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문제 정의
- 乾漆 추출물을 처리한 AGS 세포에서 p27Kipl 단백질을 증가가 CDK2 kinase activity를 감소시키는 지 알아보기 위한 실험에서, 乾漆 추출물은 시간 의존적으로 Histone Hl 에 association 되는 CDK2 kinase activity?]■ 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다(Fig. 8).
- 위암세포의 세포성장 억제와 apoptosis를 유발시키는 현상은 MTS assay와 FACS Study통하여 확인하였다. 乾漆의 세포주기 억제효과와 apoptosis 유발 작용의 기전을 탐색하기 위하여 세포주기와 관련된 유전자 및 apoptosis와 연관된 유전자를 SDS-PAGE 와 Western Blotting을 통하여 확인하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 乾漆의 위암세포에 대한 활성작용(mechanism)에 관한 연구를 수행하였다. AGS 위암 세포주에 80% 에탄올로 주출한 乾漆 을 처리하였을 때, 세포사멸과 세포주기억제 현상이 일어났다.
- 특히, 이러한 cyclin 이와 E는 CDK2와 CDK4/6 활성에 영향을 준다. 따라서 G1 cell cycle arrest 현상을 확인하기 위해서 CDKI 단백질들의 발현 양상을 확인하였다. 주로 DNA damageofl 의해 활성화되는 p53/p21 단백질과 anti-mitotic signal에 의해 활성화되는 p27Kipl, pl6INK4a 단백질의 발현을 확인하였다.
- 이는 세포사멸이 일어나는 시간과 거의 동시에 일어나는 것으로 보여진다. 따라서 乾漆 추출물을 다양한 시간대별로 처리하여 AGS 세포의 세포 주기가 어떻게 변화하는지 관찰하였다. 그 결과 乾漆 추출물을 처리하지 않은 세포에 비하여 점진적으로 G1 phase가 증가하였고, 반면에 S 과 G2/M phase는 급격하게 감소하였다(Fig.
- 또한 p27Kipl 단백질의 발현 및 활성을 억제하는 Skp2 단백질 발현이 감소됨을 확인하여 乾漆에 의한 세포주 기억제 현상에 p27Kipl 단백질이 핵심적인 역할을 한다는 것을 밝혔다. 따라서 향후 乾漆 추출물에서 새로운 위암치료제로 이용될 수 성분을 밝힐 수 있는 가능성을 제시하였다.
- 본 연구에서는 乾漆이 위암세포에서도 세포성장 억제와 apoptosis를 유발하는지를 살펴보고 그 기전을 밝혀 보고자 하였다. 위암 세포주는 Gastric Cancer Cell( AGS)를 이용하웃.
- Bcl-2 family protein 는 Bcl-2 와 Bcl-XL 같은 anti-apoptotic members와 Bax와 Bak 같은 pro-apoptotic members가 있다. 이 단백질들은 생사의 세포 운명을 결정하는데 checkpoints와 같은 역할을 한다逐, 乾漆 추출물에 의한 cell proliferation 감소와 sub-Gl fraction 증가가 apoptotic cell death를 유발하는지 확인하기 위한 실험을 진행하였다. Caspase-3와 같은 caspases는 세포 사멸 신호를 받았을 때, 세포 내에서 세포 사멸을 진행하는 가장 주요한 역할을 한다询따■라서 procaspase와 proteolytic processing 과정을 거친 cleaved caspase가 활성화되었는지 western blotting 실험을 통하여 확인하였다.
제안 방법
- 같이 측정하였다. 200ug의 단박질과 2ug CDK2 항체와 immunoprecipitation을 통하여 immune complex를 형성시킨 다음 protein A 또는 G beads와 반응시켰다. CDK2 와 cyclin E - associated Hl histone kinase는 inimune complex beads에 30成 의 kinase reaction [3 觇 (3 ug) of histone Hl, 0.
