재래시장에서 시판되는 청국장을 이용하여 단백질 분해활성이 높은 Bacillus subtilis LSH805 균주를 분리 동정하였고, 이 균주를 이용하여 생산된 청국장의 혈전용해활성 및 대식세포주에 대한 NO 생산능 등을 비교하였다. 백태를 이용해 발효된 청국장의 경우 점액성 물질의 길이가 흑태를 이용한 것보다 1.5배 정도 길었으며 발효취가 낮은 청국장을 얻었다. 백태를 이용한 발효 청국장의 혈전분해활성은 배양 후 15시간이 경과한 시점에서 급격한 증가를 보였으며 20시간이 경과한 후에는 약 1,500mg의 분해된 혈전을 얻을 수 있었다. 청국장의 대식세포주의 NO 생산증진은 원료콩에 비해 큰 차이를 나타내지 않았지만 활성을 보이는 분획의 경향변화를 확인할 수 있었다. 본 연구결과로 식품섭취를 통해 혈전증 등을 사전에 예방하거나 개선할 수 있는 건강기능성 식품의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
재래시장에서 시판되는 청국장을 이용하여 단백질 분해활성이 높은 Bacillus subtilis LSH805 균주를 분리 동정하였고, 이 균주를 이용하여 생산된 청국장의 혈전용해활성 및 대식세포주에 대한 NO 생산능 등을 비교하였다. 백태를 이용해 발효된 청국장의 경우 점액성 물질의 길이가 흑태를 이용한 것보다 1.5배 정도 길었으며 발효취가 낮은 청국장을 얻었다. 백태를 이용한 발효 청국장의 혈전분해활성은 배양 후 15시간이 경과한 시점에서 급격한 증가를 보였으며 20시간이 경과한 후에는 약 1,500mg의 분해된 혈전을 얻을 수 있었다. 청국장의 대식세포주의 NO 생산증진은 원료콩에 비해 큰 차이를 나타내지 않았지만 활성을 보이는 분획의 경향변화를 확인할 수 있었다. 본 연구결과로 식품섭취를 통해 혈전증 등을 사전에 예방하거나 개선할 수 있는 건강기능성 식품의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
In this study, we have isolated and identified a proteolytic bacterium from conventional Cheongkukjang. We also characterized several bioactivity of Cheongkukjang, which was fermented by an isolated strain. One strain out of about $10^4$ strains obtained from Cheongkukjang showed relative...
In this study, we have isolated and identified a proteolytic bacterium from conventional Cheongkukjang. We also characterized several bioactivity of Cheongkukjang, which was fermented by an isolated strain. One strain out of about $10^4$ strains obtained from Cheongkukjang showed relatively high proteolytic activity was selected and named as a Bacillus subtilis LSH805 strain. White soy-bean Cheongkukjang possessed less odor and more viscous substance than black soy-bean Cheongkukjang. Cheongkukjang showed fibrinolytic activity, and about 1,500 mg fibrin was degraded after 20 h incubation. Although nitric oxide (NO) assays of soy-bean and Cheongkukjang were almost the same, their activities were significantly higher than that of no treatment. Activity of water fraction of Cheongkukjang was somewhat higher than that of soy-bean. Fibrinolytic and NO assays of Cheongkukjang suggest that Cheongkukjang, which was fermented by an isolated strain may be a useful candidate for natural fibrinolytic and macrophage-stimulating agents.
In this study, we have isolated and identified a proteolytic bacterium from conventional Cheongkukjang. We also characterized several bioactivity of Cheongkukjang, which was fermented by an isolated strain. One strain out of about $10^4$ strains obtained from Cheongkukjang showed relatively high proteolytic activity was selected and named as a Bacillus subtilis LSH805 strain. White soy-bean Cheongkukjang possessed less odor and more viscous substance than black soy-bean Cheongkukjang. Cheongkukjang showed fibrinolytic activity, and about 1,500 mg fibrin was degraded after 20 h incubation. Although nitric oxide (NO) assays of soy-bean and Cheongkukjang were almost the same, their activities were significantly higher than that of no treatment. Activity of water fraction of Cheongkukjang was somewhat higher than that of soy-bean. Fibrinolytic and NO assays of Cheongkukjang suggest that Cheongkukjang, which was fermented by an isolated strain may be a useful candidate for natural fibrinolytic and macrophage-stimulating agents.
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문제 정의
나눌 수 있다[18]. 이에 본 연구에서는 항혈전 효과가 우수한 균주를 분리하고 이를 이용한 발효청국장의 항혈전 및 대식세포주에 대한 NO 생성 효과를 보고한다.
