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문제 정의
- 본 연구에서는 발아 검은 쌀로부터 분리한 올리고펩타이드(Oligosproutin®)를 이용 DNA microarray를 수행하여 각질형성세포의 유전자 발현에 미치는 영향을 살펴보았으며, 세포활성, HAS 유전자 발현, 세포내 항산화 효과와 피부 탄력 개선 효과를 관찰하였다. 발아 검은 쌀에서 분리한 Oligosproutin®의 DNA microarray 결과 다양한 유전자 변화가 나타났으며, 이중 HAS2 유전자 발현이 증가함을 확인하였다.
제안 방법
- 18, 000개 이상의 유전자를 함유한 human 1A oligo microarray (Agilent Technologies, Palo alto, CA. USA) slide를 이용하였다. 2 ㎕의 total RNA를 amino allyl messangeamp RNA kit (Ambion, Inc.
- USA) slide를 이용하였다. 2 ㎕의 total RNA를 amino allyl messangeamp RNA kit (Ambion, Inc. TX, USA) 으로 labeling하고 labeled cRNA 10㎕ 을 60℃ 에서 hybridiz- ation하였다. Microarry chip slide을 6 X SSPE, 0.
- 1% Pluronic F-127 (Molecular Probe)을 혼합한 후 4 μM 5- (6-chloromethyl) -2', T -dichloro-dihydro- fluoresceindiacetate (CM-H2DCFDA, Molecular Probe, Eug ene, OR, USA)를 처리하고 시료를 농도 별로 처리하였다. 37℃에서 반응 후 20 mj/cm2 U5B를 조사 후 Lumin-escence spectrophotometer (Perkin Elmer, UK)를 사용하여 DCF (Ex: 488 run, Em: 525 rm) 에 의한 세포내 형광값을 측정하였다[16, 17].
- DCFH의 산화로 생성된 DCF의 형광값을 측정한 실험으로 세포내에 생성된 산화적 스트레스를 실험하였다. DCFH는 hydroxyl radical, nitrogen oxide radical (NO .
- 3 mM CaCl2, 15 mM Glucose, 20 mM HEPES, 10 mM NaOH)로 세척하였다. HCSS에 0.1% Pluronic F-127 (Molecular Probe)을 혼합한 후 4 μM 5- (6-chloromethyl) -2', T -dichloro-dihydro- fluoresceindiacetate (CM-H2DCFDA, Molecular Probe, Eug ene, OR, USA)를 처리하고 시료를 농도 별로 처리하였다. 37℃에서 반응 후 20 mj/cm2 U5B를 조사 후 Lumin-escence spectrophotometer (Perkin Elmer, UK)를 사용하여 DCF (Ex: 488 run, Em: 525 rm) 에 의한 세포내 형광값을 측정하였다[16, 17].
- 005% N-Lauroyl sarcosine 용액으로 1 min 간 세척 후 700 rpm에서 5 min간 원심분리 하였다. Micro- array의 결과는 Axon Scanner GenePix 4000B (Axon Instruments, Inc. CA, USA)를 이용하여 스캔하고 Gene Pix Pro 3.0 (Axon Instruments, Inc. CA, USA)을 이용하여 분석하였다.
- Microairay를 통하여 Oligosproutin®가 HaCaT 세포주에서 HAS2의 발현을 증가시킴을 주목하고 이에 대한 재확인을 하고자 RT-PCR을 이용하여 HAS mRNA 발현을 하였다. HAS는 세포외 기질의 주요 성분 중 하나인 hy- aluronan을 합성하는 효소로 알려져 있다.
- 5 min, 72℃ 1 min, 26〜30 cycles로 반응시켰다. PCR 에 의하여 생성된 산물을 1.5% agarose gel에서 전기영동 하여 HAS1, 2, 3, GAPDH 유전자의 발현을 image anal yzer (BIS303PC, DNR Imaging Systems Ltd, UK) 로 확인하였으며, 각 band의 density는 densitometric program (NIH Image software, Maryland, USA)을 이용하였다. 각 유전자의 서열은 Table 1에 나타내었다.
