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문제 정의
- 스테비아추출물 발효액의 우수한 효과를 규명하기 위해서는 이들 미생물들에 대한 연구가 필수적이다. 본 연구에서는 스테비아추출물 발효액에 존재하는 유효 미생물들을 분리하여 동정하고 순수 배양된 유효 미생물들의 항미생물 활성을 측정하였다.
- 16S와 18S rDNA 염 기서열 분석에 근거하여 계통수를 작성하였다. 분리균들의 항미생물 활성을 여러 세균과 식물병원성 진균들에 대해 조사하였다. 분균들 중에서는 Lactobacillus paracasei SB13이 광범위한 세균들에 대해서 강한 항균활성을 나타내었다.
제안 방법
- 스테비아추출물 발효액에서 분리된 균주들은 5속 10종의 세균과 1종의 효모균에 속하는 것으로 나타났다. 16S와 18S rDNA 염 기서열 분석에 근거하여 계통수를 작성하였다. 분리균들의 항미생물 활성을 여러 세균과 식물병원성 진균들에 대해 조사하였다.
- Bacillus 속들의 배양을 위해서는 Nutrient broth (Difco, Detroit, USA)를, 젖산균류를 위해서는 MRS broth (Difco)를사용하였다. 효모균은 YPG (0.
- 클로닝된 rDNA의 염기서열eBascstation (MJRescarch, Watertown, USA) 장비를 사용하여 dideoxy chain termination 방법[22]으로 결정하였다. 결정된 rDNA 유전자 조각의 염기서열은 BLAST 프로그램[1] 을 이용하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 database에 있는 알려진 염기서열들과 비교하여 종 (species) 수준의 분류를 시행하였다. 순수 배양된 유효 미생물들의 분류학적 위치를 결정하기 위한 계통수 (phylogenetic tree)를 작성하기 위해서는 CLUSTAL W 프로그램(version 1.
- 0% 이ucose) 배지에서 배양하였다. 고체배지를 위해서는 각각의 배지에 1.5% (w/v) agar를 첨가하였다. 진균의 배양을 위해서는 Potato dextrose agar (Difco) 배지를 사용하였다.
- 2 ml씩 도말하였다. 배지를 말린 후 배지 위에 직경 6 mm의 구멍을 뚫고, 여기에 시료를 각각 50 μl 씩첨 가한 다음 4℃ 에서 2시간 방치 하여 확산 시 킨 후, 각 공시 균들의 성장에 적당한 온도에서 하룻밤 키워 형성된 억제환의 크기(mm)로 항균력을 측정하였다. 작물병원성 진균들의 균사 생장 억제력은 PDA 평판배지에서 자란 진균의 균사체와 포자를 멸균된 생리식염수를 이용해 회수하여 고체 배지에 도말하여 말린 후 위와 동일한 방법으로 분리균의 배양액을 접종하여 5~7일간 배양하면서 구멍주위의 균사생장 억제 정도를 관찰하였다.
- 1). 분리 된 효모의 18S rDNA 유전자 조각의 염 기서 열을 동일한 방법으로 분석하여 Pichia속에 속하는 효모들과의 계통발생학적 연관관계를 조사하였다(Fig. 2).
- 분리세균의 16S rDNA 조각은 박테리아 특이적인 27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 685r (5'-TCTACG CATTTCACCGCTAC-3')의 두 primer[3J를 이용하여 중합 효소 연쇄반응 (PCR)으로 증폭하였다. PCR 반응은 94℃에서 5 분간 DNA를 변성시킨 후:, 94E에서 1분간, 58C에서 1분간, 72℃에서 2분간의 단계를 35회 반복하여 실시하고 72℃에서 10분간 최종 증폭하였다.
- 선별하였다. 선별된 분리세균 23균주를 대상으로 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성을 조사하였다(Table 1). 그 결과 SB08을 제외하고는 모두 그람 양성균이었으며 주로 바실러스와 젖산균 계통의 세균이 많이 존재하는 것으로 나타났다.