제안 방법
4 와 같다. 원료콩 및 발효 후 건조시킨 청국장 분말에 10배량(w/v)의 80% ethanol로 약 60。<2에서 8시간 동안 추출을 행하였으며, 추출액은 Whatman NO.3 여과지 (Whatman International Ltd., Maidstone, England)로 2회 여과하여 이를 에탄올 추출시료로 하였다. 에탄올 추출시료를 다시 hexane, ethyl ether, butanol, methanol, HjO 등을 이용하여 Fig.
)을 포함하는 영양한천 (nutrient agar)배지에 도말하여 30。(3에서 24시간 배양하였다. Casein 분해에 의해 생기는 clear zone의 크기를 측정하여 단백질 분해활성이 '높은 후보 균주를 선택하였다. Casein 함유 배지로 분해활성이 있는 균주만을 분리하여 순수배양하였다.
37℃, 5% CO2에서 24시간 배양한 후 배양액 100川에 reaction diluent 400 μ1를 첨가하여 희석을 행하였다. Total NO assay는 Total NO/Nitrite/Nitrate Assay Kit(R&D systems, Minneapolis, MN, U.S.A.)를 이용하여 제조사의 manual을 토대로 행하였으며, Synergy HT Multi-detection microplate reader (Biotek Instruments, Inc.)를 이용하여 540 nm의 파장에서 O協을측정하였다.
단백질 분해활성이 가장 우수한 균주의 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열분석을 실시하였다. 분석된 염기서열은 Blast 를 사용하여 공시균주와 유사도를 검토하였으며 , 윈도우 버전의 Clustal 프로그램 (ClustalX ver.
01 mg/ml). 대조군은 추출 분획물들 대신 동량의 PBS(BioWhittaker)를 가하였다. 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양한 후 배양액 100川에 reaction diluent 400 μ1를 첨가하여 희석을 행하였다.
3에 나타냈다. 발효청국장의 혈전분해 활성을 fibrin plate 상에서 육안으로 관찰할 수 있었고(Fig. 3A), 이를 정량화하기 위하여 반응시간 2, 4, 6, 15, 20시간이 경과한 후에 분해된 fibrin의 무게를 측정하였다(Fig. 3B). 반응 시작 15시간이 경과된 후 혈전분해량이 눈에 띄게 증가하였으며 20시간 반응 후에는 약 1,500 mg의 분해된 혈전을 얻을 수 있었다.
)에 분주하고 24 시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 배양세포를 phosphate buffered saline(PBS, BioWhittaker)로 세정한 후 원료콩 및 청국장 추출분획물들을 PBS(BioWhittaker)에 희석하여 20 μ1씩 첨가하였다(최종농도: 0.5, 0.1, 0.01 mg/ml). 대조군은 추출 분획물들 대신 동량의 PBS(BioWhittaker)를 가하였다.
분리된 균주를 이용하여 백태 및 흑태를 대상2로 발효를 행한 청국장 시료들의 발효취를 비교하여 청국장의 기호성을 판단하기 위하여 , 물질의 냄새를 측정하여 그 값을 수취로 나타내는 휴대용 냄새 측정기 (Model # OMX-GR, Shinyei, Japan)를 이용하여 발효된 청국장들의 냄새를 측정하여 비교하였다. 청국장 점액질 성분의 양에 따라 나타나는 진의 길이의 차이를 측정하기 위하여 백금이를 이용하여 발효 청국장 표면을 문지른 후 천천히 떼어 내면서 점액질 물질이 끊어지지 않고 늘어나서 따라오는 최대 길이를 구하였다.
생쥐 대식세포 RAW 264.7을 10%의 fetal bovine serum (FBS, BioWhittaker, Walkersville, MD, U.S.A.)이 포함된 RPMI 1640 배지 (BioWhittaker)에서 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양한 후 96-well plate(Roche Inc.)에 분주하고 24 시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 배양세포를 phosphate buffered saline(PBS, BioWhittaker)로 세정한 후 원료콩 및 청국장 추출분획물들을 PBS(BioWhittaker)에 희석하여 20 μ1씩 첨가하였다(최종농도: 0.
, Maidstone, England)로 2회 여과하여 이를 에탄올 추출시료로 하였다. 에탄올 추출시료를 다시 hexane, ethyl ether, butanol, methanol, HjO 등을 이용하여 Fig. 4에 나타낸 방법으로 분획을 행한 후, 농축하여 각각 의용 매에 대한 분획물을 제조하였다.
원료콩과 청국장 시료 400 g에 대한 에탄올 추출을 행하고 이를 Rotary evaporator(EYELA Inc., Tokyo, Japan) 로 농축을 행하여 최종적으로 1.8 L의 원료콩 에탄올 추출 시료와 1.6 L의 청국장 에탄올 추출시료를 얻었다. 이를 hexane, ethyl ether, butanol, methanol, 压0 등을 이용하여 분획을 행하고(Fig.