- 5 μM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 4 unit Omniscript reverse transcriptase (Qiagen, Hilden, Germany) 로 37 ℃ 에서 60 min, 93 ℃ 에서 5 min heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다. PCR은 cDNA로부터 HAS1, 2, 3, GAPDH를 증폭하기 위하여 1 ㎕ cDNA, 0.5 μM의 5'과 S'primer, 10 X buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KC1, 0.1% Triton X-100), 200 dNTP, 25 mM MgCb, 2, 5 unit Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Germany)를 섞고 distilled water로 전체를 25 μL로 맞춘 다음 PCR을 실시하였다. PCR증폭은 94℃ 0.
- Total RNA추출은 RNeasy mini kit (Qiagen, Maryl and, USA)을 이용하였고, RNA의 순도를 확인하기 위하여 2, 100 Bioanalyer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 28S rRNA와 18S rRNA를 확인하였다.
- 발아된 검은 쌀을 마쇄하고 음건한 후 papain (30,000 usp-U/mg, Merck)을 처리하여 가수분해하였다. 가수분해물은 한외여과막 장치 (ultrafiltration membrane system, Millipore Co. Bedford, USA)를 사용하여 분자량이 1 kDa 이하의 가수분해물을 감압 농축하였다. 발아된 검은 쌀의 펩타이드 분자량은 gel permeation chromato graphy (GPC)를 이용하여 측정하였으며, 이동상을 초순수 용액으로 평형시킨 Shodex OHpak KB-804 column (0.
- 48 h의 경우에는 2배 이상 증가하는 유전자가 745개 이고 2 배 이상 감소하는 유전자는 1011개로 나타났다. 다양한 변화를 나타내는 유전자들을 세포고사(apoptosis), 세포주기 (cell cycle), 세포의 생리적 과정(cellular physiolosical process), 면역반응 (immune response), 스트레스 반응(response to stress), 신호전달(signal transduction) 등으로 분류하여 나타내었다(Table 1, 2).
- 발아 검은 쌀로부터 수득한 Oligosproutin®이 피부 각질형성세포인 HaCaT 세포주의 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보고자 5 mg/mL 농도의 Oligosproutin®을 HaCaT 세포주에 처리하고 0, 24, 48 h 배양 후 RNA를 분리하여 microarray를 실시하였다. Microarray를 실시한 24 h,48 h 배양한 Oligosproutin®의 signal intensity와 expies- sion ratio는 Figure 4에 MA plot으로 나타내 었다.
- 발아 검은 쌀로부터 올리고펩타이드를 제조하기 위하여 papain을 이용하여 가수분해하고 한외여과막 장치를 통하여 올리고펩타이드 얻었다(Figure 1). 수득한 올리고펩타이드의 분자량은 GPC를 통해 확인하였다.
- 발아된 검은 쌀을 마쇄하고 음건한 후 papain (30,000 usp-U/mg, Merck)을 처리하여 가수분해하였다. 가수분해물은 한외여과막 장치 (ultrafiltration membrane system, Millipore Co.
- Bedford, USA)를 사용하여 분자량이 1 kDa 이하의 가수분해물을 감압 농축하였다. 발아된 검은 쌀의 펩타이드 분자량은 gel permeation chromato graphy (GPC)를 이용하여 측정하였으며, 이동상을 초순수 용액으로 평형시킨 Shodex OHpak KB-804 column (0.8 x 30 cm, Showa Denko K.K., Tokyo, Japan) 을 이용하였으며, photo detector array (PDA)를 이용하여 210 ㎚에서 측정하였다. 분자량은 5종의 펩타이드 standard marker의 용출 부피를 도시하여 얻은 표준 곡선으로부터 결정하였다.
