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문제 정의
- 사료되는 두 가지 혼합물을 제조하였다. 본 연구에서는 예비연구에서 도출된 한약재로 제조한 혼합물인 NHDT-1과 NHDT-2의 알코올 분해능과 간세포 보호에 대해 심도있는 연구를 진행하였다. 사용된 약재는 헛개나무 열매를 중심으로 진피, 창출 및 감초를 첨가하였고, 이것을 추출하여 제조한 것이 NHDTT이고, NHDT-1에 홍삼을 첨가하여 추출한 것이 NHDT-2이다.
- 본 연구에서는 헛개나무열매를 주성분으로 제조한 두 종류의 혼합물들(NHDT-1과 NHDT-2)이 알코올 및 아세트알데히드의 분해를 촉진시켜 숙취의 발생을 저하시킬 수 있는지 여부와 만성적으로 알코올을 복용시켰을 때 간손상 및 지방간의 발생을 억제할 수 있는지 여부를 조사하였다. NHDT-1 은 헛개나무열매에 진피, 창출 및 감초를 첨가하여 제조하였고, NHDT-2는 NHWTT에 홍삼을 첨가하여 제조하였다.
제안 방법
- 조사하였다. NHDT-1 은 헛개나무열매에 진피, 창출 및 감초를 첨가하여 제조하였고, NHDT-2는 NHWTT에 홍삼을 첨가하여 제조하였다. NHDT-1과 NHDT-2의 조성 차이는 홍삼임에도 불구하고 백서에게 투여하였을 때 알코올 및 아세트알데히드의 분해와 간손상을 억제하는 작용에는 차이가 있었다.
- NHDT느은 헛개나무열매, 진피, 창출 그리고 감초를 Table 1에 제시한 중량으로 정확하게 측정한 뒤 가온 고압 한약 추출기에 물 1 L와 함께 첨가한 후 예열하여 100℃, 1~ 1.2기압이 되면, 2시간30분 동안 가압추출하였다. 그 다음 5~6시간 동안 식혀 온도가 실온이 되면 다시 예열하여 100℃, 1~ 1.
- 간기능 및 형태 변화: 30일동안 알코올과 NHDT-1, NHDT-2 그리고 여명을 투여한 후 간의 기능 및 손상 정도를 나타내는 혈청 AST, ALT 그리고 7 -GTP의 농도를 측정하였다. 알코올 섭취로 혈청 AST, ALT 그리고 7 -GTP 의 농도가 증가하였고, NHDT-2만이 혈청 AST, ALT 그리고 7-GTP 농도를 현저하게 감소시 켰다(Fig.
- 다른 일부의 간은 10% formalin으로 관류시키고 고정시킨 후, paraffin embeddin官을 실시하였다. 그 다음 paraffin 조각을 5 iim으로 section하여 hematoxylin-eosin으로 염색한 후 morphology를 확인하였다.
- MEYER)을 NHDTT 에 첨 가한 NHDT-2도 제조하였다. 그리고 NHDTT과 NHDT-2 처방이 알코올의 분해를 촉진시키고 아세트알데히드의 생성을 줄여 알코올로 인한 세포독성을 줄임으로써 궁극적으로 만성 알코올복용으로 나타나는 지방간으로부터 간을 보호할 수 있는지 여부를 실험동물 백서를 이용하여 조사하였다.
- 이 실험이 끝나자마자 실험동물을 ketamine으로 마취시키고 heart puncture로 혈액을 최대한 채취하였으며, 일부 간을 적출하여 액체질소로 얼려서 다음 실험에 사용할 때까지 -70℃에 보관하였다. 다른 일부의 간은 10% formalin으로 관류시키고 고정시킨 후, paraffin embeddin官을 실시하였다. 그 다음 paraffin 조각을 5 iim으로 section하여 hematoxylin-eosin으로 염색한 후 morphology를 확인하였다.
- 여명 808은 시중에서 숙취 제거 음료로 판매되고 있어서 양성 대조군으로 사용하였다. 또한 normal control군은 알코올을 투여하지 않고, 물과 고지방사료를 자유급식하였다.
