포도상구균에 대만 에탄올 농도별 은행잎 추출물의 항균효과에 관한 연구 A Study on the Antimicrobial Effect of Ginkgo biloba Leaves Extracts according to Concentrations of Ethanol for staphylococcus aureus원문보기
본 연구에서는 은행잎 추출물의 Staphylococcus aureus에 대한 항균효과를 검증하기 위해 먼저 에탄올 농도별로 bilobalide와 ginkgolide A, B의 성분을 분석한 결과 40% 에탄올 용매를 최적 활성농도로 결정하였다. Disc diffusion test, Optical density test을 통한 S. aureus 항균실험 결과 에탄올 추출농도가 증가할수록 항균효과가 증가하나 40% 에탄올 이상에서는 항균활성에 큰 차이가 없었다. 주사전자현미경을 통하여 은행잎 에탄올 40% 추출물 16배 농축액을 처리한 균의 세포표면을 확인한 결과 심하게 손상되었음을 확인할 수 있었다. 투과전자현미경을 이용하여 관찰한 결과 은행잎 추출물로 처리한 균주에서는 세포벽이 관찰되지 않았으며, 이는 은행잎 추출물의 주성분인 bilobalide와 ginkgolide A, B가 세포벽 합성을 저해하는 것으로 보여진다.
본 연구에서는 은행잎 추출물의 Staphylococcus aureus에 대한 항균효과를 검증하기 위해 먼저 에탄올 농도별로 bilobalide와 ginkgolide A, B의 성분을 분석한 결과 40% 에탄올 용매를 최적 활성농도로 결정하였다. Disc diffusion test, Optical density test을 통한 S. aureus 항균실험 결과 에탄올 추출농도가 증가할수록 항균효과가 증가하나 40% 에탄올 이상에서는 항균활성에 큰 차이가 없었다. 주사전자현미경을 통하여 은행잎 에탄올 40% 추출물 16배 농축액을 처리한 균의 세포표면을 확인한 결과 심하게 손상되었음을 확인할 수 있었다. 투과전자현미경을 이용하여 관찰한 결과 은행잎 추출물로 처리한 균주에서는 세포벽이 관찰되지 않았으며, 이는 은행잎 추출물의 주성분인 bilobalide와 ginkgolide A, B가 세포벽 합성을 저해하는 것으로 보여진다.
A optimal condition for the Ginkgo biloba extraction in ethanol and water binary solvent system has been proposed based on concentration of bilobalide and ginkgolide known as having a antimicrobial components in the range 5% to 70% ethanol in water at $80^{\circ}C$. Concentration of bilob...
A optimal condition for the Ginkgo biloba extraction in ethanol and water binary solvent system has been proposed based on concentration of bilobalide and ginkgolide known as having a antimicrobial components in the range 5% to 70% ethanol in water at $80^{\circ}C$. Concentration of bilobalide as a single component of Ginkgo biloba leaves extract is the highest at the 60% ethanol and ginkgolide A and B is highest at 50% ethanol. Antimicrobial effect of Ginkgo biloba leaves extracts on the S. aureus was also examined by disc diffusion test and optical density test. In case of the disc diffusion test, the clean zone diameter was increased from 0.95 cm to 1.70 cm as ethanol concentration increased from 5 to 70%. However, over the 40% of ethanol concentration the antimicrobial effect was almost flat. Based on these results, we propose that the 40% of ethanol and 60% water solvent is most desirable for Ginkgo biloba extract considering vapor pressure problem in concentrating process after extraction. We introduced SEM and TEM to figure out the morphological change on the surface and inside body of S. aureus when Ginkgo biloba leaves extract was treated. After mixed with Ginkgo biloba leaves extract blast like blebs appeared on the surface of S. aureus cells and cell wall was not observed. From the these results, it seems that the Ginkgo biloba leaves extract including bilobalide and ginkgolide A, B prevent cell wall synthesis.