- , Tokyo, Japan) 을 이용하였으며, photo detector array (PDA)를 이용하여 210 ㎚에서 측정하였다. 분자량은 5종의 펩타이드 standard marker의 용출 부피를 도시하여 얻은 표준 곡선으로부터 결정하였다. 이때 standard marker는 angiotensin U ace tate (octapeptide, M.
- 세포 활성 측정은 mosmann[15]의 MTT [3-(4, 5-dimet- hylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide] 방법을 변형하여 실시하였다. HaCaT 세포주를 4 x 104 cells/ well 농도로 48-well plate의 well에 시료를 처리하여 CO2 배양기에서 48 h 배양하였다.
- 올리고펩타이드 얻었다(Figure 1). 수득한 올리고펩타이드의 분자량은 GPC를 통해 확인하였다. 시료를 동결 건조하고 0.
- 하였다. 시험 초기 (baseline), 2주, 4주, 6주에 항온항습실(온도 20 〜 22℃, 상대습도 40 〜 60%)에서 피검자는 세안 후 1 h 동안 피부를 안정화한 다음 측정을 수행하였다. 피부의 탄력도는 Cutometer SEM 474(Courage + Khazaka, Germany)로 눈가(crow's feet) 부위를 측정하였으며, 측정 시 음압은 500 mbar, 흡입 시간은 2 sec, 반복 측정 횟수는 5회로 측정하여 평균 수치를 이용하였다.
- 피부의 탄력도는 Cutometer SEM 474(Courage + Khazaka, Germany)로 눈가(crow's feet) 부위를 측정하였으며, 측정 시 음압은 500 mbar, 흡입 시간은 2 sec, 반복 측정 횟수는 5회로 측정하여 평균 수치를 이용하였다. 탄력개선효과 결과 분석은 Cutometer의 측정 매개변수 중 피부점탄성(Uv/Ue)과 탄력회복력(Ur/Uf)을 이용하여 측정, 분석하였다.
- 시험 초기 (baseline), 2주, 4주, 6주에 항온항습실(온도 20 〜 22℃, 상대습도 40 〜 60%)에서 피검자는 세안 후 1 h 동안 피부를 안정화한 다음 측정을 수행하였다. 피부의 탄력도는 Cutometer SEM 474(Courage + Khazaka, Germany)로 눈가(crow's feet) 부위를 측정하였으며, 측정 시 음압은 500 mbar, 흡입 시간은 2 sec, 반복 측정 횟수는 5회로 측정하여 평균 수치를 이용하였다. 탄력개선효과 결과 분석은 Cutometer의 측정 매개변수 중 피부점탄성(Uv/Ue)과 탄력회복력(Ur/Uf)을 이용하여 측정, 분석하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 HaCaT 사람 각질형성 세포주는 dul- beccos modification of eagles medium (DMEM, BioWh ittaker, MD. USA) 에 10% fetal bovine serum (FBS, BioWhittaker, MD. USA), 1% penicillin-streptomycin (BioWhittaker, MD USA)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하고 trypsinization으로 계대 배양한 뒤 세포를 실험에 이용하였다. '
- 연구대상은 건강한 30 〜 40대 성인 남녀 10명을 대상으로 하였다. 시험 초기 (baseline), 2주, 4주, 6주에 항온항습실(온도 20 〜 22℃, 상대습도 40 〜 60%)에서 피검자는 세안 후 1 h 동안 피부를 안정화한 다음 측정을 수행하였다.
- 분자량은 5종의 펩타이드 standard marker의 용출 부피를 도시하여 얻은 표준 곡선으로부터 결정하였다. 이때 standard marker는 angiotensin U ace tate (octapeptide, M.W. 1, 046), methionine enkephalin Acetate (pentapeptide, M.W. 574), leucine enkephalin (pentapeptide, M.W. 556), Val-Tyr-Val (M.W. 380), Gly-Tyr (M.W. 238)를 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균 ± 표준편차로 표기하였고 통계적 유의성은 Student's t-test로 하였으며 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
- Cell proliferation effect of Oligosproutin® on HaCaT cells. The cell proliferation was determined by the MTT assay. The results are expressed as the percentage of the control and values represent the mean ± S.