- 이 단백질들은 생사의 세포 운명을 결정하는데 checkpoints와 같은 역할을 한다逐, 乾漆 추출물에 의한 cell proliferation 감소와 sub-Gl fraction 증가가 apoptotic cell death를 유발하는지 확인하기 위한 실험을 진행하였다. Caspase-3와 같은 caspases는 세포 사멸 신호를 받았을 때, 세포 내에서 세포 사멸을 진행하는 가장 주요한 역할을 한다询따■라서 procaspase와 proteolytic processing 과정을 거친 cleaved caspase가 활성화되었는지 western blotting 실험을 통하여 확인하였다. 乾漆 추출물을 50ug/ml로 처리하고 시간대별로 (24, 48, 72 시간)로 sample을 획득하여 SDS-PAGE 후 Western blotting을 수행한 결과, procaspase-3의 cleavage와 caspase-3 activationO] 일어나며 caspase-3의 기질인 p이y ( ADP - ribose ) polymerase (PARP)가 degradation되었다.
- Flow cytometric cell sorter로 DNA contents를 확인하여 세포 주기를 분석하였다. 그 결과 乾漆 추출물을 처리한 세포에서는 처리하지 않은 세포에 비해서 G1 시기에서 세포주기가 정지되어 있었다.
- p27Kipl 단백질의 발현 양이 전사 수준에서 조절되는 것인지를 확인하기 위하여 northern blotting 실험을 수행하여 mRNA 양을 측정하였다. 추출물을 처리하였을 때 p27Kipl 단백질의 mRNA 양이 변함이 없었다(Fig.
- p27Kipl 단백질의 발현 양이 전사 수준에서 조절되는 지 확인하기 위하여 northern blotting 실험을 수행하여 mRNA 양을 측정하였는데, p27Kipl 단백질의 mRNA 양은 변화가 없었다 (Fig.12). 이러한 결과를 볼 때, AGS세포에서 乾漆 추출물에 의한 p27Kipl 단백질의 발현 증가는 다양한 전사 후 과정에서 조절된다고 볼 수 있다.
- 乾漆 추출물에 의한 위암 세포주 AGS의 세포 성장 억제가세포독성 때문인지를 확인하기 위하여 Flow cytometric cell sorter로 DNA contents를 분석하였다. 乾漆 추출물을 50ug/ml 농도로 0, 48시간 동안 처리한 후 DNA contents를 분석한 결과, 0 시간(1.
- 乾漆은 총 200 g의 고운 가루 상태로 만들었다. 가루 상태인 건칠을 ultra-sonicator (Branson, USA.)를 이용하여 약 30분간 3번, 80% ethanol (Technical reagent 18LZ Duksan pharmaceutical Co. Ltd. Korea) (v/v)로추출하였다. 이 알코올 용액상태인 주출물을 60°C에서 농축시키고 동결건조를 하였다.
- 5X sample buffei를넣어 반응을 종결시키고, 12% SD9PAGE로 분리하였다. 겔을 건조시킨 다음, X-ray film으로 감광시켜 결과를 확인하였다.
- 5 X 106 cells )를 100 mm dishes에 분주한 다음 24시간 동안 안정화시켰다. 다양한 농도의 乾漆 추출물을 처리한 다음 24, 48, 72 시간 후에 detached 와 adherent cells 을 모두 모은 후, ice-cold PBS로 두 번 세척하였다 각 시간별로 모아진 cell pellet을 용해시켰다. RNA 정량은 spectrophotometer# 이용하여 260 nm (A260) 로 읽었다.
- 동안 안정화시켰다. 다양한 농도의 乾漆을 처리한 다음 0, 48 시간 후에 detached 와 adherent cells 을 모두 모아 3 ml of 95% ethanol (0.5% BSA 첨가)로 고정시켰다. 72시간까지 샘플이 모아질 때까지 샘플은 -20 °C 에 보관하였다.
- 5X106 cells ) 100 mm dishes에 깐 다음 24시간 동안 안정화시켰다. 다양한 농도의 乾漆을 처리한 다음 24, 48, 72 시간 후에 detached 와 adherent cells 을 모두 모은 후 ice-cold PBS 로 두 번 세척하였다. 각 시간별로 모아진 cell pellet을 lysis buffer를 이용하여 단백질만을 분리하였다.