- 알코올 투여 1시간, 3시간 5시간 경과시마다 꼬리에서 혈액을 채취하여 3, 000 xg에서 10분동안 원심분리한 후, 혈청 알코올 농도를 Quantichrom Ethanol 측정 kit(Roche, Hayward, CA)를 이용하여 비색정량으로 분석하였다. 또한 알코올 투여 1, 3, 5시간에 채취한 혈청을 kit에서 제공한 buffer와 동량으로 혼합한 후 아세트알데히드 농도를 아세트알데히드 F-kit(Roche, Hayward, CA)으로 비 색정 량하여 측정하였다.
- 매일 알코올과 함께 한약처방이나 물을 공급하고 10일째 되는 날 5시간 금식 후 두번째 급성 알코올 실험을 하였다. 실험 후 다시 식이, 물 또는 혼합물 그리고 알코올을 정해진 규칙대로 20일동안 추가로 공급하고, 알코올과 혼합물을 공급한 지 30일째 되는 날에 5시간 금식시킨 후 마지막으로 세 번째 급성 알코올 실험을 하였다.
- 모든 실험동물은 실험기간동안 고지방 식이 인 40 energy% 지방식이를 자유급식하였다. 여명 808은 시중에서 숙취 제거 음료로 판매되고 있어서 양성 대조군으로 사용하였다.
- 그리고 이러한 처방의 원료로 사용되지는 않았지만, 알코올의 분해를 촉진시켜 술을 물로 만든다는 이야기를 만든 헛개나무(Houe沅a dulcis Thunb) 열매도 알코올 분해 효과가 높은 것으로 알려져 있다(7). 본 연구에서는 숙취 및 지방간에 효과가 있다고 알려진 헛개나무열매에 진피 (Citrus unshiu MARKO VICI*】 과피), 창출 (Atractylodes japonica KOIDZUMI의 뿌리 줄기)과 감초(G7ycyr汁dza ur~ alensis FISXHER)를 혼합하여 숙취 및 간보호에 효과적 인 혼합물인 MWTT을 제조하였다. 또한 간보호에 효과가 있는 홍삼(Panax ginseng C.
- 본 연구자들은 헛개나무 열매를 중심으로 과거에 숙취 및 간 기능 향상에 사용하던 약재를 첨가하여 제조한 여러 처방들의 예비연구를 하여 숙취제거와 간세포 보호에 효과적 일 것으로 사료되는 두 가지 혼합물을 제조하였다. 본 연구에서는 예비연구에서 도출된 한약재로 제조한 혼합물인 NHDT-1과 NHDT-2의 알코올 분해능과 간세포 보호에 대해 심도있는 연구를 진행하였다.
- 실험동물을 체중에 따라 난괴법(Randomized complete block design)으로 한 군에 15마리 씩 4군으로 나누어 사육하였다. 사육실 온도는 20±2℃, 상대습도는 65±5%를 유지하고, 광주기와 암주기를 12시간이 되도록 빛을 조절하였다.
- 생화학적 조사: Heart puncture로 채취한 혈액으로부터 혈청 아세트알데히드 농도는 F-kit(Roche, Hayward, CA) 로측정하였고, 간 기능과 관련된 aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase(ALT), 그리고 gamma ( 7 )-glutamyl transferase(GTP)의 값도 각각에 해당하는 kit들(아산제약, 서울)을 이용하여 분석하였다. 한편, 지방간의 유발정도를 조사하기 위해서 간조직 에 저장된 중성 지방농도와 혈청 중성지방의 농도는 Cleantech TGs kit (아산제약, 서울)로 측정하였다.
- 식이에 의한 알코올 흡수와 분해의 차이를 없애기 위해서 백서는 5시간 금식 시키고, 각 군에 해당하는 처방이나 약물을 kg 체중 당 3 mL를 경구 투여하였다. 투여 1시간 후 체중 1 kg당 3 g 알코올(25%; 진로소주, 이천)을 경구투여하였다.