재래시장에서 시판되는 청국장을 이용하여 단백질 분해 활성이 높은 Bacillus subtilis LSH805 균주를 분리 동정하였고, 이 균주를 이용하여 생산된 청국장의 혈전용해활성 및 대식 세포주에 대한 NO 생산능 등을 비교하였다. 백태를 이용해 발효된 청국장의 경우 점액성 물질의 길이가 흑태를 이용한 것보다 1.
청국장 점액질 성분의 양에 따라 나타나는 진의 길이의 차이를 측정하기 위하여 백금이를 이용하여 발효 청국장 표면을 문지른 후 천천히 떼어 내면서 점액질 물질이 끊어지지 않고 늘어나서 따라오는 최대 길이를 구하였다.
대상 데이터
단백질 분해효소를 생산하는 미생물을 분리하기 위하여 재래시장에서 판매하는 청국장을 시료로 이용하였다. 시료 1 g을 100 ml의 인산완충용액 (pH 7.
청국장 발효를 위하여 백태와 흑태 콩을 각각 1 kg씩 이용하였다. 흐르는 수돗물에 콩 1 kg을 씻고 4℃ 물에 24시간 담근 후 20분간 물을 제거하였다.
데이터처리
염기서열분석을 실시하였다. 분석된 염기서열은 Blast 를 사용하여 공시균주와 유사도를 검토하였으며 , 윈도우 버전의 Clustal 프로그램 (ClustalX ver. 1.8)을 이용하여 다중염기 배열(multiple alignment)을 수행한 후 neighbor-joining method와 bootstrap method(n=l 000)3- 분석하여 계통분류 학적 위치를 파악하였다.
이론/모형
청국장의 혈전에 대한 분해활성은 인간 fibrin plate를 이용하여 Astrup와 Mullertz의 방법을 토대로 측정하였다 [3]. 100 mm petri dish에 thrombin 용액 (50 unit/ml, Sigma) 을 200 |il 주입한 후, 여기에 0.
성능/효과
콩의 경우 품종별로 청국장 발효를 하였을 때 그 특성이 다르게 나타나는 것으로 알려져 있다[28]. 각각의 청국장에 대한 발효취를 측정한 결과 백태를 이용한 청국장이 흑태를 이용한 것보다 약간 낮은 수치를 기록하였으며, 균주분리에 이용한 재래식 청국장의 발효취 수치가 349이었으므로(자료 미제시) 분리균주를 이용한 청국장 발효에 의해 발효취가 상당히 개선된 것으로 나타났다. 각각의 청국장에 대한 점액물질의 길이를 측정한 결과 역시 백태를 이용한 청국장에서 더 길게 나타났으므로 점액성 물질의 양과 생리활성이 비례한다는 보고[12, 16, 18]와 발효취 결과를 토대로 B.
각각의 청국장에 대한 발효취를 측정한 결과 백태를 이용한 청국장이 흑태를 이용한 것보다 약간 낮은 수치를 기록하였으며, 균주분리에 이용한 재래식 청국장의 발효취 수치가 349이었으므로(자료 미제시) 분리균주를 이용한 청국장 발효에 의해 발효취가 상당히 개선된 것으로 나타났다. 각각의 청국장에 대한 점액물질의 길이를 측정한 결과 역시 백태를 이용한 청국장에서 더 길게 나타났으므로 점액성 물질의 양과 생리활성이 비례한다는 보고[12, 16, 18]와 발효취 결과를 토대로 B. subtilis LSH805 균주는 백태를 이용한 청국장 발효에 더욱 적합한 것을 알 수 있었다.
5에 나타냈다. 대식세포의 NO 생성 정도는 원료콩의 경우 hexane층과 ethyl ethei층에서 높은 수치를 나타냈으며 (Fig. 5A), 청국장 제품의 경우 hexane 층에서 가장 높은 수치를 나타냈다(Fig. 5B). 이러한 NO 생성 능은 추출물의 농도의존적 경향을 나타냈지만 농도에 따른 큰 차이는 관찰되지 않았다.
원료콩에 비해서 청국장의 면역세포활성이 높다는 보고[5, 15]도 있었는데 , 본 연구에서는 분획 전반에 걸쳐 청국장 제품 시료와 원료 콩 시료에서 비슷한 정도의 NO 생성능이 나타났다. 따라서 Bacillus subtilis LSH805 균주를 이용한 청국장 생산과정에서 유의적인 NO 생성능의 차이는 관찰되지 않았지만 원료 콩 자체에 포함되어 있는 유효성분에 의해 대식세포에 대한 NO 생성 이 나타난 것也로 생각되었다. 또한 원료 콩에 비해 청국장에서 수층의 NO 생성능이 증가하는 것으로 나타나 NO 생성능을 보이는 성분의 생물화학적 변화를 예상할 수 있었다(Fig.
2). 따라서 LSH8O5 균주를 Bacillus subtilis LSH805로 명명하였으며, 한국미 생 물보존센터 에 기 탁을 완료하였다(기 탁번호 KCCM 10739P).