- 즉 乾漆 추출물은 p27Kipl 단백질의 유도를 일으키고 CDK2 kinase 활성을 억제하여 Gl-cell cycle arrest를 일으키는 경로를 가진다고 볼 수 있다. 다음으로 Rb family 단백질의 phosphorylation 여부를 확인하였다. pRb, pl05z pl07과 같은 Rb family 단백질은 인산화를 통하여 G1 에서 S phase로 cell cycle이 이동하도록 해주는 역할을 한다 34-36).
- RNA 정량은 spectrophotometer# 이용하여 260 nm (A260) 로 읽었다. 동량의 RNA 를 1.2% agarose-6% formaldehyde g이에 loading하고 분리시킨 후, nylon membrane (S & S) 으로 RNA를 transfei하였다 그 후 radiolabeled p27Kipl cDNA fragment probes와 hybridization 시켰다.
- 3). 또한 세포 사멸 과정에서 두드러진 변화를 보이는 Bcl-2 family protein의 level 변화를 확인하였다. Bcl-2 와 Bcl-Xl와 같은 anti-apoptotic member■評는 시간 의존적으로 서서히 감소하였고 pro-apoptotic members인 Bax 발현은 시간 의존적으로 두드러지게 증가하였고 72시간에 최고를 나타내었다.
- 세포 생존율 측정 실험을 하기 위해서 AGS 세포(104 c으11/100 卩1)를 96-well tissue culture plate 에 분주한 다음 24시간 동안 안정화시켰다. 원하는 시간만큼 乾漆을 처리한 다음 3-(4 , 5-Dimethylthiazol 必-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfop heny 1)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS가 든 용액을 20 ul/100 ul 첨가하였다.
- AGS 위암 세포주에 80% 에탄올로 주출한 乾漆 을 처리하였을 때, 세포사멸과 세포주기억제 현상이 일어났다. 세포사멸 현상은 FACS study를 통한 sub-Gl population과 Western blotting 를 통한 apoptotic marker-PARP, caspase cascade activation을 통하여 확인하였다. 세포주기 억제현상은 FACS study를 통하여 세포주기가 Gl-cell cycle arrest를 확인하였고, p27Kipl 단백질이 세포주기조절 단계 중 G1 에서 S phase 로 넘어가는데 중요한 역할을 하는 cy시in E-CDK2 복합체 형성을 억제시켰다.
- 이러한 G1 cell cycle arrest 현상은 농도 의존적으로 더욱 잘 일어남을 확인하였다. 세포주기 억제 현상의 기전을 살펴보고자 세포 주기와 관련된 cyclins 단백질들의 발현을 비교하였다. 乾漆 추출물을 처리 하였을 때 S phase와 G2/M phase에 관련된 cyclin A, Bl 단백질 발현은 시간 의존적으로 모두 점진적으로 감소하였으며 G1 phase와 관련있는 cyclin D1 과 cyclin E 발현은 지속되었다(Fig.
- 세포사멸 현상은 FACS study를 통한 sub-Gl population과 Western blotting 를 통한 apoptotic marker-PARP, caspase cascade activation을 통하여 확인하였다. 세포주기 억제현상은 FACS study를 통하여 세포주기가 Gl-cell cycle arrest를 확인하였고, p27Kipl 단백질이 세포주기조절 단계 중 G1 에서 S phase 로 넘어가는데 중요한 역할을 하는 cy시in E-CDK2 복합체 형성을 억제시켰다. 또한 p27Kipl 단백질의 발현 및 활성을 억제하는 Skp2 단백질 발현이 감소됨을 확인하여 乾漆에 의한 세포주 기억제 현상에 p27Kipl 단백질이 핵심적인 역할을 한다는 것을 밝혔다.