A optimal condition for the Ginkgo biloba extraction in ethanol and water binary solvent system has been proposed based on concentration of bilobalide and ginkgolide known as having a antimicrobial components in the range 5% to 70% ethanol in water at $80^{\circ}C$. Concentration of bilobalide as a single component of Ginkgo biloba leaves extract is the highest at the 60% ethanol and ginkgolide A and B is highest at 50% ethanol. Antimicrobial effect of Ginkgo biloba leaves extracts on the S. aureus was also examined by disc diffusion test and optical density test. In case of the disc diffusion test, the clean zone diameter was increased from 0.95 cm to 1.70 cm as ethanol concentration increased from 5 to 70%. However, over the 40% of ethanol concentration the antimicrobial effect was almost flat. Based on these results, we propose that the 40% of ethanol and 60% water solvent is most desirable for Ginkgo biloba extract considering vapor pressure problem in concentrating process after extraction. We introduced SEM and TEM to figure out the morphological change on the surface and inside body of S. aureus when Ginkgo biloba leaves extract was treated. After mixed with Ginkgo biloba leaves extract blast like blebs appeared on the surface of S. aureus cells and cell wall was not observed. From the these results, it seems that the Ginkgo biloba leaves extract including bilobalide and ginkgolide A, B prevent cell wall synthesis.
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문제 정의
본 연구에서는 은행잎 추출물의 최적의 추출조건을 확립하고 은행잎 추출물의 staphylococcus에 대한 항균 효과를 검증하기 위해 먼저 물에 대한 에탄올 농도별로 bilobalide와 ginkgolide를 성분을 분석하여 최적의 에탄올 농도를 제시하고 추출된 은행잎 추출물을 S. a“re“s에 처리한 후 생균 수 측정 및 세포 형태 관찰을 통해 은행잎 추출물의 항균 효과를 검증하고자 한다.
제안 방법
S. aweus의 액체 배 양을 배지 6 mt, 균주 Q2 畝, 40% 에탄올 추출물 1/16 농축액 0.6 畝를 첨가하여 12시간 배양한 후 osmic acid를 0.1% 농도가 되게 주입하여 전 고정 하면서 원심 분리하여 집균하였다. 여기에 1% osmic acid를 가하여 균을 고정 (4℃, overnight) 시켜 agar로서 포매한 후 50, 60, 70, 80, 90, 95, 100% ethanol, propylene oxide 는 각각 20분씩 100%와 propylene oxide 는 각각 20분씩 2회 탈수시켰다.
S. 의 액체 배양을 배지 6 균주 0.2 m们 40% 에탄올 추출물 1/16 농축액 0.6 砒을 첨가하여 12시간 배양한 후 osmic acid를 0.1% 농도가 되게 주입하여 전 고정 하면서 원심 분리하여 집균하고 진공 건조 후 주사 전자현미경 (SEM, Hitachi s-4700)을 이용하여 분해능이 15 kV, 1.5 nm, 작동 거리 12 mm 조건 하에서 세포의 표면을 관찰하였다.
은행잎으로부터 추출 용매를 5%~70% 에탄올을 이용하여 각 단계별로 활성 성분을 비교한 결과 bilobalide는 60% 에탄올을 이용하여 추출하였을 때 가장 효율이 좋았고, ginkgolide A, B는 50% 에탄올을 사용했을 때 가장 효율이 좋았으며, 추출 용매의 농도가 증가되면서 효율이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 실제 생산에서 에탄올이 100% 회수 가능하지 않기 때문에 경제적인 점과 대용량 추출과정에서 가정 안정성이 있다고 판단되는 40% 에탄올 용매를 최적 활성농도로 결정하였다.
보다 자세한 형태 변화를 알기 위하여 투과 현미경으로 세포형태를 관찰하였다. Fig.
본 연구에서는 은행잎 추출물의 staphylococcus aureus에 대한 항균효과를 검증하기 위해 먼저 에탄올 농도별로 bilobalide와 ginkgolide A, 日의 성분을 분석한 결과 40%에 탄올 용매를 최적 활성농도로 결정하였다. Disc diffusion test, Optical density test을 통한 S.