- 실험 설계: 급성실험을 한 후 백서는 군에 따라 정해진 한약 혼합물인 NHDT-1 이나 NHDT-2 또는 물을 공급하고, 매일 오후 3~4시 에 백서 kg 체중 당 3 g 알코올을 경구투여하였다. 이때 물대신 공급하는 한약혼합물이나 여명 808((주) 그래미, 철원)은 물과 동량으로(1:1) 희석하여 공급하고 자유롭게 섭취하도록 하였고, 매일 섭취량을 측정하였다.
- 하였다. 실험 후 다시 식이, 물 또는 혼합물 그리고 알코올을 정해진 규칙대로 20일동안 추가로 공급하고, 알코올과 혼합물을 공급한 지 30일째 되는 날에 5시간 금식시킨 후 마지막으로 세 번째 급성 알코올 실험을 하였다. 이 실험이 끝나자마자 실험동물을 ketamine으로 마취시키고 heart puncture로 혈액을 최대한 채취하였으며, 일부 간을 적출하여 액체질소로 얼려서 다음 실험에 사용할 때까지 -70℃에 보관하였다.
- 실험동물을 체중에 따라 난괴법(Randomized complete block design)으로 한 군에 15마리 씩 4군으로 나누어 사육하였다. 사육실 온도는 20±2℃, 상대습도는 65±5%를 유지하고, 광주기와 암주기를 12시간이 되도록 빛을 조절하였다.
- 투여 1시간 후 체중 1 kg당 3 g 알코올(25%; 진로소주, 이천)을 경구투여하였다. 알코올 투여 1시간, 3시간 5시간 경과시마다 꼬리에서 혈액을 채취하여 3, 000 xg에서 10분동안 원심분리한 후, 혈청 알코올 농도를 Quantichrom Ethanol 측정 kit(Roche, Hayward, CA)를 이용하여 비색정량으로 분석하였다. 또한 알코올 투여 1, 3, 5시간에 채취한 혈청을 kit에서 제공한 buffer와 동량으로 혼합한 후 아세트알데히드 농도를 아세트알데히드 F-kit(Roche, Hayward, CA)으로 비 색정 량하여 측정하였다.
- 6). 알코올의 과다섭취 시 나타나는 현상은 지방간으로 지방간의 유무를 조사하기 위해서 30일 동안 알코올과 NHDT-1, NHDT-2 그리고 여명 808을 간과 혈청 내 중성지방 함량을 측정하였다. 간에 함유된 중성지방 함량은 대조군에 비해 NHDT-1, NHDT-2 그리고 여명 &)8 모두 감소하였지만, 특히 NHDT-2 를 투여한 백서 에서 간에 지방축적량이 현저하게 감소하여 술을 섭 취하지 않은 normal control 백서와 유사하였다(Fig.
- 이때 물대신 공급하는 한약혼합물이나 여명 808((주) 그래미, 철원)은 물과 동량으로(1:1) 희석하여 공급하고 자유롭게 섭취하도록 하였고, 매일 섭취량을 측정하였다. 이것은 예비실험에서 백서의 물섭취량을 측정한 결과와 백서의 약물에 대한 대사율을 고려하여 NHDT-l, NHDT-2와 여명은 섭취량을 1일당 체중 당 성인 섭취의 약 6배정도를 섭취할 수 있도록 하기 위한 것이었다.
- 첫째날 급성 알코올 실험을 한 후 백서에게 매일 알코올을 체중 1 kg 당 3 g 급여함과 동시에 NHDT-1과 NHDT-2 그리고 여명 &)8 각각을 물에 1:1로 희석하여 공급한 후 10일째 되는 날 급성실험을 다시 하였다. 이때 혈청 알코올과 혈청 아세트알데히드 농도는 NHWT-1과 여명의 경우는 첫째 날 실시하였던 급성 알코올 실험의 경우보다 혈청 알코올과 아세트알데히드를 저하시키는 정도가 감소하였다(Fig.