- 실험에 사용한 억제제 (inhibitors) cycloheximide (CHX, 10ug/mlz Sigma), z-VAD-fmk (50 pM, Calbiochem)는 1 시간 전에 전 처리한 다음 乾漆 추출물을 처리하여 SDS-PAGE와 Western blot analysis를 수행하였다.
- 고 대조 세포로는 쥐의 장세포주 RIEl(Rat intestinal epithelial I)을 이용하였다. 위암세포의 세포성장 억제와 apoptosis를 유발시키는 현상은 MTS assay와 FACS Study통하여 확인하였다. 乾漆의 세포주기 억제효과와 apoptosis 유발 작용의 기전을 탐색하기 위하여 세포주기와 관련된 유전자 및 apoptosis와 연관된 유전자를 SDS-PAGE 와 Western Blotting을 통하여 확인하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
대상 데이터
- 乾漆(Rhus verniciflua Stokes)은 옴니허브 (Youncheon, Korea)를 통하여 구입하였다. 乾漆은 총 200 g의 고운 가루 상태로 만들었다.
- 통하여 구입하였다. 乾漆은 총 200 g의 고운 가루 상태로 만들었다. 가루 상태인 건칠을 ultra-sonicator (Branson, USA.
- 위암 세포주는 Gastric Cancer Cell( AGS)를 이용하웃.고 대조 세포로는 쥐의 장세포주 RIEl(Rat intestinal epithelial I)을 이용하였다. 위암세포의 세포성장 억제와 apoptosis를 유발시키는 현상은 MTS assay와 FACS Study통하여 확인하였다.
- 인간 위암 세포주 AGS와 쥐의 장세포주 RIE1 는 미국 세포주 은행 (American Type Culture Collection)을 통하여 구입하였으며, AGS는 RPMI 1640 배지에 RIE1 는 DMEM (Gibco)배지에 10% (v/v) 혈청 (heat-inactivated fetal bovine serum (Gibco BRL)) 과 1% 항생제 (penicillin-streptomycin, (Gibco BRL))를 넣어 5% COz 가 든 37°C humidified incubatoi■에 키웠다. 각 실험에 사용된 세포는 80% 정도의 밀도로 준비하였다.
이론/모형
- AGS and RlE1 cells were treated with 10 〜 100 ug/ml the RVS extract for 72 hours. And cell viability was measured by the MTS assay. Data were shown as the mean of three independent experiments (error bars were shown in mean ± standard deviation (SD)).
성능/효과
- AGS 위암 세포주에 대하여 乾漆이 항암 활성을 가지는지에 초점을 맞추는 실험으로 MTS assay를 농도별로 72시간 동안 AGS 세포주에 처리하였을 때, 농도 의존적으로 cell proliferation 이 감소하였다 (Fig. 1). IC 50 농도는 약 50 ug/ml으로 나타났다.
- 또한 세포 사멸 과정에서 두드러진 변화를 보이는 Bcl-2 family protein의 level 변화를 확인하였다. Bcl-2 와 Bcl-Xl와 같은 anti-apoptotic member■評는 시간 의존적으로 서서히 감소하였고 pro-apoptotic members인 Bax 발현은 시간 의존적으로 두드러지게 증가하였고 72시간에 최고를 나타내었다. 이러한 결과는 乾漆 추출물은 위암세포주 AGS에서 세포독성을 나타내며 이러한 세포독성은 세포사멸에서 유발된다고 볼 수 있다.
- 특히 72시간째는 Histone Hl과 CDK2 kinase 사이에 association이 거의 일어나지 않았다. CDK 2 kinase 단백질에서는 변화가 거의 없었지만, kinase 활성은 乾漆 추출물 처리 후 현저하게 감소하였음을 알 수 있었다. 또한 CDK2 항체와 immunoprecipitated된 complexes와 결합하는 p27Kipl 단백 질의양도 72시간 째 현저하게 증가하였다 (Fig.
- Caspase inhibits■인 z-VAD-fmk 틀 1시간 전 처리한 후 乾 漆 추출물을 처리하였을 때 PARP degradation, caspase-3 activation이 억제되었다(Fig. 4).
