재조합 인터페론 알파-2a의 부위 특이적 수식을 위한 고체상 PEGylation : 공정 성능, 특성화 및 생물학적 활성 Solid-phase PEGylation for Site-Specific Modification of Recombinant Interferon ${\\alpha}$-2a : Process Performance, Characterization, and In-vitro Bioactivity원문보기
혈액 내 순환시 안정성 향상과 면역원성의 감소를 위해, rhIFN-${\alpha}$-2a은 N-terminus의 ${\alpha}$-아민기에 mPEG aldehyde를 solid-phase PEGylation 시킨다. CM-Sepharose와 같은 양이온 교환수지가 고체 지지체로 사용되었다. Mono-PEGylate는 양이온 교환 수지에서 unmodified 단백질과 분리되어 용출된다. Site-srecific PEGylation과 mono-PEGylate의 분리가 한 단계의 공정으로 얻어진다는 점은 solid-phase PEGylation의 이점을 뒷받침해준다. 위치 특이성은 peptide digest의 질량 분석과 Edman degradation을 이용한 N-terminal sequencing에 의해 확인하였다. Mono-PEGylate는 항바이러스 활성과 면역원성의 감소를 나타내고, 감소 정도는 결합되는 mPEG의 분자량에 비례한다. Trypsin 저항성과 온도 안정성은 mono-PEGylation에 의해 두드러지게 개선되었다. Solid-phase PEGylation을 통해 종래의 액상 반응에서 나타날 수 있는 재현성 낮은 반응, 부 반응물 생성, 부 반응물 제거 공정 등의 단점을 극복할 수 있었다. 그러나 solid-phase PEGylation의 문제점인 액상 반응에 비교하여 많은 양의 PEG를 사용하여야 한다는 점은 개선되어야 한다.
혈액 내 순환시 안정성 향상과 면역원성의 감소를 위해, rhIFN-${\alpha}$-2a은 N-terminus의 ${\alpha}$-아민기에 mPEG aldehyde를 solid-phase PEGylation 시킨다. CM-Sepharose와 같은 양이온 교환수지가 고체 지지체로 사용되었다. Mono-PEGylate는 양이온 교환 수지에서 unmodified 단백질과 분리되어 용출된다. Site-srecific PEGylation과 mono-PEGylate의 분리가 한 단계의 공정으로 얻어진다는 점은 solid-phase PEGylation의 이점을 뒷받침해준다. 위치 특이성은 peptide digest의 질량 분석과 Edman degradation을 이용한 N-terminal sequencing에 의해 확인하였다. Mono-PEGylate는 항바이러스 활성과 면역원성의 감소를 나타내고, 감소 정도는 결합되는 mPEG의 분자량에 비례한다. Trypsin 저항성과 온도 안정성은 mono-PEGylation에 의해 두드러지게 개선되었다. Solid-phase PEGylation을 통해 종래의 액상 반응에서 나타날 수 있는 재현성 낮은 반응, 부 반응물 생성, 부 반응물 제거 공정 등의 단점을 극복할 수 있었다. 그러나 solid-phase PEGylation의 문제점인 액상 반응에 비교하여 많은 양의 PEG를 사용하여야 한다는 점은 개선되어야 한다.
In 'solid-phase' PEGylation, the conjugation reaction occurs as the proteins are attached to a solid matrix, and thus it can have distinct advantages over the conventional, solution-phase process. We report a case study: rhIFN-${\alpha}$-2a was first adsorbed to cation exchange resin and ...
In 'solid-phase' PEGylation, the conjugation reaction occurs as the proteins are attached to a solid matrix, and thus it can have distinct advantages over the conventional, solution-phase process. We report a case study: rhIFN-${\alpha}$-2a was first adsorbed to cation exchange resin and then N-terminally PEGylated by aldehyde mPEG of 5, 10, and 20 kD through reductive alkylation. After the PEGylation, salt gradient elution efficiently recovered the mono-PEGylate in a purified form from the unwanted species such as unmodified IFN, unreacted PEG, and others. The mono-PEGylation and its purification were integrated in a single chromatographic step. Depending on the molecular weight of the mPEG aldehyde used, the mono-PEGylation yield ranged 50-64%. We could overcome the major problems of random, or uncontrollable, multi-PEGylation and the post-PEGylation purification difficulties associated with the solution-phase process. N-terminal sequencing and MALDI-TOF MS confirmed that a PEG molecule was conjugated only to the N-terminus. Compared with the unmodified IFN, the mono-PEGylate showed the reduced anti-viral activity as measured by the cell proliferation assay. The bioactivity was reduced more as the higher molecular weight PEG was conjugated. Immunoreactivity, evaluated indirectly by antibody binding activity using a surface plasmon resonance biosensor, also decreased. Nevertheless, trypsin resistance as well as thermal stability was considerably improved.
