 활성이 약 2배 증가하여 NF-kB의 활성화가 유도되었음을 알 수 있었고 이러한 NIK에 의한 NF-kB의 활성화는 wild type IKKy의 over expression에 의해 현저히 억제되는 것으로 나타났다. wild type IKKy의 발현 후의 NF-kB의 활성이 NIK에 의해 활성화되기 전보다 낮게 나타났으므로 wild type IKKx는 활성화되지 않은 basal lev이의 NF-kB활성도 억제하는 것을 알 수 있었다(Fig. 3A, B). 그러나 이러한 IKKy의 N&cB활성억제 효과는 C-말단이 결손된 AC IKKy에서는 나타나지 않았다(Fig.
- 이러한 상산(常山)과 IKKx의 NF-kB 활성 억제 작용의 상호 연관성을 검토하기 위해 cos세포에 pNF-K B-CAT plasmid와 NIK 발현 plasmid 및 IKKy 발 현 plasmid를 co-transfection 하고 24시간 후에 상산(常山)을 80喚/【汹의 농도로 투여하여 20시간 더 배양한 뒤 CAT assay를 실시하였다. 그 결과 Fig. 5A, C에 나타난 바와 같이 NF-kB는 NIK의 발현에 의해 활성화되었으며 이러한 활성화는 wild type의 IKKy에 의해 활성화되기 전의 수준으로 억제되었고 IKKx의 AC mutant에서는 활성 억제작용이 나타나지 않았으므로 Fig. 3의 결과와 일치하였다. 또한 IKKy의 wild type과 AC mutant가 정상적으로 발현되었음이 Western blotting에 의해 확인되었다(Fig.
- 한약재가 투여된 세포는 20시간 동안 더 배양한 뒤 세포를 수거하여 CAT assay를 실시하였다. 그 결과 현삼, 상산, 질경은 NF-kB의 활성화를 강하게 억제하는 것으로 나타났으며 생지황과 우슬은 NF-k B의 활성화를 억제하지 않는 것으로 나타났다(Fig. IB). 이 결과로부터 사용한 한약재 중에서 NF-kB의 활성화를 가장 강력하게 억제하는 것으로 나타난 상산(常山, Dichroa feb剛®을 대상으로 NF-kB의 활성억제 작용과 IKKx와의 연관성을 연구하였다.
- 사용 가능함을 시사한다. 더구나 상산(常山)은 IKKx와 상관없이 NF-kB를 억제하므로 IKKy의 활성이 비정상적으로 낮거나 IKKx에 변이가 생겨 IKKy의 정상 기능이 약화된 세포에도 상산(常山)을 NF-kB의 저해제로 이용할 수 있음을 알 수 있었다.
- 또한 Fig. 5에서 상산(常山)은 NIK에 의해서 활성화되지 않은 basal level의 NF-kB의 활성도 억제하는 것으로 나타났다. 이는 NF-kB의 활성화 인자에 의해 자극을 받지 않은 세포에도 상산(常山)을 NF-kB의 활성억제제로 사용할 수 있음을 의미하며 상산(常山)은 NF-kB의 활성화 원인에 상관없이 광범위한 NF-kB 활성억제제로.
- 본 연구는 NF-kB의 reporter plasmid를 이용하여 NF-kB의활성을 억제하는 한약재를 탐색하였으며 그 결과 상산(常山, Dichroa febrifuga)O] 강력한 NF-kB활성억제 작용을 가짐을 알 수 있었다. 상산(常山)의 NF-kB 활성 억제 효과를 IKK complex의 구성성분인 IKKx의 작용과 관련 지어 연구한 결과 상산(常山)의 투여와 IKKx의 over expressione 모두 NF-kB의 활성을 억제하였고 그 작용은 서로 독립적인 경로를 통하여 일어날 가능성이 높으며, 상산(常山)은 IKKx를 경유하지 않고 NF-kB의 활성을 억제하는 것으로 나타났다.