따라서 Bacillus subtilis LSH805 균주를 이용한 청국장 생산과정에서 유의적인 NO 생성능의 차이는 관찰되지 않았지만 원료 콩 자체에 포함되어 있는 유효성분에 의해 대식세포에 대한 NO 생성 이 나타난 것也로 생각되었다. 또한 원료 콩에 비해 청국장에서 수층의 NO 생성능이 증가하는 것으로 나타나 NO 생성능을 보이는 성분의 생물화학적 변화를 예상할 수 있었다(Fig. 5). 권 등[15}은 청국장의 면역 증강 활성을 대조군에 비해 4.
3B). 반응 시작 15시간이 경과된 후 혈전분해량이 눈에 띄게 증가하였으며 20시간 반응 후에는 약 1,500 mg의 분해된 혈전을 얻을 수 있었다. 분리한 균주는 윤 등[29]과 같이 casein과 fibrin을 동시에 분-해하는 균주였다.
5배 정도 길었으며 발효취가 낮은 청국장을 얻었다. 백태를 이용한 발효 청국장의 혈전분해활성은 배양 후 15시간이 경과한 시점에서 급격한 증가를 보였으며 20시간이 경과한 후에는 약 1,500 mg의 분해된 혈전을 얻을 수 있었다. 청국장의 대식세포주의 NO 생산증진은 원료콩에 비해 큰 차이를 나타내지 않았지만 활성을 보이는 분획의 경향 변화를 확인할 수 있었다.
분리된 LSH805 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석한 결과, Bacillus subtilis WL6(Genbank no. DQ198162) 와 가장 높은 유사도(99%)를 보였다(Fig. 2). 따라서 LSH8O5 균주를 Bacillus subtilis LSH805로 명명하였으며, 한국미 생 물보존센터 에 기 탁을 완료하였다(기 탁번호 KCCM 10739P).
6 L의 청국장 에탄올 추출시료를 얻었다. 이를 hexane, ethyl ether, butanol, methanol, 压0 등을 이용하여 분획을 행하고(Fig. 4), 얻어진 분획물들을 Centrifugal evaporator (Sovall RC 5C+, Ashevrlle, NC, U.S.A.)를 이용하여 용매 제거 및 농축을 행한 결과, 원료콩의 경우 회수량 2.8 g(추출효율 0.7%) 전후, 청국장 시료의 경우 회수량 1.8 負 추출효율 0.45%) 전후의 비슷한 양으로 각각의 분획물 시료들을 얻을 수 있었다.
재래식 청국장 시료를 이용하여 casein이 함유된 영양 배지에서 casein을 분해하여 clear zone을 생성하는 균주의 분리를 행한 결과, 약 1(/*개의 콜로니 중 casein 분해능이 우수한 15종의 균주가 분리되었고 최종적으로 casein 분해능이 가장 우수한 균주를 선택하여 LSH805 균주로 명명하였다. 분리한 LSH805 균주가 나타내는 casein 분해 양상을 Fig.
백태를 이용한 발효 청국장의 혈전분해활성은 배양 후 15시간이 경과한 시점에서 급격한 증가를 보였으며 20시간이 경과한 후에는 약 1,500 mg의 분해된 혈전을 얻을 수 있었다. 청국장의 대식세포주의 NO 생산증진은 원료콩에 비해 큰 차이를 나타내지 않았지만 활성을 보이는 분획의 경향 변화를 확인할 수 있었다. 본 연구결과로 식품섭취를 통해 혈전증 등을 사전에 예방하거나 개선할 수 있는 건강 기능성 식품의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
후속연구
본 연구결과, 단백질 분해활성이 있는 청국장 발효세균인 Bacillus subtilis LSH805 균주를 분리 동정하였고, 원료 콩 고유의 대식세포수에 대한 NO 생성능 및 분리된 균주를 이용하여 발효 생산된 청국장의 혈전용해활성을 활용하여 중장년층을 대상으로 하는 심혈관 장애를 예방할 수 있는 건강 기능성 식품의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
청국장의 대식세포주의 NO 생산증진은 원료콩에 비해 큰 차이를 나타내지 않았지만 활성을 보이는 분획의 경향 변화를 확인할 수 있었다. 본 연구결과로 식품섭취를 통해 혈전증 등을 사전에 예방하거나 개선할 수 있는 건강 기능성 식품의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 살아있는 균주가 포함된 청국장에 의하여 높게 나왔던 것으로 생각된다. 삼투압 등의 발효조건 변화[13]와 첨가된 탄소원 종류별로 청국장 발효에서 혈전용해활성이 증가하는 보고[19P도 있어 추후의 연구를 통하여 혈전분해활성을 증가시키는 것이 가능할 것으로 판단된다.
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