1% 농도가 되게 주입하여 전 고정 하면서 원심 분리하여 집균하였다. 여기에 1% osmic acid를 가하여 균을 고정 (4℃, overnight) 시켜 agar로서 포매한 후 50, 60, 70, 80, 90, 95, 100% ethanol, propylene oxide 는 각각 20분씩 100%와 propylene oxide 는 각각 20분씩 2회 탈수시켰다. 탈수 후에 agar block을 epon mixture에 넣어서 수지를 침투시키고 35℃, 45℃, 60℃에서 각각 18시간씩 포매한 후 시료를 초박절편 (ultramicrotome, LKB)하여 uranyl acetate와 lead citrate로 염색하고 TEM (JEOL, JSM 2000FX2)으로 가속전압 80 kV 하에서 세균의 손상을 관찰하였다.
은행잎 분말 10 g에 대하여 H2O, ethanol 농도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70% (v/v)의 용매를 각각 100 |讹씩 첨가하여 4시간 현탁한 후 membrane filter (0.45 “in, Millipore Co.)로 여과한 후 80℃ 에서 2시간 동안 solvent extraction을 이용하여 중탕한 후 rotary vacuum evaporator로 농축하여 건조하고 고형물을 계면활성제 (1% tween20)을 이용하여 시료로 사용하였다.
균주를 30℃에서 1 ~2일 배양한 후 이 균 액을 배지 1 皿당 1 X 106 cell이 포함되도록 접종하여 현탁하였다. 이 균체를 도말한 soft agar를 충분히 건조시킨 후 paper disc를 무균 조작에 의해 안착시켰고, 그 위에 각종 추출물 용액을 100 以씩 주입하여 도말한 균체의 최적 생육온도에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 clear zone (mm) 크기를 측정하여 항균 활성 정도를 측정하였다.
여기에 1% osmic acid를 가하여 균을 고정 (4℃, overnight) 시켜 agar로서 포매한 후 50, 60, 70, 80, 90, 95, 100% ethanol, propylene oxide 는 각각 20분씩 100%와 propylene oxide 는 각각 20분씩 2회 탈수시켰다. 탈수 후에 agar block을 epon mixture에 넣어서 수지를 침투시키고 35℃, 45℃, 60℃에서 각각 18시간씩 포매한 후 시료를 초박절편 (ultramicrotome, LKB)하여 uranyl acetate와 lead citrate로 염색하고 TEM (JEOL, JSM 2000FX2)으로 가속전압 80 kV 하에서 세균의 손상을 관찰하였다.
항균 활성 물질의 추출 효율성을 검증하기 위하여 은행잎 분말 10 g에 대하여 氏0, ethanol 농도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70% (v/v)의 용매를 각각 100 砒씩 첨가하여 80℃ 에서 2시간 동안 solvent extraction을 이용하여 중탕한 후 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC-UV)를 이용하여 분석 정량화하였다. 은행잎 성분분석 조건은 Table 1에 나타내었다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 균주 staphylococcus aureus (KCCM 12214)는 한국종균협회로부터 분양받았다. 균 생육배지는 trypticase soy broth (TSB, pH 7.
본 실험에 사용된 은행잎은 2001년 9월 하순과 1。월 중순에 전남 장성 지역의 농장에서 채취하여 증류수로 수세한 후 음지에서 풍건 시켜 완전 건조된 것을 믹서를 이용하여 분말로 만들어 사용하였다.
성능/효과
본 연구에서는 은행잎 추출물의 staphylococcus aureus에 대한 항균효과를 검증하기 위해 먼저 에탄올 농도별로 bilobalide와 ginkgolide A, 日의 성분을 분석한 결과 40%에 탄올 용매를 최적 활성농도로 결정하였다. Disc diffusion test, Optical density test을 통한 S. aureus 항균실험 결과에 탄올 추출농도가 증가할수록 항균효과가 증가하나 40%에 탄올 이상에서는 항균 활성에 큰 차이가 없었다.