- kg 체중 당 3 mL를 경구 투여하였다. 투여 1시간 후 체중 1 kg당 3 g 알코올(25%; 진로소주, 이천)을 경구투여하였다. 알코올 투여 1시간, 3시간 5시간 경과시마다 꼬리에서 혈액을 채취하여 3, 000 xg에서 10분동안 원심분리한 후, 혈청 알코올 농도를 Quantichrom Ethanol 측정 kit(Roche, Hayward, CA)를 이용하여 비색정량으로 분석하였다.
- 서울)을 이용하여 분석하였다. 한편, 지방간의 유발정도를 조사하기 위해서 간조직 에 저장된 중성 지방농도와 혈청 중성지방의 농도는 Cleantech TGs kit (아산제약, 서울)로 측정하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 숙취 및 지방간에 효과가 있다고 알려진 헛개나무열매에 진피 (Citrus unshiu MARKO VICI*】 과피), 창출 (Atractylodes japonica KOIDZUMI의 뿌리 줄기)과 감초(G7ycyr汁dza ur~ alensis FISXHER)를 혼합하여 숙취 및 간보호에 효과적 인 혼합물인 MWTT을 제조하였다. 또한 간보호에 효과가 있는 홍삼(Panax ginseng C. A. MEYER)을 NHDTT 에 첨 가한 NHDT-2도 제조하였다. 그리고 NHDTT과 NHDT-2 처방이 알코올의 분해를 촉진시키고 아세트알데히드의 생성을 줄여 알코올로 인한 세포독성을 줄임으로써 궁극적으로 만성 알코올복용으로 나타나는 지방간으로부터 간을 보호할 수 있는지 여부를 실험동물 백서를 이용하여 조사하였다.
- 본 실험에서 사용된 약재는 서울 경동시장에서 구입한 후한 국한의 학연 구원에서 엄격하게 감별하고 선정한 것을 사용하였고, 일련번호를 붙이고 한국한의학 연구원 표본실에 보관하고 있다.
- 본 연구를 위하여 6주령 수컷 Sprague Dawley rat(중앙동물, 한국)을 구입한 후 2주동안 새로운 실험환경에 적응시켰다. 실험동물을 체중에 따라 난괴법(Randomized complete block design)으로 한 군에 15마리 씩 4군으로 나누어 사육하였다.
- 본 연구에서는 예비연구에서 도출된 한약재로 제조한 혼합물인 NHDT-1과 NHDT-2의 알코올 분해능과 간세포 보호에 대해 심도있는 연구를 진행하였다. 사용된 약재는 헛개나무 열매를 중심으로 진피, 창출 및 감초를 첨가하였고, 이것을 추출하여 제조한 것이 NHDTT이고, NHDT-1에 홍삼을 첨가하여 추출한 것이 NHDT-2이다. 홍삼을 비롯한 인삼은 생맥산의 구성 성분으로 한의처방으로 오랫동안 이용되어왔고, 특히 인삼은 알코올로 유발되는 간세포의 사멸을 방지하는 효과가 있다는 것이 보고되었다(8, 9).
- 지방식이를 자유급식하였다. 여명 808은 시중에서 숙취 제거 음료로 판매되고 있어서 양성 대조군으로 사용하였다. 또한 normal control군은 알코올을 투여하지 않고, 물과 고지방사료를 자유급식하였다.
데이터처리
- NHDT-14 NHDT-2를 투여하였을 때 각 변수의 통계적 유의성은 one-way analysis of variance(ANOVA) 로 검증하였다. 각 군의 평균값 사이의 차이는 Tukey방법으로 multiple comparison을 수행하여 결정하였다.
- NHDT-14 NHDT-2를 투여하였을 때 각 변수의 통계적 유의성은 one-way analysis of variance(ANOVA) 로 검증하였다. 각 군의 평균값 사이의 차이는 Tukey방법으로 multiple comparison을 수행하여 결정하였다. 알코올을 투여하지 않은 normal control군과 알코올과 물을 복용한 알코올-control군 사이의 통계적 유의성은 two-sample t-test 로 검증하였다.