In 'solid-phase' PEGylation, the conjugation reaction occurs as the proteins are attached to a solid matrix, and thus it can have distinct advantages over the conventional, solution-phase process. We report a case study: rhIFN-${\alpha}$-2a was first adsorbed to cation exchange resin and then N-terminally PEGylated by aldehyde mPEG of 5, 10, and 20 kD through reductive alkylation. After the PEGylation, salt gradient elution efficiently recovered the mono-PEGylate in a purified form from the unwanted species such as unmodified IFN, unreacted PEG, and others. The mono-PEGylation and its purification were integrated in a single chromatographic step. Depending on the molecular weight of the mPEG aldehyde used, the mono-PEGylation yield ranged 50-64%. We could overcome the major problems of random, or uncontrollable, multi-PEGylation and the post-PEGylation purification difficulties associated with the solution-phase process. N-terminal sequencing and MALDI-TOF MS confirmed that a PEG molecule was conjugated only to the N-terminus. Compared with the unmodified IFN, the mono-PEGylate showed the reduced anti-viral activity as measured by the cell proliferation assay. The bioactivity was reduced more as the higher molecular weight PEG was conjugated. Immunoreactivity, evaluated indirectly by antibody binding activity using a surface plasmon resonance biosensor, also decreased. Nevertheless, trypsin resistance as well as thermal stability was considerably improved.
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문제 정의
수 있다. 본 연구에서는 in vitro에서 trypsin 저 항을 측정함으로써 mono-PEGylate의 안정 성 향상을 평가하였다. 수식 된 PEG가 trypsin에 의한 절단을 방해하면서, native IFN과 mono-PEGylated IFN의 단위 시간당 분해속도가 달라진(17).
제안 방법
Edman degradation, trypsin-digested peptide mapping, MALDI-TOF와 같은 다양한 분석 방법을 이용하여 특이적으로 N-terminal mono-PEGylation 되었는지 확인하였다. 2-DE 를 통해 mono-PEGylatee] 분자량의 변화와 pl 값의 변화를 알아보았다. 세포 병변법을 통해 생물학적 활성인 항바이러스 역가를 평가하였고 SPR (surface plasmon resonance biosensor)을 이용하여 면역반응성을 측정하였다.
이와 같은 조건에서 단백질 대비 PEG 몰 비 율을 10, 20. 30, 40배 로 변화시 키 고 환원제 농도 역 시 10, 20, 40mM로 변화시키면서 PEG의 몰 비율과 환원제에 대한영향을 연구하였다. 최대 수율을 나타낼 수 있는 조건은 NaBH3CN 농도 20 mM, 단백질 대 비 20배 율의 PEG 농도였다.
이 공정은 N-terminal mono-PEGylate의 재현성 있는 수율을 나타내었고 원하는 PEGylate만을 적절한 정제 공정으로 분리해낼 수 있다(22, 23). Edman degradation, trypsin-digested peptide mapping, MALDI-TOF와 같은 다양한 분석 방법을 이용하여 특이적으로 N-terminal mono-PEGylation 되었는지 확인하였다. 2-DE 를 통해 mono-PEGylatee] 분자량의 변화와 pl 값의 변화를 알아보았다.
GPC를 통해 PEGylation 여부와 수식부위를 분석하였다. 첫 번째 단계로 MALDI-TOF MS로 질량분석을 통해서 PEGylate의 분자량을 측정하였다.
GPC를이용하여 정제된 IFN PEGylate는 진공건조 하였다. Trypsin (Promega, Wisconsin, USA)은 50 mM ammonium bicarbonate 버퍼 (pH 7.
IFN PEGylate의 serum에서의 안정성은 항 trypsin 안정성을 측정하고 비교함으로써 간접적으로 평가하였다. GPC를이용하여 정제된 IFN PEGylate는 진공건조 하였다.
