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제안 방법
- 시료의 면역 활성을 측정하기위한 방법으로 보체계 활성을 Mayer의 방법10)으로 측정하였다. 즉, 시료(50μl)에 혈청(50μl)과 gelatin veronal buffer GVB++) 50μl를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 GVB++750μl를 가한 후양의 감작적혈구를 250" 가해 37P에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS(2.5mZ)를 가하여 원심분리하여 상층액의 흡광도(412 nm)를 측정하였으며, 보체계 활성은 대조군의 총보체용혈(total complement hemolysis, TCH50)에 대한 저해율(inhibition total complement hemolysis, ITCH50)로서 나타내었다
- 매생이는 우리나라 남해안에서 전통적으로 식용에 이용되어 온 해조류로써 독성으로 인한 인체 안전성에는 문제가 되지 않을 것으로 판단되나 매생이로부터 보체계 활성물질을 추출하는 과정에서 특정 성분이 농축되어 독성을 일으킬 가능성이 있다. 따라서 마우스를 대상으로 매생이 추출물에 대하여 경구독성을 측정하였다(Table 9). 그 결과 모든 시험군이 14일 동안 사망하거나 일반상태의 이상이 발견되지 않았으며, 체중증가량도 0.
- 개발가능성이 높을 것으로 예상된다. 따라서 본 연구에서는 총 102종의 해양생물로부터 in vitro에서 보체계 활성물질을 탐색하였으며 그 중 활성이 높고 자원량이 비교적 풍부하여 산업화가 용이할 것으로 판단되는 매생이(Capsosiphon Jhlvescens)를 대상으로 면역 활성물질의 적정추출조건 및 정제조건을 검토하고 5종의 인체암세포에 대한 세포독성을 조사하였으며 정제한 면역 활성물질의 당조성 분석, in vivo에서의 장관면역 활성 확인, 마우스 육종세포 성장저해 효과, 급성독성시험 등을 실시하였다.
- 장관면역 활성 측정. 마우스(Balb/c) 32마리를 대조군(PBS 투여), 매생이 추출물 투여군(20, 50, 100mg/kg체중)으로 구분하여 각각 7일간 구강에 투여한 다음 소장의 IgA 항체 생산 응답에 미치는 영향을 알아보기 위하여 분변 중의 IgA 항체량을 측정하였다. 신선한 분변 2-4알을 tube에 채취하여 중량을 측정하고 0.
- 급성독성 시험. 마우스를 대상으로 매생이 추출물을 100, 500, 1,000, 2,000 mg/kg 농도로 경구투여하고 14일 동안 사망여부, 체중변화 및 일반상태(털, 경련, 설사, 눈물, 보행 등)를 관찰하였다.
- In vitro에서 고형암 성장 저지실험. 마우스의 왼쪽 서혜부에 종양세포(Sarcoma-180)를 이식한 후 24시간 후부터 20일간 연속적으로 매생이 추출물을 복강에 투여하고 32일째 되는 날에 고형암의 무게를 측정한 후 다음 식에 따라 종양성장 저지율을 측정하였다.
- 장관면역 활성. 매생이 추출물의 기능성 식품 활용 가능성을 검토하기 위하여 장관면역 활성을 측정하였다. 즉, 마우스에 매생이 추출물을 투여한 다음 소장의 IgA 항체 생산 응답에 미치는 영향을 알아보기 위하기 분변 중의 IgA 항체량 변화를 측정한 결과, 마우스 분변 중 IgA 항체량은 대조군이 2,092±123.
- 추출. 매생이(Capsosiphon fulvescens)는 전남 완도에서 11월에 채취하여 실험실까지 저온상태로 운반한 다음 담수로 깨끗이 씻은 후 열풍건조기(60℃)에서 건조한 다음 분쇄하여 0.84 mm 표준체를 통과한 분말에 20배의 증류수를 첨가하여 적정 추출온도와 시간을 조사하였으며 추출수율은 추출분획을 건조한 중량을 추출에 사용된 시료의 중량게 대한 백분율로 나타내었다.