- 순수 배양된 분리균들의 동정을 위한 형태적, 생화학적 특성들은 미생물학실험세4]에 기술되어있는 방법에 준하여 조사하였으며 얻어진 결과를 Bergey's manual of determinative bacteriology[9]에 기술되어있는 기존에 알려진 균주들의 특징과 비교하여 1차적인 동정을 실시하였다. 분리된 효모들의 1차적인 동정을 위해서는 API 20C AUX kit (BioMerieux, France)를 사용하였다.
- 순수 배양된 세균들로부터 염색체 DNA를 분리하기 위하여 액체배지에서 배양한 세포를 원심분리로 회수하였다. 회수된 세포로부터의 염색체 DNA는 G-Spin™ Genomic DNA Extraction Kit for Bacteria (iNtRON Biotechnology, Inc.
- 감미식물이다. 스테 비아추출물 발효액으로부터 세균 23균주와 효모 10균주를 분리하여 일반적인 분류학적 방법과 분자유전학적 방법으로 동정하였다. 스테비아추출물 발효액에서 분리된 균주들은 5속 10종의 세균과 1종의 효모균에 속하는 것으로 나타났다.
- 스테비 아추출물 발효액을 멸균된 생리 식 염수로 희 석하여 Nutrient agar, MRS, YPG 평판배지 위에 각각 도말한 후 배양기에 넣어 3CTC의 온도에서 이틀간 배양하였다. 얻어진 콜로니들의 모양 및 색깔, 크기를 기준으로 한 육안판정으로 균주들을 선발하여 여러 번 고체배지에 계대 배양하여 순수배양된 균주들을 얻었다.
- 스테비아추출물 발효액에서 분리된 균주들의 콜로니 형태를 바탕으로 한 육안 판정으로 세균 23균주와 효모 10균주를 1차 선별하였다. 선별된 분리세균 23균주를 대상으로 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성을 조사하였다(Table 1).
- 스테비아추출물 발효액에서 분리된 세균들 중에서는 Lactobacillus paracasein)- 우점종인 것으로 나타났다. 스테비아추출물 발효액으로부터 순수 배양된 10종의 분리 균들의 계통발생학적 연관관계를 측정하기 위해 16S rDNA 유전자 조각의 염기서열을 결정하여 알려진 서열들과 CLUSTAL W 프로그램을 이용하여 비교하였고 그 결과를 계통수로 나타내 었다(Fig. 1). 분리 된 효모의 18S rDNA 유전자 조각의 염 기서 열을 동일한 방법으로 분석하여 Pichia속에 속하는 효모들과의 계통발생학적 연관관계를 조사하였다(Fig.
- 넣어 3CTC의 온도에서 이틀간 배양하였다. 얻어진 콜로니들의 모양 및 색깔, 크기를 기준으로 한 육안판정으로 균주들을 선발하여 여러 번 고체배지에 계대 배양하여 순수배양된 균주들을 얻었다. 순수 배양된 균주들은 15%의 glyc- erol이 첨가된 액체배지에 넣어 -70℃에서 보관하였다.
- 배지를 말린 후 배지 위에 직경 6 mm의 구멍을 뚫고, 여기에 시료를 각각 50 μl 씩첨 가한 다음 4℃ 에서 2시간 방치 하여 확산 시 킨 후, 각 공시 균들의 성장에 적당한 온도에서 하룻밤 키워 형성된 억제환의 크기(mm)로 항균력을 측정하였다. 작물병원성 진균들의 균사 생장 억제력은 PDA 평판배지에서 자란 진균의 균사체와 포자를 멸균된 생리식염수를 이용해 회수하여 고체 배지에 도말하여 말린 후 위와 동일한 방법으로 분리균의 배양액을 접종하여 5~7일간 배양하면서 구멍주위의 균사생장 억제 정도를 관찰하였다.