Mono-PEGylate의 열 안정성 향상은 50℃에서 변성을 관찰함으로 측정하였다. Fig.
PEGylates의 면역반응성은 항체-항원 반응에 의해 간접적으로 측정하였다. 5, 10, 20 kD PEG와 mono-PEGylated된 IFN의 면역반응성은 각각 native IFN의 약 48%, 23%, 15%로 감소하였다.
RP-HPLC C4 (Phenomenex, California, CA, USA) 칼럼으로 PEGylate의 순도를 분석하였다. 평형버퍼는 100% DDW (distilled deionized water)에 0.
Resin과 pH에 따른 PEGylation 수율 변화는 pH 3.0, 3.5, 4.0 그리고 4.5에서의 CM-Sepharose와 SP-Sepharose를 이용한 실험을 통하여 연구되었다. CM-Sepharose, pH 4.
8)에 100 mg/mL로 재용해하였다. Trypsin대 IFN의 질량 비율이 1대 30이 되도록 건조된 IFN 또는 IFN PEGylate에 trypsin 용액을 주입하였다. 37℃ 항온조에서 12 시간 반응시켰다.
세포 병변법을 통해 생물학적 활성인 항바이러스 역가를 평가하였고 SPR (surface plasmon resonance biosensor)을 이용하여 면역반응성을 측정하였다. 그리고 온도 안정성과 단백질 분해 효소에 대한 안정성을 평가하였다.
26). 면역반응성은 일정량의 항 인터페론 단일클론 힝체 (product no. 21100-2, R&D systems, Minnesota, USA)와 항원 (IFN, PEGylated IFNs) 간의 결합을 통해 CM5 chip 이 장착된 SPR (Biacore 3000, Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 측정하였다. 칩 표면에 항체를 고정화하고 항원으로 PEGylated IFN을 흘려주어 control 인 unmodified IFN과 비교하였다.
본 연구에서는 interferon a-2a 의 N-terminal mono-PEGylation을 위한 'solid-phase PEGylation, 을 수행하였다. 여기서 먼저 단백질을 이온교환수지에 흡착시킨다.
이후 RP-HPLO 통해서 IFN이 절단되어 줄어드는 양을 peak 높이의 변화로 측정하여 1차 반응 속도 식에 적용하여 반응속도 상를 구하여 trypsin에 대한 안정성을 비교하였다. 온도 안정성은 50℃에서 단백질이 변성 혹은 응집되어 침전될 때 340 nm에서의 흡광도 변화를 통해 평가하였다 (30).
6 M까지 35분 동안 용출시켰다. 용출된 샘플은 Bradford assay를 통해서 PEGylation 수율을 계산하였고 용출된 혼합물은 GPC (bed volume 25 mL)를 통해 분석하였다.
수식 된 PEG가 trypsin에 의한 절단을 방해하면서, native IFN과 mono-PEGylated IFN의 단위 시간당 분해속도가 달라진(17). 이 변화를 1차 반응 속도식 에 적 용시 켜 1차 반응 속도상수 (k) 를 구하여 안정성 향상효과를 정량적으로 결정하였다. Fig.
30분 단위로 시료를 취하고 samplee 20% TFA (trifluoroacetic acid)를 50 uL 첨가하여 반응을 정지 시킨다. 이후 RP-HPLO 통해서 IFN이 절단되어 줄어드는 양을 peak 높이의 변화로 측정하여 1차 반응 속도 식에 적용하여 반응속도 상를 구하여 trypsin에 대한 안정성을 비교하였다. 온도 안정성은 50℃에서 단백질이 변성 혹은 응집되어 침전될 때 340 nm에서의 흡광도 변화를 통해 평가하였다 (30).
분석하였다. 첫 번째 단계로 MALDI-TOF MS로 질량분석을 통해서 PEGylate의 분자량을 측정하였다. 샘플은 narrow GELoader tip (Eppendorf, Germany)를 이용하여 Poros R2 resin으로 염을 제거하였다.
21100-2, R&D systems, Minnesota, USA)와 항원 (IFN, PEGylated IFNs) 간의 결합을 통해 CM5 chip 이 장착된 SPR (Biacore 3000, Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 측정하였다. 칩 표면에 항체를 고정화하고 항원으로 PEGylated IFN을 흘려주어 control 인 unmodified IFN과 비교하였다. SPR 기술에 기반을 둔 in vitro immunoassay는 면역반응성의 신뢰성 있는 정보를 제공하고 있다(27-29).