- 당 조성 분석. 매생이로부터 추출한 보체계 활성물질의 당 조성을 알아보기 위하여 매생이(SP-0)에 증류수 20배를 가하여 100℃에서 3시간 동안 가열한 후 원심분리하여 상층액을 취하였다(SP-1). 이 추출물을 1/20 부피로 진공농축하여 4배량의 알코올을 가한 다음 41에서 24시간 동안 정치한 후 원심분리하여 침전물을 증류수에 녹인 다음 24시간 투석한 것을 진공 동결 건조하여(SP-2) 각각 당분석용 시료로 제공하였다.
- 즉 매생이를 탈이온수로 깨끗하게 세척, 탈염한 후에 열풍건조기로 건조한 다음 분쇄하여 물 20배를 가한 후 추출시간 및 온도에 따른 수율 및 보체계 활성의 변화를 관찰하였다. 먼저 추출온도를 10(FC로 하여 추출시간에 따른 보체계 활성 및 수율의 변화를 Fig. 1에 나타내었다. 매생이의 보체계 활성물질 수율은 추출 4시간까지 시간이 경과할수록 증가하였으나, 보체계 활성은 추출 3시간까지 증가하다가 그 후 감소하였다.
- 면역 활성물질의 추출. 면역 활성물질의 일종인 보체계 활성물질이 대부분 열수에서 용이하게 추출되고, 현재 유통되는 보체계 활성화 다당류(oomplement system activating polysaccharide) 관련 상품도 건강보조식품임을 고려하여 우리나라 식품공전에 적합한 열수추출 방법을 선정, 최적조건을 검토하였다. 즉 매생이를 탈이온수로 깨끗하게 세척, 탈염한 후에 열풍건조기로 건조한 다음 분쇄하여 물 20배를 가한 후 추출시간 및 온도에 따른 수율 및 보체계 활성의 변화를 관찰하였다.
- 활성물질의 정제. 면역 활성물질의 활성을 높이기 위하여 현행 식품공전에서 식품의 추출용매로 사용이 가능한 주정을 이용한 침전분리와 한외여과장치에 의한 분획을 실시하였다. 즉, 매생이 열수추출물을 1/20 부피로 진공농축하여 4배량의 주정을 가한 다음 4P에서 24시간 동안 정치한 후 원심분리하여 침전물을 증류수에 녹인 다음 24시간 투석한 것을 한외여과 하여 분자량별로 분획하였다.
- 매생이로부터 추출한 보체계 활성물질의 당 조성을 알아보기 위하여 매생이(SP-0)에 증류수 20배를 가하여 100℃에서 3시간 동안 가열한 후 원심분리하여 상층액을 취하였다(SP-1). 이 추출물을 1/20 부피로 진공농축하여 4배량의 알코올을 가한 다음 41에서 24시간 동안 정치한 후 원심분리하여 침전물을 증류수에 녹인 다음 24시간 투석한 것을 진공 동결 건조하여(SP-2) 각각 당분석용 시료로 제공하였다. 당 조성분석은 동결건조 시료 0.
- 2 mg을 Chaplin의 방법11)에 따라 전처리하여 가스크로마토그레피로 분석하였다(Table 1). 정량은 내부 표준물질 (myo-inositol)과 표준시약(D-xylose, D-fucose, D- mannose, D-glucose, D-galactose)을 시료와 동일하게 TMS 화하여 농도별 상대적인 면적비를 구하여 환산하였다.
- 백혈구수 및 면역관련 장기 무게의 측정. 정제한 매생이 추출물을 실험동물(Female ICR mouse)의 복강에 농도별(체중 1kg당 0, 20, 50, 100 mg)로 10일간 연속적으로 투여하고, 시료투여 최종일로부터 1일, 2일, 4일, 7일째 되는 날에 채혈하여 hemacytometer로 백혈구수를 측정하였으며, 8일째 되는 날 실험동물을 경추탈골법으로 치사시킨 다음 체중을 측정한 후 간, 비장 및 흉선을 적출하여 각각의 무게를 체중에 대한 비율로 나타내었다.