- DNA contents를 확인하여 세포 주기를 분석한 결과, 乾漆 추출물을 처리하지 않은 세포에 비하여 처리한 세포에서는 점진적으로 G1 phase가 증가하였고 S 과 G2/M phase는 급격하게 감소하였다(Fig. 5). 이러한 G1 c은11 cycle arrest 현상은 농도 의존적으로 나타났다.
- G1 cell cycle arrest 현상을 확인하기 위해서 CDKI (CDK inhibitors) 단백질의 발현 양상을 확인한 결과, p53 단백질은 발현 변화가 적지만 감소하고. 그 기질인 p21Cip/WAF 단백질은 乾漆 추출물을 처리한 후 48시간부터 발현이 급격하게 감소되었으며 72시간에서는 거의 발현되지 않았다.
- MTS assay를 수행한 결과 乾漆 추출물은 농도 의존적으로 세포증식을 감소시켰으며, IC 50 농도는 50 ug/m이었다(Fig. 1). 대조군인 RIE1 세포에서는 세포증식 감소가 나타나지 않았다.
- Rb family 단백질의 phosphorylation 여부를 확인한 결과 CDK2 kinase의 활성이 억제되는 것과 일치하게 pRb와 pl07 단백질의 hyperphosphorylated form이 감소하였다(Fig. 9).
- p27 Kipl 단백질을 분해시키는 Skp2 단백질의 발현을 乾漆 추출물을 처리하였을 때 어떠한 변화를 보이는지 확인하였는데, p27Kipl 단백질 증가하는 때와 맞물려 현저하게 Skp2 단백질 발현 양이 감소함을 알 수 있었다(Fig. 10). 이러한 결과는 p27Kipl 단백질이 post - translational level 에서 발현이 조절됨을 알 수 있다.
- p27Kipl 단백질 발현에 영향을 미치는 요인을 찾기 위하여, 단백질 합성 억제제인 cycloheximide(CHX)을 전 처리한 경우와 乾漆 추출물만을 투여한 경우에서 CHX를 전 처리한 세포에서 p27Kipl 단백질 발현이 억제되었다(Fig. 11).
- 乾漆 不출물 50 ug/ml 농도로 위암 세포 AGS에 0, 48시간 동안 처리한 후, DNA contents를 분석한 결과 0 시간(1.19 %) 에비하여 24.12 %의 apoptotic sub-Gl fractionO] 나타났다. 대조군으로 설정한 RIE1 에서는 3.
- DNA contents를 분석하였다. 乾漆 추출물을 50ug/ml 농도로 0, 48시간 동안 처리한 후 DNA contents를 분석한 결과, 0 시간(1.19 %)에 비하여 24.12 %의 apoptotic sub-Gl fraction이나 타나 약 20배 이상으로 DNA에 damage를 입은 것을 확인하였다(Fig. 2). RIE1 에서는 3.
- 즉 pRb, 0105, pl07과 같은 뀨 family 단백질의 hypophosphorylated lev이을 증가시키는 것은 E2F 전사인자의 활성을 억제하여 세포증식과 관련된 단백질로 cyclin A, cdc2, c-Myc, PCNA의 발현을 억제할 가능성이 있다皿찌. 乾漆 추출물을 AGS 세포에 처리하였을 때, p27Kipl 단백질은 현저하게 증가하는 양상을 보였다. 일반적으로 단백질의 발현은 다양한 수준 즉 전사, 번역, 번역 후 변형 과정, 인산화 등에서 조절된다.
- 세포주기 억제 현상의 기전을 살펴보고자 세포 주기와 관련된 cyclins 단백질들의 발현을 비교하였다. 乾漆 추출물을 처리 하였을 때 S phase와 G2/M phase에 관련된 cyclin A, Bl 단백질 발현은 시간 의존적으로 모두 점진적으로 감소하였으며 G1 phase와 관련있는 cyclin D1 과 cyclin E 발현은 지속되었다(Fig. 6). Cyclin D1 과 cyclin E의 지속적인 발현은 CIP/KIP 와 INK4 family와 같은 cyclin dependent kinase inhibitors (CDKI)가 세포 증식 억제에 관여하고 있다는 것을 암시한다.