- 특히 진화적 상관관계를 알아내기 위해 PCR로 증폭된 rDNA 유전자의 염기서열을 분석하는 것은 미생물 분류의 중요한 도구가 되었다. 종 (species) 수준까지의 정확한 동정을 위하여 분리세균들은 16S rDNA의 염기서열을, 효모들은 18S rDNA의 염기서열을 결정하여 BLAST (version 2.2.14)프로그램을 이용하여 분석하였다. 그 결과 스테비아추출물발효액에서 분리된 세균 23균주에는 Bacilus속 6종,Lactobacillus, Micrococcus, Moraxella, Staphylococcuse- 각 1종씩 모두 5속 10종의 세균이 존재하는 것으로 확인되었다.
- 효모의 18S rDNA 조각의 증폭을 위해서는 NS1 (5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')과 NS2 (5'-GGCTGCTGGCACCAGACTTG3)의 두 primer[2이를 사용하였고 위와 동일한 조건으로 PCR증폭을 실시하였다. 증폭된 PCR산물들은 1.0% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.
- 증폭된 PCR산물들은 GENEALL™ PCR Purification Kit (generalbiosystem, Korea)를 사용하여 정제한 후 pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, USA)에 삽입시켜 E. coliDH5a에 형질전환하였다. 클로닝된 rDNA의 염기서열eBascstation (MJRescarch, Watertown, USA) 장비를 사용하여 dideoxy chain termination 방법[22]으로 결정하였다.
- PCR 반응은 94℃에서 5 분간 DNA를 변성시킨 후:, 94E에서 1분간, 58C에서 1분간, 72℃에서 2분간의 단계를 35회 반복하여 실시하고 72℃에서 10분간 최종 증폭하였다. 효모의 18S rDNA 조각의 증폭을 위해서는 NS1 (5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')과 NS2 (5'-GGCTGCTGGCACCAGACTTG3)의 두 primer[2이를 사용하였고 위와 동일한 조건으로 PCR증폭을 실시하였다. 증폭된 PCR산물들은 1.
대상 데이터
- 본 연구의 재료로는 (주)엽록 스테비아에서 제조된 스테비 아추출물 발효액을 사용하였다. Ribosomal DNA (rDNA)의 클로닝을 위한 숙주세포로는 Escherichia coll DH5a를 사용하 였고, 항균활성 측정을 위한 공시균들은 생명공학연구소 유 전자원 센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC) 와 서울대학교 미생물연구소 미생물균주센터 (Institute of Microbiology, Seoul National University, IMSNU)에서 분양 받아 본 실험실에서 보관하고 있던 균주들을 사용하였다. 항진균 실험에 사용한 작물병원성 진균은 농촌진흥청 농업 생명 공학연구원 한국농업 미 생물지 원센터 (Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양받아 사용하였다.
- 본 연구의 재료로는 (주)엽록 스테비아에서 제조된 스테비 아추출물 발효액을 사용하였다. Ribosomal DNA (rDNA)의 클로닝을 위한 숙주세포로는 Escherichia coll DH5a를 사용하 였고, 항균활성 측정을 위한 공시균들은 생명공학연구소 유 전자원 센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC) 와 서울대학교 미생물연구소 미생물균주센터 (Institute of Microbiology, Seoul National University, IMSNU)에서 분양 받아 본 실험실에서 보관하고 있던 균주들을 사용하였다.
- 5% (w/v) agar를 첨가하였다. 진균의 배양을 위해서는 Potato dextrose agar (Difco) 배지를 사용하였다.
- 사용하였다. 항미생물 실험을 위한 시료로는 스테비아추출물 발효액에서 분리된 균주들의 배양액을 원심분리로 세포들을 제거한 후 사용하였다. 바실러스속의 균주들과MomxelS속의 균주는 Nutrient broth에서, 젖산균류는 MRS broth에서, 효모는 YPG 배지에서 배양하였고, 모두 3 CTC에서 24시간 배양하였다.