항바이러스 역가 측정은 MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) 세포가 VSV (Vesicular Stomatitis Virus)에 감염된 후 표준 IFN (100 IU/mL)에 의해 생존한 세포를 기준으로 하여 측정시료 (IFN, mono-PEGylated IFNs)에 의해 세포가 바이러스에 저항해 생존한 정도를 통해 정량화 하여 측정하였다(25, 26). 면역반응성은 일정량의 항 인터페론 단일클론 힝체 (product no.
대상 데이터
PEGylation 시킨다. CM-Sepharose와 같은 양이온 교환수지가 고체 지지체로 사용되었다. Mono-PEGylate는 양이온교환 수지에서 unmodified 단백질과 분리되어 용출된다.
SPR을 사용하기 위한 CM5 칩은 Biacore (Uppsala, Sweden)사에서 구매하였다. Gel pennentation chiomatography에 사용된 Superose 12HR 10/30과 2-DE를 위한 Ettan IPGphor IEF system 은 Amersham Bioscience (Uppsala, Sweden)사에서 구매하였다.
활성화 PEG는 (주)선바이오에서 구입하였으며, 평균 분자량이 5 kD, 10 kD, 20 kD (허용 범위 土 500)인 mPEG-aldehyde 를 사용하였다. PEGylation 버퍼로 이용된 sodium phosphate, 환원제로 사용된 sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) 및 기타 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 사에서 구입하였다. Solid-phase PEGylation 조건을 최적화하기 위해 사용된 CM-Sepharose와 SP-Sepharose는 Amersham Bioscience (Uppsala, Sweden)사에서 구매하였다.
단백 정량을 위한 Bradford dye와 SDS-PAGE 시약은 Bio-Rad (USA) 사에서 구입하였다. SPR을 사용하기 위한 CM5 칩은 Biacore (Uppsala, Sweden)사에서 구매하였다. Gel pennentation chiomatography에 사용된 Superose 12HR 10/30과 2-DE를 위한 Ettan IPGphor IEF system 은 Amersham Bioscience (Uppsala, Sweden)사에서 구매하였다.
Louis, USA) 사에서 구입하였다. Solid-phase PEGylation 조건을 최적화하기 위해 사용된 CM-Sepharose와 SP-Sepharose는 Amersham Bioscience (Uppsala, Sweden)사에서 구매하였다. 단백 정량을 위한 Bradford dye와 SDS-PAGE 시약은 Bio-Rad (USA) 사에서 구입하였다.
Solid-phase PEGylation 조건을 최적화하기 위해 사용된 CM-Sepharose와 SP-Sepharose는 Amersham Bioscience (Uppsala, Sweden)사에서 구매하였다. 단백 정량을 위한 Bradford dye와 SDS-PAGE 시약은 Bio-Rad (USA) 사에서 구입하였다. SPR을 사용하기 위한 CM5 칩은 Biacore (Uppsala, Sweden)사에서 구매하였다.
본 실험에 사용된 rhIFN-a-2ae 유전자 변형된 대장균 (MC1061)으로부터 정제한 것을 (주)녹십자 R&D에서 용액 (50 n)M acetate buffer, pH 4.0에 2.0 mg/mL)의 형태로 제공받았다. 활성화 PEG는 (주)선바이오에서 구입하였으며, 평균 분자량이 5 kD, 10 kD, 20 kD (허용 범위 土 500)인 mPEG-aldehyde 를 사용하였다.
첫 번째 단계로 MALDI-TOF MS로 질량분석을 통해서 PEGylate의 분자량을 측정하였다. 샘플은 narrow GELoader tip (Eppendorf, Germany)를 이용하여 Poros R2 resin으로 염을 제거하였다. PEGylate solution 1 J1L와 matrix solution (sinapinic acid saturated in 0.
0 mg/mL)의 형태로 제공받았다. 활성화 PEG는 (주)선바이오에서 구입하였으며, 평균 분자량이 5 kD, 10 kD, 20 kD (허용 범위 土 500)인 mPEG-aldehyde 를 사용하였다. PEGylation 버퍼로 이용된 sodium phosphate, 환원제로 사용된 sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) 및 기타 시약은 Sigma-Aldrich (St.
