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문제 정의
- 또, 고량강의 MeOH 추출물을 통상적인 분획 방법에 따라 용매 분획을 실시하여 얻어진 용매분획들에 대하여 동일한 방법으로 혈관 평활근 이완 효과를 측정하여본 결과 EtOAc 분획이 가장 유의성 있는 활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다. 이 EtOAc 분획을 silica gel chromato-graphy를 반복하여 정제한 결과 최종적으로 혈관 평활근 이완 효과를 나타내는 3종의 활성 성분을 분리하였으며, 본 보에서는 이들 활성 성분의 화학구조 및 각 화합물들의 혈관 평활근 이완 효과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 냉침시켰다. 추출액을 감압 농축하여 MeOH extract 980 g을 얻었으며 이를 I&O에 현탁 시킨 후 dichloromethane (DM)과" ethylacetate (EtOAc) 및 w-butanol (BuOH)로 단계적으로 용매분획하여 DM 분획 567 g, EtOAc 분획 62 g 및 BuOH 분획 116 g을얻었다.
- 2 g의 초기장력으로 1시간동안 equilibration 시켰으며, 15분 간격으로 K-H bu/r를 교환하여 주었다. Isometric tension은 force displacement transducer (Grass FT03, Grass사, 미국) 를 통해 chart recorder (Multicorder MC 6625, HugoSachs사, 독일)로 기록하였다. 적출 혈관을 tissue 아lambei내에서 적응시키기 위하여, phenylephrine (0.
- 0 μM)을 가하여 혈관이 완전히 이완됨을 확인하였다. K-H buI로 45분에 걸쳐 3번 세척시켜준 후, 다시 phenylephrine으로 수축 시켜 platea니에 도달하게 한 후, 시험물질을 농도별로 가하고 혈관의 이완 정도를 측정하였다⑴ 혈관 이완율은 phenylephrine 전처리로 수축된혈관에 부하되는 장력 (tension)을 기준으로 하여 이완시 감소하는 혈관 장력 비율을 % 나타냈으며, linear regression^ 통해 IC50 수치 (50% 이완시키는 농도)를 구하였다.
- 급(EP) 시약을 시용하였으며, 융점은 Haakebuchler 미량융점 측정기를 이용하여 측정하였으며 측정치는 따로, 보정하지 아니하였다. Low resolution MS (70 eV)는 JEOL사의 JMS-DX 303 mass spectrometer, proton 및 carbon NMR spectra는 Brucker의 AM-300 및 AMX-500을 이용하여 즉정 하였다. Column chromatography는 silica gel (70- 230 mesh, Merck)를 사용하였고, TLC는 Kiesel gel 60 F254 (0.
- 농도 의존적으로 이완시켰다. 고량강 MeOH 추출물을 활성 유도 분획법에 따라 silica gel chromatography로 정제한 결과 3종의 flavonoid 화합물 (1-3)을 활성성분으로 분리 정제하였다. 분리된 화합물들은 물리 화학적 성상과 기기 분석 ('H-NMR, 13C-NMR) 소견을 종합한 결과, galangin (1), kaempferide (2) 및 kaempferol (3) 로 각각 확인, 동정 되었으며 이들은 모두 phenylephrine으로 전처리로 유발한 흰쥐 적출 혈관의 수축을 농도 의존적으로 이완시켰으며 고량강의 MeOH 추출물이 보여준 혈관 평활근 이완 효과는 이들 flavonoid 화합물 (1-3)에 기인한 것으로 사료된다.
- 기기 및 시약 - 본 연구에 사용된 시약은 모두 특급(GR) 및 급(EP) 시약을 시용하였으며, 융점은 Haakebuchler 미량융점 측정기를 이용하여 측정하였으며 측정치는 따로, 보정하지 아니하였다. Low resolution MS (70 eV)는 JEOL사의 JMS-DX 303 mass spectrometer, proton 및 carbon NMR spectra는 Brucker의 AM-300 및 AMX-500을 이용하여 즉정 하였다.