- 수명연장 실험. 종양세포(Sarcoma-180)를 마우스의 복강에 이식한 후 24시간 후부터 10일간 시료를 복강에 투여하여 35일까지의 생존여부를 관찰하고 평균수명일수를 계산하여 다음 식으로부터 수명연장율을 구하였다.
- 면역 활성물질의 일종인 보체계 활성물질이 대부분 열수에서 용이하게 추출되고, 현재 유통되는 보체계 활성화 다당류(oomplement system activating polysaccharide) 관련 상품도 건강보조식품임을 고려하여 우리나라 식품공전에 적합한 열수추출 방법을 선정, 최적조건을 검토하였다. 즉 매생이를 탈이온수로 깨끗하게 세척, 탈염한 후에 열풍건조기로 건조한 다음 분쇄하여 물 20배를 가한 후 추출시간 및 온도에 따른 수율 및 보체계 활성의 변화를 관찰하였다. 먼저 추출온도를 10(FC로 하여 추출시간에 따른 보체계 활성 및 수율의 변화를 Fig.
- 면역 활성물질의 활성을 높이기 위하여 현행 식품공전에서 식품의 추출용매로 사용이 가능한 주정을 이용한 침전분리와 한외여과장치에 의한 분획을 실시하였다. 즉, 매생이 열수추출물을 1/20 부피로 진공농축하여 4배량의 주정을 가한 다음 4P에서 24시간 동안 정치한 후 원심분리하여 침전물을 증류수에 녹인 다음 24시간 투석한 것을 한외여과 하여 분자량별로 분획하였다. 분자량별 보체계 활성 및 수율을 Table 2에 나타내었다.
대상 데이터
- 시약. EDTA-gelatin veronal buffered saline(EDTA-GVB++, pH 7.4), GVB++(pH 7.4) 및 IgM hemolysin sensitized sheep erythrocytes(EA, 1 × 109 cell)는 일본 Biotest Co로부터 구입하였고, NHS(normal human serum)는 본 연구의 목적을 이해하는 건강한 성인남성(25세)의 자발적 동의를 얻어 채취한 혈액으로부터 제조하였다. 즉, 정상인의 정맥혈로부터 얻은 혈액을 25℃에서 30분간 방치한 후 2500rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 1ml씩 분주하여 -7℃에서 보관하면서 사용하였다.
데이터처리
- 동물실험 결과 통계분석. 실험결과는 평균치 ± 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군간 유의성은 Student's t-test로 검증하여 p value가 0.05 이하인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 이 추출물을 1/20 부피로 진공농축하여 4배량의 알코올을 가한 다음 41에서 24시간 동안 정치한 후 원심분리하여 침전물을 증류수에 녹인 다음 24시간 투석한 것을 진공 동결 건조하여(SP-2) 각각 당분석용 시료로 제공하였다. 당 조성분석은 동결건조 시료 0.2 mg을 Chaplin의 방법11)에 따라 전처리하여 가스크로마토그레피로 분석하였다(Table 1). 정량은 내부 표준물질 (myo-inositol)과 표준시약(D-xylose, D-fucose, D- mannose, D-glucose, D-galactose)을 시료와 동일하게 TMS 화하여 농도별 상대적인 면적비를 구하여 환산하였다.
- In vitro에서 암세포에 대한 독성시험. 매생이 추출물의 세포독성은 5종의 인체 암세포(폐암, 난소암, 색소세포암, 중추신경계암, 결장암)를 대상으로 하여 MTT시험법 (Methylthiazoletetmzolium assay)을 이용하여 측정하였다.
- 면역 활성의 측정. 시료의 면역 활성을 측정하기위한 방법으로 보체계 활성을 Mayer의 방법10)으로 측정하였다. 즉, 시료(50μl)에 혈청(50μl)과 gelatin veronal buffer GVB++) 50μl를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 GVB++750μl를 가한 후양의 감작적혈구를 250" 가해 37P에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS(2.
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