성능/효과
- 이용하여 피부의 탄력도를 측정한 결과 Figure 7(a)에 나타난 피부 점탄성을 나타내는 UvAJe 측정 시 Oli- gosproutin®를 첨가한 제품을 도포한 결과 도포 시간이 지날수록 측정값이 낮아져 탄력이 개선되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, 피부의 탄력 회복력(Ur/Uf)을 Figure 7(b)에 나타난 것과 같이 도포 6주 후 탄력회복력이 개선되는 것을 확인할 수 있었다.
- 발아 검은 쌀에서 분리한 Oligosproutin®의 DNA microarray 결과 다양한 유전자 변화가 나타났으며, 이중 HAS2 유전자 발현이 증가함을 확인하였다. HaCaT 세포주에서 Oligosproutin®를 처리시 세포활성 41% 증가하였고, RT-PCR을 통한 HAS mRNA 발현에서는 HAS2 mRNA 유전자가 2.8 배 증가함을 확인하였다. 또한 세포내 항산화 효과를 측정한 결과 약 50%의 세포내 프리라디칼 소거 효과를 나타내었다.
- Microarray를 실시한 24 h,48 h 배양한 Oligosproutin®의 signal intensity와 expies- sion ratio는 Figure 4에 MA plot으로 나타내 었다. HaCaT 세포주에서 Oligosproutin®을 처리하고 24 h 배양한 경우 보다 48 h 배양하였을 경우 유전자의 발현 증가 폭이 더 커짐을 확인할 수 있었다. HaCaT 세포주에서 Oligosproutin®을 처리하고 24 h 배양한 경우 유전자의 발현이 2배 이상 증가하는 유전자는 76개 였으며, 2배 이상 감소하는 유전자는 42개 였다.
- 또한 세포내 항산화 효과를 측정한 결과 약 50%의 세포내 프리라디칼 소거 효과를 나타내었다. Oligosproutin®를 5% 함유한 O/W 에멀젼을 이용한임상실험에서는 피부 점탄성 및 탄력회복력 개선효과가우수하게 나타났다. 이상의 '결과를 종합하여 볼 때 발아 검은 쌀로부터 분리한 Oligosproiltin®는 피부 탄력 개선을 주는 항노화 화장품 개발에 응용될 수 있을 것이라 기대된다.
- 5 × 50 cm)에 1 mL 주입한 후, 상온에서 20 mL/h의 유속으로 전개하고 3 mL 씩 분취하였다. 그 결과, elution volume 이 약 80, 180, 200, 320 및 400 mL 부근에서 5개의 분획을 확인할 수 있었으며, 5개의 분획 중 standard marker 펩타이드의 elution volume (data not Slown)을 기준으로 약 850 daltons 정도의 분자량을 가지는 펩타이드인 올리고펩타이드(Oligosproutin®)를 얻었다(Figure 2).
- 또한, 피부의 탄력 회복력(Ur/Uf)을 Figure 7(b)에 나타난 것과 같이 도포 6주 후 탄력회복력이 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, Oligosproutin®는피부에 도포 시 피부점탄성 및 탄력회복력 개선효과가 우수한 것으로 나타났다.
- 8 배 증가함을 확인하였다. 또한 세포내 항산화 효과를 측정한 결과 약 50%의 세포내 프리라디칼 소거 효과를 나타내었다. Oligosproutin®를 5% 함유한 O/W 에멀젼을 이용한임상실험에서는 피부 점탄성 및 탄력회복력 개선효과가우수하게 나타났다.