- 乾漆 추출물을 처리하였을 때 S phase와 G2/M phase에 관련된 cyclin A, Bl 단백질 발현은 시간 의존적으로 모두 점진적으로 감소하였다. 반면 G1 phase와 관련 있는 cyciin D1 과 cyclin E 발현은 지속되었다(Fig.
- 결과적으로 upregulated p27Kipl level은 p27Kipl 분해기작의 억제와 새로운 단백질합성으로 인한 단백질 안정화에 의한 것으로 할 수 있다. 최근에는 p27Kipl 단백질을 prognostic 과 diagnostic marker로 사용할 수 있는지에 대한 실험이 진행되고 있다.
- 따라서 乾漆 추출물을 다양한 시간대별로 처리하여 AGS 세포의 세포 주기가 어떻게 변화하는지 관찰하였다. 그 결과 乾漆 추출물을 처리하지 않은 세포에 비하여 점진적으로 G1 phase가 증가하였고, 반면에 S 과 G2/M phase는 급격하게 감소하였다(Fig. 5). 이러한 G1 cell cycle arrest 현상은 농도 의존적으로 더욱 잘 일어남을 확인하였다.
- 주기를 분석하였다. 그 결과 乾漆 추출물을 처리한 세포에서는 처리하지 않은 세포에 비해서 G1 시기에서 세포주기가 정지되어 있었다. 이는 세포사멸이 일어나는 시간과 거의 동시에 일어나는 것으로 보여진다.
- 변화가 적지만 감소하고. 그 기질인 p21Cip/WAF 단백질은 乾漆 추출물을 처리한 후 48시간부터 발현이 급격하게 감소되었으며 72시간에서는 거의 발현되지 않았다. p27Kipl 단백질은 p21 단백질 발현과 반대로 48시간부터 증가하여 72시간에는 약 4배 정도 발현이 증가하였으며 pl6INK4a 단백질 발현도 증가하였다(Fig.
- 이러한 결과는 p27Kipl 단백질이 post - translational level 에서 발현이 조절됨을 알 수 있다. 그리고 p27Kipl 단백질 발현에 영향을 미치는 요인을 찾기 위하여, 단백질 합성 억제제인 cycloheximide을 전 처리한 다음 乾漆 추출물을 처리하였을 때와 추출물만을 처리하였을 때의 결과 (Fig. 11)를 보면, 억제제를 전 처리한 세포에서 p27Kipl 단백질 발현이 억제되었다. 따라서 이러한 결과틀 종합하여 보면 乾 漆 추출물에 의한 p27Kipl 단백질의 축적은 Skp2와 같은 단백질의 발현억제로 나타나며, 이외에도 p27Kipl에 의한 CDK2cyclin E complexes의 활성억제로 , 이복합체에 의한 P27Kipl 단백질의 인산화 억제가 발생하지 않아 p27Kipl 단백질의 세포내 축적 현상이 더욱 잘 일어날 것으로 추정된다39㈣.
- 11)를 보면, 억제제를 전 처리한 세포에서 p27Kipl 단백질 발현이 억제되었다. 따라서 이러한 결과틀 종합하여 보면 乾 漆 추출물에 의한 p27Kipl 단백질의 축적은 Skp2와 같은 단백질의 발현억제로 나타나며, 이외에도 p27Kipl에 의한 CDK2cyclin E complexes의 활성억제로 , 이복합체에 의한 P27Kipl 단백질의 인산화 억제가 발생하지 않아 p27Kipl 단백질의 세포내 축적 현상이 더욱 잘 일어날 것으로 추정된다39㈣. 또한 乾陸 추출물에 의해서 새로운 단백질 발현도 일어난다(Fig.