이론/모형
PEGylation에 의한 1차 및 2차 구조 변화를 분석하기 위해 Far-UV CD spectropolarimeter (Jasco, model J-715) 를 사용하였다. CD 스펙트럼은 190-250 nm이고 excitation 파장은 200-230 nm이었다.
2-DE 를 통해 mono-PEGylatee] 분자량의 변화와 pl 값의 변화를 알아보았다. 세포 병변법을 통해 생물학적 활성인 항바이러스 역가를 평가하였고 SPR (surface plasmon resonance biosensor)을 이용하여 면역반응성을 측정하였다. 그리고 온도 안정성과 단백질 분해 효소에 대한 안정성을 평가하였다.
Sitespecific PEGylation과 mono-PEGylate의 분리가 한 단계의 공정으로 얻어진다는 점은 solid-phase PEGylation의 이점을 뒷받침해준다. 위치 특이성은 peptide digest의 질량 분석과 Edman degradation을 이용한 N-terminal sequencing0]] 의해 확인하였다. Mono-PEGylate는 항바이러스 활성과 면역원성의 감소를 나타내고, 감소 정도는 결합되는 mPEG의 분자량에 비례한다.
성능/효과
1은 그들의 주장을 뒷받침하고 있다. 2-DE를 이용하여 5, 10, 20 kD의 PEGs의 mono-PEGylate의 등전점과 분자량을 측정하였을 때 PEGylation 반응에 의해 pl 값은 변화하지 않았고 분자량만 증가하였다(Fig. 2). 동일한 pl 값은 column 상에서 같은 체류시간을 갖는 이온 교환 수지와의 동일한 전기적 결합을 의미한다.
측정하였다. 5, 10, 20 kD PEG와 mono-PEGylated된 IFN의 면역반응성은 각각 native IFN의 약 48%, 23%, 15%로 감소하였다. 또한 PEG와 결합되어 항체-항원 반응을 포함하는 단백질의 초기 활성이 감소되고, 그 양은 PEG 분자량과 비례한다는 이전의 연구와 동일하였다.
가 있다. 5, 10, 20 kD PEG의 mono-PEGylate의 수율은 각각 62, 58, 51%로 나왔다(미반응된 IFNe 약 32%였다). Liquidphase PEGylation의 경우 PEG 대 단백질의 비율이 낮을 경우 multi-PEGylate 보다 mono-PEGylate이 많았지 만, PEG 대 단백질의 비율이 5 이상이 되면 multi-PEGylate가 급격히 증가하여 mono-PEGylate를 회수하는데 많은 문제점이 있다(data not shown).
이번 IFN에 대한 실험에서도 같은 현상이 관찰되었다. 5, 10, 20 kD인 PEG와 mono-PEGylated된 IFN의 항바이러스성은 각각 native PEG의 약 70.6%, 55.3%, 21.3% 였다. IFN의 수용체 결합 도메인은 Cys 29 - Asp 35와 Phe 123 - Trp 140으로 보고되어 있다(14).
Trypsin 저항성과 온도 안정성은 mono-PEGylation에 의해 두드러지게 개선되었다. Solid-p뵤se PEGylation을 통해 종래의 액상 반응에서 나타날 수 있는 재현성 낮은 반응, 부 반응물 생성, 부 반응물 제거 공정 등의 단점을 극복할 수 있었다. 그러나 solid-phase PEGylation의 문제점인 액상 반응에 비교하여 많은 양의 PEG를 사용하여야 한다는 점은 개선되어야 한다.
6 Da)을 database를 통해 확인하고, tryptic digest 한 native IFN의 mass spectra# 확인한다. 마지막으로 N-terminal 서열을 확인하는 Edman de흥radation을 이용하여 FDNB (l-fluoro-2, 4-dinitrobenzene)의한peptide 결합 파괴가 일어나지 않는 것을 확인함으로써 N-tenninal 부위가 수식되었음을 확인할 수 있다.
둘째, 이 lysine 잔기들이 고체 담체에 의한 가림 현상으로 반응성 이 줄어들었을 수도 있다(13). 셋째, 단백질 이 고체 표면에 흡착하게 되어 PEG 분자들의 반응접촉 빈도가 액상에 비하여 줄어들었다.
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