- 5±1℃), 항습 (55±5%) 및 12시간 간격으로 명암이 자동 조절되는 청정 동물 사육실에서 최소한 2주 이상 안정화시킨 후 실험에 사용하였다. 흰쥐의 후두부를 강타하여 기절시킨 후 경동맥을 잘라 혈액을 유실시켰다. 흉곽을 절개한 다음 하 행성 대동맥을 신속하게 적출하고 내피가 손상되지 않도록 조심스럽게 지방조직 및 주위조직을 제거하였다.
대상 데이터
- USA)에서 구입하였으며 , Krebs-Henseleit (K-H) buffer 조제용 각종시 약들은 일본의 Junsei사로부터 구입하여 사용하얏넛다. Sprague- Dawley (S.D., 웅성) 계 횐쥐는 Orienl사 서울, 한국) 로부터구입하였으며, 항온 (22.5±1℃), 항습 (55±5%) 및 12시간 간격으로 명암이 자동 조절되는 청정 동물 사육실에서 최소한 2주 이상 안정화시킨 후 실험에 사용하였다. 흰쥐의 후두부를 강타하여 기절시킨 후 경동맥을 잘라 혈액을 유실시켰다.
- 5 mm, Merck)을 사용하였다. 발색 시약은 10% H2SO4-s- 사용하였으며 UV는 254 nm, 356nm에서 확인하였다.
- 실험재료 - 본 실험에 사용된 고량강은 2005년 3월 대전광역시 소재 한약재 시장에서 구입하여 실험에 사용하였으며 voucher specimen은 한국화학연구원에 보관되어 있다.
- 적출 혈관 이완 효과 - Acetylcholine chloride 및 phenyle phrine^- Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO. USA)에서 구입하였으며 , Krebs-Henseleit (K-H) buffer 조제용 각종시 약들은 일본의 Junsei사로부터 구입하여 사용하얏넛다. Sprague- Dawley (S.
성능/효과
- Phenylephrine으로 전처리한 흰쥐의 적출 혈관에 화합물 1- 3을 농도별로 처리한 결과 이들은 모두 농도 의존적으로 혈관 이완 효과를 보여주었으며 각 화합물들의 50% 혈관 이완 농도 (IC50) 값은 각각 1.6 |jg/m/ (28.1 mM) (1), 12.4 ptg/m/ (41.3 μM) (2) 및 14.5 pig/m/ (50.6 gM) (3) 로 산출되 었다. (Fig.
-
결과 및 고찰
고량강 (Alpinia officinarum)의 MeOH 추출물을 증류수에 현 탁시 킨 후 DM (dichloromethane), EtOAc (ethylacetate) 및 BuOH (n-butanol)로 단계적으로 용매 분획하고, 각 용매 분획을 시료로 하여 phenylephrine 전처리로 수축을 유발한 흰쥐의 적출혈관에 대하여 혈관 이완 효과를 측정하여 본 결과 EtOAc 가용분의 경우 50% 혈관 이완 농도 (IC50) 값이 15.6 μg/ml로 나타나 우수한 혈관 이완 효과를 보여준 반면 BuOH 가용분 및 수용성 분획은 혈관이완효과가 미미하게 나타났다 (Fig. 1). 따라서 EtOAc 가용분을 활성 유도 분획법에 따라 silica gel column chromatography를 반복 실시 한 결과 최종적으로 3종의 화합물 (L3) 을 혈관이완효과를 나타내는 활성성분으로 분리하였다.
- 3 μM) 으로 수축시킨 후, K-H buffer^ 45분에 걸쳐 3번 세척시켜 주었다. 다시 phenylephrine으로 혈관을 수축 시켜 plateau에 도달하게 한 다음, acetylcholine (1.0 μM)을 가하여 혈관이 완전히 이완됨을 확인하였다. K-H buI로 45분에 걸쳐 3번 세척시켜준 후, 다시 phenylephrine으로 수축 시켜 platea니에 도달하게 한 후, 시험물질을 농도별로 가하고 혈관의 이완 정도를 측정하였다⑴ 혈관 이완율은 phenylephrine 전처리로 수축된혈관에 부하되는 장력 (tension)을 기준으로 하여 이완시 감소하는 혈관 장력 비율을 % 나타냈으며, linear regression^ 통해 IC50 수치 (50% 이완시키는 농도)를 구하였다.