- 이러한 결과는 乾漆 추출물은 위암세포주 AGS에서 세포독성을 나타내며 이러한 세포독성은 세포사멸에서 유발된다고 볼 수 있다. 또한 AGS cellsofl caspase ii가血ibitoi인 z-VAD-fink 를 1시간 전 처리한 후 乾漆 추출물을 처리하였을 때 PARP degradation, caspase-3 activation이 현저히 억제되었다(Fig. 4), 이러한 결과는 乾漆 추출물에 의해 유도되는 세포사멸은 caspase activationO] 결정적으로 필요하다는 것을 알 수 있다. 따라서 乾漆 추출물은 AGS 위암 세포주에서 Bax, Bcl-2 와 Bcl-Xl 발현 변화와 미토콘드리아를 매개로 하는 caspase-9, -3 cascade activation을 통하여 세포사멸을 유도하는 것으로 생각된다.
- CDK 2 kinase 단백질에서는 변화가 거의 없었지만, kinase 활성은 乾漆 추출물 처리 후 현저하게 감소하였음을 알 수 있었다. 또한 CDK2 항체와 immunoprecipitated된 complexes와 결합하는 p27Kipl 단백 질의양도 72시간 째 현저하게 증가하였다 (Fig. 8). 즉 乾漆 추출물은 p27Kipl 단백질의 유도를 일으키고 CDK2 kinase 활성을 억제하여 Gl-cell cycle arrest를 일으키는 경로를 가진다고 볼 수 있다.
- 세포주기 억제현상은 FACS study를 통하여 세포주기가 Gl-cell cycle arrest를 확인하였고, p27Kipl 단백질이 세포주기조절 단계 중 G1 에서 S phase 로 넘어가는데 중요한 역할을 하는 cy시in E-CDK2 복합체 형성을 억제시켰다. 또한 p27Kipl 단백질의 발현 및 활성을 억제하는 Skp2 단백질 발현이 감소됨을 확인하여 乾漆에 의한 세포주 기억제 현상에 p27Kipl 단백질이 핵심적인 역할을 한다는 것을 밝혔다. 따라서 향후 乾漆 추출물에서 새로운 위암치료제로 이용될 수 성분을 밝힐 수 있는 가능성을 제시하였다.
- 이러한 현상은 cyclin E-CDK2 복합체 형성 억제오! p27Kipl 단백질의 발현 및 활성을 억제하는 Skp2 단백질 발현 감소를 통하여 확인하였다. 또한 乾漆에 의한 세포사멸은 세포사멸 과정에서 핵심적인 역할을 하는 caspase cascade activation을 통하여 이루어지며 caspase inhibitor틀 처리하였을 때 세포사멸이 억제되는 것을 통하여 확인하였다.
- IC 50 농도는 약 50 ug/ml으로 나타났다. 이러한 결과는 human T celi파 B lymphoma cell에서도 이와 유사한 결과가 보고E2)되었지만, 본 실험에서 정상 세포주인 RIE1 에서는 100 ug/ml을 처리하였을 때도 92 % 정도의 viability를 나타내며 cell growth inhibition이 거의 일어나지 않았다.
- 2 % 정도의 apoptotic sub-Gl fractionO] 나타났다. 이러한 결과는 乾漆 추출물은 AGS 위암 세포주에만 세포독성을 유발한다는 것을 암시한다.
- 이번 실험에서 AGS 위암 세포주에 80% 에탄올로 주출한 乾 漆 추출물은 p27Kipl 단백질의 유도에 의해 G1 cell cycle arrest 현상이 일어났다. 이러한 현상은 cyclin E-CDK2 복합체 형성 억제오! p27Kipl 단백질의 발현 및 활성을 억제하는 Skp2 단백질 발현 감소를 통하여 확인하였다.
후속연구
- 암 환자에서 한방치료는 항암작용을 목적으로 사용하기 보다는 扶 正祛邪에 중점을 두어 환자의 증후를 개선시키고 면역기능을 강화시키며 암의 전이를 차단하는 방향으로 접근되고 있다羽. 따라서 향후에는 부작용은 적으면서 항암작용을 나타내는 한약물을 검색하고 개발할 필요가 있다.
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