- Ribosomal DNA (rDNA)의 클로닝을 위한 숙주세포로는 Escherichia coll DH5a를 사용하 였고, 항균활성 측정을 위한 공시균들은 생명공학연구소 유 전자원 센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC) 와 서울대학교 미생물연구소 미생물균주센터 (Institute of Microbiology, Seoul National University, IMSNU)에서 분양 받아 본 실험실에서 보관하고 있던 균주들을 사용하였다. 항진균 실험에 사용한 작물병원성 진균은 농촌진흥청 농업 생명 공학연구원 한국농업 미 생물지 원센터 (Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양받아 사용하였다.
- 효모균은 YPG (0.5% yeast extract, 1.0% peptone, 2.0% 이ucose) 배지에서 배양하였다. 고체배지를 위해서는 각각의 배지에 1.
이론/모형
- 결정된 rDNA 유전자 조각의 염기서열은 BLAST 프로그램[1] 을 이용하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 database에 있는 알려진 염기서열들과 비교하여 종 (species) 수준의 분류를 시행하였다. 순수 배양된 유효 미생물들의 분류학적 위치를 결정하기 위한 계통수 (phylogenetic tree)를 작성하기 위해서는 CLUSTAL W 프로그램(version 1.81)[5]과 neighbor-joining method[20]> 이용하였다.
- 스테비아추출물 발효액에서 분리된 세균들과 효모균의 항균 및 항진균 활성을 측정하기 위해서는 agar well diffusion 방법[2]을 사용하였다. 항미생물 실험을 위한 시료로는 스테비아추출물 발효액에서 분리된 균주들의 배양액을 원심분리로 세포들을 제거한 후 사용하였다.
- coliDH5a에 형질전환하였다. 클로닝된 rDNA의 염기서열eBascstation (MJRescarch, Watertown, USA) 장비를 사용하여 dideoxy chain termination 방법[22]으로 결정하였다. 결정된 rDNA 유전자 조각의 염기서열은 BLAST 프로그램[1] 을 이용하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 database에 있는 알려진 염기서열들과 비교하여 종 (species) 수준의 분류를 시행하였다.
- 액체배지에서 배양한 세포를 원심분리로 회수하였다. 회수된 세포로부터의 염색체 DNA는 G-Spin™ Genomic DNA Extraction Kit for Bacteria (iNtRON Biotechnology, Inc., Korea)를 사용하여 분리한 후 agarose gel 전기영동으로 확인하였디' 효모의 염색체 DNA는 Molecular CloningjZl] 에기술된 방법에 의해 분리하였다.
성능/효과
- Bacillus pimtilus로 동정된 SB21은 Listeria ivanovii에 항균 활성을 나타냈으며 SB21과 B. subtilis SB22 두 균주는 작물 병원성 진균인 Collectotricum coccodes와 Ophiostoma ulmi에 대한 항진균 활성을 나타내었다(Table 3). Bacilus속이 생산하는 항진균물질들은 종에 따라 다양한데 B.
- 선별된 분리세균 23균주를 대상으로 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성을 조사하였다(Table 1). 그 결과 SB08을 제외하고는 모두 그람 양성균이었으며 주로 바실러스와 젖산균 계통의 세균이 많이 존재하는 것으로 나타났다. 대부분이 간균이었고 SB05와 SB17만이 구균이었다.
- 스테비아추출물 발효액에서 분리 된 효모들은 API 20C AUX kit를 사용하여 1차 동정을 실시하였다. 그 결과 모두 거의 유사한 결과를 나타내었고 kit 에 포함된 동정표에 나타나있는 효모들과 일치하는 균주는없었다 (data not shown).
- 14)프로그램을 이용하여 분석하였다. 그 결과 스테비아추출물발효액에서 분리된 세균 23균주에는 Bacilus속 6종,Lactobacillus, Micrococcus, Moraxella, Staphylococcuse- 각 1종씩 모두 5속 10종의 세균이 존재하는 것으로 확인되었다. 분리된 효모 10균주는 모두 동일한 Pichia membranifaciens인 것으로 나타났다(Table 2).