- 1). 따라서 EtOAc 가용분을 활성 유도 분획법에 따라 silica gel column chromatography를 반복 실시 한 결과 최종적으로 3종의 화합물 (L3) 을 혈관이완효과를 나타내는 활성성분으로 분리하였다. 이들 화합물 (1-3) 들은각각 물리화학적 성상 및 분광학적 자료를 분석한 결과galangin (1), 12-13) kaempferide (2), 14'15) kaempferol (3)16) 로각각 동정 되었다.
- 본 저자 등은 고량강을 비롯한 400여 종의 생약 추출물에 대하여 각각 흰쥐의 적출 혈관을 사용하여 혈관 평활근 이완 효과을 검색하여 본 결과, 고량강의 MeOH 추출물이 농도 의존적으로 양호한 혈관 평활근 이완 효과를 보여주고 있음을 알 수 있었다. 또, 고량강의 MeOH 추출물을 통상적인 분획 방법에 따라 용매 분획을 실시하여 얻어진 용매분획들에 대하여 동일한 방법으로 혈관 평활근 이완 효과를 측정하여본 결과 EtOAc 분획이 가장 유의성 있는 활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다. 이 EtOAc 분획을 silica gel chromato-graphy를 반복하여 정제한 결과 최종적으로 혈관 평활근 이완 효과를 나타내는 3종의 활성 성분을 분리하였으며, 본 보에서는 이들 활성 성분의 화학구조 및 각 화합물들의 혈관 평활근 이완 효과를 보고하고자 한다.
- 1) 주요 성분으로는 1, 8-cineol, methyl cinnamate, a-cadinene 등의 정유 성분이 잘 알려져 있으며, 신미성분으로 galangol, flavonoid 성분으로 galangin, kaempferide, alpinin 등을 함유하고 있다?)한편, 고량강의 약리 활성에 대한 연구로는 pancreatic lipase 의 억제 작용, » 지방산 합성 억제작용, 4) 항산화 효과, 5) 활성산소종 유도 세포독성과 DNA 손상에 대한 방어 효과, 6cyclooxgenase-2 (COX-2) 저해작용, " prostaglandin 생합성 저해 효과 8,9) 및 항염증 작용10) 등이 보고되어 있다. 본 저자 등은 고량강을 비롯한 400여 종의 생약 추출물에 대하여 각각 흰쥐의 적출 혈관을 사용하여 혈관 평활근 이완 효과을 검색하여 본 결과, 고량강의 MeOH 추출물이 농도 의존적으로 양호한 혈관 평활근 이완 효과를 보여주고 있음을 알 수 있었다. 또, 고량강의 MeOH 추출물을 통상적인 분획 방법에 따라 용매 분획을 실시하여 얻어진 용매분획들에 대하여 동일한 방법으로 혈관 평활근 이완 효과를 측정하여본 결과 EtOAc 분획이 가장 유의성 있는 활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다.
- 고량강 MeOH 추출물을 활성 유도 분획법에 따라 silica gel chromatography로 정제한 결과 3종의 flavonoid 화합물 (1-3)을 활성성분으로 분리 정제하였다. 분리된 화합물들은 물리 화학적 성상과 기기 분석 ('H-NMR, 13C-NMR) 소견을 종합한 결과, galangin (1), kaempferide (2) 및 kaempferol (3) 로 각각 확인, 동정 되었으며 이들은 모두 phenylephrine으로 전처리로 유발한 흰쥐 적출 혈관의 수축을 농도 의존적으로 이완시켰으며 고량강의 MeOH 추출물이 보여준 혈관 평활근 이완 효과는 이들 flavonoid 화합물 (1-3)에 기인한 것으로 사료된다.
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