- 상산(常山)을 800陽/戒로 처리하였을 때 NIK에 의한 NF-kB 의 활성화가 현저하게 억제되었으며 (Fig. IB), wild type의 IKKy 를 over expression 시켰을 때도 NF-kB의 활성화가 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 3). 이러한 상산(常山)과 IKKx의 NF-kB 활성 억제 작용의 상호 연관성을 검토하기 위해 cos세포에 pNF-K B-CAT plasmid와 NIK 발현 plasmid 및 IKKy 발 현 plasmid를 co-transfection 하고 24시간 후에 상산(常山)을 80喚/【汹의 농도로 투여하여 20시간 더 배양한 뒤 CAT assay를 실시하였다.
- 있었다. 상산(常山)의 NF-kB 활성 억제 효과를 IKK complex의 구성성분인 IKKx의 작용과 관련 지어 연구한 결과 상산(常山)의 투여와 IKKx의 over expressione 모두 NF-kB의 활성을 억제하였고 그 작용은 서로 독립적인 경로를 통하여 일어날 가능성이 높으며, 상산(常山)은 IKKx를 경유하지 않고 NF-kB의 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 이는 상산(常山)이 NF-kB 활성화의 원인과 상관없이 광범위한 NF-kB의 활성 억제제로 사용될 수 있음을 의미하며 wild type IKKy의 over expression도 NF-kB의 활성을 억제하였으므로 IKKx의 활성이 높은 세포에 상산(常山)을 투여하면 NF-kB의 활성억제효과가 더욱 상승되며, IKKY의 활성이 낮거나 유전자 변이로 인해 IKKy의 기능이 손실된 세포에서도 상산(常山)은 NF-kB의 활성을 억제할 수 있으므로 상산 (常山) 은광범위한 세포에서 NF-kB의 활성 억제제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
- 상산(常山)의 NF-kB 활성 억제 효과를 IKK complex의 구성성분인 IKKx의 작용과 관련 지어 연구한 결과 상산(常山)의 투여와 IKKx의 over expressione 모두 NF-kB의 활성을 억제하였고 그 작용은 서로 독립적인 경로를 통하여 일어날 가능성이 높으며, 상산(常山)은 IKKx를 경유하지 않고 NF-kB의 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 이는 상산(常山)이 NF-kB 활성화의 원인과 상관없이 광범위한 NF-kB의 활성 억제제로 사용될 수 있음을 의미하며 wild type IKKy의 over expression도 NF-kB의 활성을 억제하였으므로 IKKx의 활성이 높은 세포에 상산(常山)을 투여하면 NF-kB의 활성억제효과가 더욱 상승되며, IKKY의 활성이 낮거나 유전자 변이로 인해 IKKy의 기능이 손실된 세포에서도 상산(常山)은 NF-kB의 활성을 억제할 수 있으므로 상산 (常山) 은광범위한 세포에서 NF-kB의 활성 억제제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
- 5A, C). 특히 NF-kB의 활성억제효과가 없는 AC IKKy의 over expression 상태에서도 상산(常山)은 억제 효과를 나타내었으므로 상산(常山)의 NF-kB 활성억제효과가 IKKy의 영향을 받지 않으며, IKKy와 다른 경로를 통하여 NF-kB의 활성을 억제할 가능성을 나타내었다. IKKy는 IKK complex에서 NF-kB의 활성을 조절하는 역할을 하고 있으며 NF-kB의 활성화가 IKKx를 경유하여 일어나는 경우가 많은 것으로 알려져 있으나”") Fig.
- 5). 한편 상산(常山)어〕의한 NF-kB의 활성억제효과는 wild type 및 AC IKKy의 발현과 상관없이 억제 작용이 나타났다(Fig. 5A, C). 특히 NF-kB의 활성억제효과가 없는 AC IKKy의 over expression 상태에서도 상산(常山)은 억제 효과를 나타내었으므로 상산(常山)의 NF-kB 활성억제효과가 IKKy의 영향을 받지 않으며, IKKy와 다른 경로를 통하여 NF-kB의 활성을 억제할 가능성을 나타내었다.
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