- 결과는 평균土표준편차(SD; standard deviation)로 표시하였다. NHDT-14 NHDT-2를 투여하였을 때 각 변수의 통계적 유의성은 one-way analysis of variance(ANOVA) 로 검증하였다.
- 각 군의 평균값 사이의 차이는 Tukey방법으로 multiple comparison을 수행하여 결정하였다. 알코올을 투여하지 않은 normal control군과 알코올과 물을 복용한 알코올-control군 사이의 통계적 유의성은 two-sample t-test 로 검증하였다. 모든 통계처리의 유의성 검증은 p<0.
성능/효과
- 1에서 볼 수 있듯이 알코올과 함께 공급한 NHDT-1 이 알코올 분해를 현저하게 촉진시켜 대조군에 비해 혈청 알코올 농도가 모든 분석시간대(1, 3, 5시간)에서 낮게 나타났다. NHDT-1 은 본 연구에서 양성 대조군으로 사용한 여명 808과 비슷한 형태를 보였으나 알코올 섭취 후 5시간에서는 여명 808보다 혈청 알코올농도를 더욱 낮추는 것으로 나타났다(Fig. 1). 또한 알코올 투여 후 혈중 알코올농도의 변화를 숫자로 나타내기 위해서 area under the curve값을 비교한 결과 NHDT-1 에서 가장 낮았다(Fig.
- NHDT-1 은 헛개나무열매에 진피, 창출 및 감초를 첨가하여 제조하였고, NHDT-2는 NHWTT에 홍삼을 첨가하여 제조하였다. NHDT-1과 NHDT-2의 조성 차이는 홍삼임에도 불구하고 백서에게 투여하였을 때 알코올 및 아세트알데히드의 분해와 간손상을 억제하는 작용에는 차이가 있었다. 홍삼이 함유되어있지 않은 NHDT-1은 급성 알코올 실험에서 알코올 및 아세트알데히드 분해를 촉진시켜 혈청농도를 저하시켰으나, 홍삼이 함유된 NHDT-2는 혈청 알코올과 아세트알데히드 농도를 저하시키지 못했다.
- 간의 morphology를 살펴보았을 때 대조군에서 간에 지방 구의 양이 증가한 지방간의 초기증세를 나타내었으나, NHDT1, NHDT-2 그리고 여명을 섭취한 걸日서에서는 지방 구의 양이 감소하였다(Fig. 8). 간의 조직형태 (morphology) 분석결과에 따르면 알코올 비투여한 백서와 비교하였을 때, 알코올 투여한 백서에서도 세포형태는 정상적인 양상을 나타내 었으나 백혈구 침 투(sinusoidal leukocytosis) 증상이 증가한 것이 관찰되어 알코올 투여한 백서에서 간세포의 손상이 유발되었다는 것을 알 수 있었다.
- 8). 간의 조직형태 (morphology) 분석결과에 따르면 알코올 비투여한 백서와 비교하였을 때, 알코올 투여한 백서에서도 세포형태는 정상적인 양상을 나타내 었으나 백혈구 침 투(sinusoidal leukocytosis) 증상이 증가한 것이 관찰되어 알코올 투여한 백서에서 간세포의 손상이 유발되었다는 것을 알 수 있었다. 이러한 간손상은 NHDT-2를 투여한.
- 5). 결과적으로, 간헐적으로 알코올을 섭취하는 경우에는 NHDT-1 이 음주 후 혈청 알코올과 혈청 아세트알데히드 농도를 낮추는데 효과적이었고, 현재 숙취제거 음료로 판매되고 있는 여명 808보다 더 효과적이었다. 그러나 음주빈도가 잦은 경우에는 홍삼이 들어 있는 NHDT-2를 지속적으로 복용하는 것이 알코올 분해와 숙취를 제거하는데 더 효과적일 것으로 사료된다.