- 또한, HaCaT 세포주에서 Oligosproutin®가 HASl, HAS2, HAS3 mRNA 발현에 미치는 영향을 알아보고자 RT-PCR을 수행한 결과 HAS1, HAS3 mRNA 발현에는 영향을 나타내지 않았으며, HAS2 mRNA발현은 Oligosproutin® 처리 농도별로 증가함을 확인할 수 있었다(Figure 5
- 발아 검은 쌀로부터 수득한 Oligosproutin®이 피부 구성 세포인 HaCaT 세포주의 세포활성에 미치는 영향을 알아보고자 Oligosproutin®을 HaCaT 세포주에 처리하여 세포 활성을 측정한 결과 무처리군에 비하여 배양 24 h에서는 5 mg/mL 농도에서 21%의 세포활성 증가를 나타내었으며, 배양 48 h에서는 5 mg/mL 농도에서 41%로 가장 우수한 세포활성 증가를 나타내었다(Figure 3).
- 피부 탄력 개선 효과를 관찰하였다. 발아 검은 쌀에서 분리한 Oligosproutin®의 DNA microarray 결과 다양한 유전자 변화가 나타났으며, 이중 HAS2 유전자 발현이 증가함을 확인하였다. HaCaT 세포주에서 Oligosproutin®를 처리시 세포활성 41% 증가하였고, RT-PCR을 통한 HAS mRNA 발현에서는 HAS2 mRNA 유전자가 2.
- 본 연구에서는 발아 검은 쌀에서 분리한 올리고펩타이드를 사람 각질형성세포에 처리하여 유전자 발현에 미치는 영향을 DNA microarray를 수행하여 살펴본 결과 hyaluronan synthase 2 유전자 발현이 증가함을 확인하였다. 또한 각질형성세포에서 올리고펩타이드를 처리 시에는 세포활성이 증가하고, 세포내 활성산소를 소거하는 효과를 나타냈으며 , 임상실험에서는 올리고펩타이드를 함유한 O/W에멀젼을 피부에 도포하여 피부 탄력의 개선효과를 확인하였으며 향후 항노화 화장품 개발에 응용될수 있을 것이라 기대된다.
- DCFH는 세포고사 동안 세포내 산화적 스트레스를 평가하는데 사용되어져 왔으며, H2O2나 자외선에 의해 생성된 라디칼 및 세포내 신호전달과 관련된 연구에 최근 사용되고 있다[19]. 형광 분광광도계를 이용하여 세포가 well plate에 부착되어 살아있는 상태에서의 형광값을 측정 한 결과, HaCaT 세포주를 배양함으로써 세포자체의 생리작용에 의한 기본적인 형광값과 비교하여 자외선 (UVB 20 mj/㎠) 조사 결과 약 1.8배 정도 증가함을 알수 있었다. 이 조건에서 Oligosproutin®을 농도 별로 처리한 결과 자외선에 의해 높아졌던 형광값이 농도 의존적으로 다시 감소하였으며, 10 mg/mL 농도로 처리시 48%의 프리라디칼 소거효과를 나타내었다(Figure 6).
후속연구
- 또한 각질형성세포에서 올리고펩타이드를 처리 시에는 세포활성이 증가하고, 세포내 활성산소를 소거하는 효과를 나타냈으며 , 임상실험에서는 올리고펩타이드를 함유한 O/W에멀젼을 피부에 도포하여 피부 탄력의 개선효과를 확인하였으며 향후 항노화 화장품 개발에 응용될수 있을 것이라 기대된다.
- Oligosproutin®를 5% 함유한 O/W 에멀젼을 이용한임상실험에서는 피부 점탄성 및 탄력회복력 개선효과가우수하게 나타났다. 이상의 '결과를 종합하여 볼 때 발아 검은 쌀로부터 분리한 Oligosproiltin®는 피부 탄력 개선을 주는 항노화 화장품 개발에 응용될 수 있을 것이라 기대된다.
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