- 분리균들의 항미생물 활성을 여러 세균과 식물병원성 진균들에 대해 조사하였다. 분균들 중에서는 Lactobacillus paracasei SB13이 광범위한 세균들에 대해서 강한 항균활성을 나타내었다. 이들 결과는 토양개량을 위한 친환경적 미생물 제제를 개발하는데 도움을 줄 것이다.
- coccodes에 대한 항진균 활성을 나타내 었다. 분리균들 중 B. fusiformis SB23, M. luteus SB05z S. pasteuri SB17은 길항작용을 나타내지 않았다.
- 그 결과 스테비아추출물발효액에서 분리된 세균 23균주에는 Bacilus속 6종,Lactobacillus, Micrococcus, Moraxella, Staphylococcuse- 각 1종씩 모두 5속 10종의 세균이 존재하는 것으로 확인되었다. 분리된 효모 10균주는 모두 동일한 Pichia membranifaciens인 것으로 나타났다(Table 2). 일반 분류학상으로 97% 이상의 rDNA 염기서열 상동성을 나타내는 균주들의 경우 하나의 종으로 정의할 수 있다.
- 스테 비아추출물 발효액으로부터 세균 23균주와 효모 10균주를 분리하여 일반적인 분류학적 방법과 분자유전학적 방법으로 동정하였다. 스테비아추출물 발효액에서 분리된 균주들은 5속 10종의 세균과 1종의 효모균에 속하는 것으로 나타났다. 16S와 18S rDNA 염 기서열 분석에 근거하여 계통수를 작성하였다.
- 스테비아추출물 발효액에서 분리된 세균들 중에서는 Lactobacillus paracasein)- 우점종인 것으로 나타났다. 스테비아추출물 발효액으로부터 순수 배양된 10종의 분리 균들의 계통발생학적 연관관계를 측정하기 위해 16S rDNA 유전자 조각의 염기서열을 결정하여 알려진 서열들과 CLUSTAL W 프로그램을 이용하여 비교하였고 그 결과를 계통수로 나타내 었다(Fig.
- membranifaciens CYC1106는 내염성 효모로 Botrytis 와 같은 작물병원성 진균에 대한 길항작용을 나타내는 killer toxin을 생산한다[17, 23]. 스테비아추출물 발효액에서 유일하게 분리된 효모인 P. membranifaciens SY05는 세균류에는 항균활성을 나타내지 않았고 작물병원성 진균들 중에서도 고추탄저병의 원인균인 C. coccotfe에만 항진균 활성을 나타내었다(Table 3).
- 스테비아추출물 발효액으로부터 분리되어 순수 배양된 유효 미생물 11종의 항균 및 항진균 활성을 측정한 결과 젖산균인 L. paracasei SB13이 가장 높은 항균 활성을 나타내었다. 이 균주는 8종의 그람양성균과 8종의 그람음성균에 대한 광범위한 항균 활성을 나타내었고 진균인 Rhizoctonia solani에 대해서도 항진균 활성을 나타내었다(Table 3).
- 스테비아추출물 발효액으로부터 분리된 유효 미생물들의 분석 결과 모두 98% 이상의 상동성을 나타내었다. 스테비아추출물 발효액에서 분리된 세균들 중에서는 Lactobacillus paracasein)- 우점종인 것으로 나타났다.
- paracasei SB13이 가장 높은 항균 활성을 나타내었다. 이 균주는 8종의 그람양성균과 8종의 그람음성균에 대한 광범위한 항균 활성을 나타내었고 진균인 Rhizoctonia solani에 대해서도 항진균 활성을 나타내었다(Table 3). 젖산균인 L.
후속연구
- 분균들 중에서는 Lactobacillus paracasei SB13이 광범위한 세균들에 대해서 강한 항균활성을 나타내었다. 이들 결과는 토양개량을 위한 친환경적 미생물 제제를 개발하는데 도움을 줄 것이다.
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