- 급성실험과는 반대로 장기간 알코올을 투여한 실험 에서는 NHDT-1은 NHDT-2 에 비해 알코올로 인한 간의 손상과 지방간 발생을 억제하지 못했다. 결론적으로 간기능이 좋은 상태에서 일시적으로 복용하는 경우에는 NHDT-1이 알코올과 아세트알데히드의분해를 촉진하여 숙취 해소에 효과적 이지만, 간이 좋지 않은 상태에서는 장기간동안 NHDT-2를 복용하여 간의 기능을향상시키는 것이 음주 후 숙취제거에 효과적일 것으로 사료된다.
- 그러나 만성 알코올 투여 시 홍삼이 함유되어 있지 않은 NHDT-1은 간세포의 손상을 효과적으로 방지하지 못해 간세포 손상의 지표로 사용되는 혈중 AST와 ALT의 농도가 높아졌고, 지방간의 소견도 보였다. 그러나 홍삼이 함유된 NHDT-2는 알코올로 유도된 간손상을 저하시 켰고, 또한 간에 중성지방의 축적과 혈청 중성지방의 농도를 저하시켰다.
- 1). 또한 알코올 투여 후 혈중 알코올농도의 변화를 숫자로 나타내기 위해서 area under the curve값을 비교한 결과 NHDT-1 에서 가장 낮았다(Fig. 2). 숙취의 원인이며 간세포 독성을 나타내는 원인으로 알려진 혈청 아세트알데히드의 농도는 음주 후 1, 3 그리고 5시간에 채취한 혈청을 동량 혼합하여 측정하였는데 혼합혈청 아세트알데히드의 농도도 혈중 알코올 농도와 마찬 가지로 첫째날에는 NHDT-1에서 가장 낮았다(Fig.
- 본 연구에서 사용한 헛개나무 열매는 민간요법으로는 숙취해소용으로 음용되고 있으나 이에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았다(12). 본 연구에서 사용한 헛개나무 열매를 기조로 제조한 NHDT-1은 알코올 투여 후 효과적으로 알코올 분해를 촉진하였고, 특히 알코올 농도가 5시간대에 가장 낮은 것으로 보아 알코올 흡수속도를 조절하는 것이 아니라 알코올의 분해속도를 높이는 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 첫째날의 알코올 급성실험에서는 Fig. 1에서 볼 수 있듯이 알코올과 함께 공급한 NHDT-1 이 알코올 분해를 현저하게 촉진시켜 대조군에 비해 혈청 알코올 농도가 모든 분석시간대(1, 3, 5시간)에서 낮게 나타났다. NHDT-1 은 본 연구에서 양성 대조군으로 사용한 여명 808과 비슷한 형태를 보였으나 알코올 섭취 후 5시간에서는 여명 808보다 혈청 알코올농도를 더욱 낮추는 것으로 나타났다(Fig.
- 알코올 섭취로 혈청 AST, ALT 그리고 7 -GTP 의 농도가 증가하였고, NHDT-2만이 혈청 AST, ALT 그리고 7-GTP 농도를 현저하게 감소시 켰다(Fig. 6). 알코올의 과다섭취 시 나타나는 현상은 지방간으로 지방간의 유무를 조사하기 위해서 30일 동안 알코올과 NHDT-1, NHDT-2 그리고 여명 808을 간과 혈청 내 중성지방 함량을 측정하였다.
- 체중, 식이섭취량 및 물섭취량: 알코올을 30일동안 섭취한 백서는 알코올 투여하지 않은 정상백서 에 비해 체중증가량과 열량섭취량은 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 또한 물 대신 NHDT-1, NHDT-2 또는 여명 808을 공급하였을 때 30일 후에 체중은 각 군 사이에 차이가 없었다(Table 2).
후속연구
- 숙취는 알코올 섭취 후 두통이나 속쓰림 등으로 나타나고, 이를 감소시킬 수 있는 약물을 찾는 연구들이 많이 수행되 었고(5, 6), 이미 많은 약 및 음료들이 판매되고 있지만 알코올 분해 및 숙취제거에 현저한 효과를 나타내는 것은 많지 않다. 또한 알코올 섭취 후 간 손상 및 지방간 발생을 억제하는 물질에 대한 연구가 수행되고는 있으나, 좀 더 많은 연구가 필요한 분야로 사료된다.
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