즉 농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 inhibition zone의 크기가 증가하였으며, 40% 에탄올 농도 이상에서는 큰 차이가 없었다. Fig. 3은 Optical density test 결과를 나타낸 것으로 trypticase soy broth 6 畝에 균 0.2와 각각의 은행잎 주출물 0.6 畝를 접종하고 shaking incubator에서 최적 생육 조건으로 배양시킴과 동시에 접종 시간부터 4시간 간격으로 spectrophotometer로 640 rnn 에서 측정한 결과 10~40%까지는 항균 활성이 증가하다가 40-70%에서는 항균 활성에 큰 차이가 없었다. 이는 Fig.
5는 투과전자현미 경으로 세균의 손상을 관찰한 결과이다. 무 처리 군의 경우 뚜렷한 세포벽을 관찰할 수 있었으며, 은행잎 에탄올 추출물 처리 군의 경우 세포벽이 없는 것으로 관찰되었다. S.
은행잎으로부터 추출 용매를 5%~70% 에탄올을 이용하여 각 단계별로 활성 성분을 비교한 결과 bilobalide는 60% 에탄올을 이용하여 추출하였을 때 가장 효율이 좋았고, ginkgolide A, B는 50% 에탄올을 사용했을 때 가장 효율이 좋았으며, 추출 용매의 농도가 증가되면서 효율이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 실제 생산에서 에탄올이 100% 회수 가능하지 않기 때문에 경제적인 점과 대용량 추출과정에서 가정 안정성이 있다고 판단되는 40% 에탄올 용매를 최적 활성농도로 결정하였다.
주사 전자현미경을 통하여 은행잎에 탄올 40% 추출물 16배 농축액을 처리한 균의 세포 표면을 확인한 결과 심하게 손상되었음을 확인할 수 있었다. 투과 전자현미경을 이용하여 관찰한 결과 은행잎 추출물로 처리한 균주에서는 세포벽이 관찰되지 않았으며, 이는 은행잎 추출물의 주성분인 bilobalide와 ginkgolide A, B가 세포벽 합성을 저해하는 것으로 보여진다.
70 cm의 clear zone을 나타내었다. 즉 농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 inhibition zone의 크기가 증가하였으며, 40% 에탄올 농도 이상에서는 큰 차이가 없었다. Fig.
주사 전자현미경을 통하여 은행잎에 탄올 40% 추출물 16배 농축액을 처리한 균의 세포 표면을 확인한 결과 심하게 손상되었음을 확인할 수 있었다. 투과 전자현미경을 이용하여 관찰한 결과 은행잎 추출물로 처리한 균주에서는 세포벽이 관찰되지 않았으며, 이는 은행잎 추출물의 주성분인 bilobalide와 ginkgolide A, B가 세포벽 합성을 저해하는 것으로 보여진다.
후속연구
무 처리 군의 경우 뚜렷한 세포벽을 관찰할 수 있었으며, 은행잎 에탄올 추출물 처리 군의 경우 세포벽이 없는 것으로 관찰되었다. S. aureus 세포벽은 한쪽의 peptidoglycan 층에 결합된 pentaglycine의 마지막 아미노기와 다른 층의 peptidoglycan 층에 결합된 D-alanine의 subterminal 기의 카르복실기 사이에 peptide 결합이 이루어져 있는 것에 비추어 볼 때, bilobalide 또는 ginkgolide가 peptidoglycan의 형성을 억제 시키므로서 세포벽 합성을 저해하여 세포벽 및 세포막을 용해시켜 성장을 저해시키는 것으로 생각할 수 있는데 이를 규명하기 위해서는 단일 물질을 사용하여 보다 다양한 균주에 대하여 세포벽 손상 형태를 관찰하는 것이 요구되어 향후 연구과제로 진행하고자 한다.
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