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문제 정의
- 특히 식물성 천연물을 이용하여 인체 피부에 유용한 생리활성을 조절하는 물질이나 항산화, 광보호, 항염, 항균 효능 등 기능성 원료를 탐색하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 여드름 유발 균주에 대한 항균 활성이 우수한 천연물질을 탐색하기 위하여 민간 및 한방 요법의 약재로서 오래 전부터 사용되어 온 선학초를 이용하여 여드름 균에 대한항균 활성을 평가하여 보았다. 선학초 추출물을 이용하여 P.
- 본 연구에서는 항바이러스, 항염, 항균 효능이 있는 것으로 보고된 선학초 추출물을 이용하여 일반 호기성 세균과 여드름 균에 대한 항균효능을 비교 검토하였고 추출물에 대한 안전성을 평가한 결과 항여드름 효능 및 안정성이 우수하였음을 확인하였고, 그에 따른 연구 결과를 보고하고자 한다.
- 선학초 추출물이 온도 및 pH의 변화에 안정성이 있는지를 확인하여 보았다. 다양한 범위로 온도(70, 80, 90, 100, 121℃)나 pH(2~12)를 변화시켜서 시료를 반응시킨 후 paper disk diffusion 법에 의해 항균활성을 측정한 결과, 이들 추출물들은 온도(Table 3) 및 pH (Table 4)의 변화에 높은 안정성을 보여주는 것으로 나타났으며 이 결과는 선학초 추출물이 화장품 원료로 유용하게 쓰일 수 있음을 시사하고 있다.
제안 방법
- 72 h 전 배양한 P. acnes균 현탁액을 5 mL의 RC broth배지에 100μl (배지의 2%)씩 접종한 tube에 대조군으로 DMSO 200 μL를 넣어주고 시험군에는 DMSO에 다양한 농도(7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250 μg/mL)로 준비한 선학초 추출물을 각 농도별로 200 μL씩을 넣어주고 잘 섞어 주었다. 시료처리 후, 바로 96-well plate에 각 tube 별로 200 μL씩 취하여, ELISA reader를 이용하여 620 nm의 파장에서 흡광을 측정하였고, 각 tube는 anaerobic jar에서 gas pack system을 이용하여 37℃ 에서 혐기성 배양하여 주면서 12 h 간격으로 흡광을 측정하여 시간경과에 따른 농도별 균 생장 억제정도를 측정하였다.
- 이용하였다. P. acnes 균주를 RC 액체배지에서 3일간 배양한 후 균 현탁액을 일정한 농도(optical density 620 nm에서 흡광값 0.5)로 조절한 후 멸균된 면봉을 이용하여 RC agar plate에 균일하게 균을 도말해 주었다. Plate를 건조시킨 후 paper disk (ψ 8 mm, Adventec.
- 대조군으로 선학초 추출물이 들어 있지 않은 10% DMSO를 사용하였다. 균 희석액 및 시료를 접종한 96-well plate를 anaerocult® Gaspack system을 이용하여 3일간 배양한 후 균의 생육이 나타나지 않는 최소 농도를 MIC로 결정하였다. 호기성 균주에 대한 MIC 평가는 Mueller-Hinton 배지를 사용하여 여드름균과 동일한 방법을 사용하였으며 37℃ incubator에서 24 h 배양 후 결정하였다.
- 선학초 crude 추출물을 농도별(7.8, 15.6, 31, 62, 125, 250 μg/mL)로 RC 배지에 첨가하고, P. acnes 균을 접종하여 3일간 배양하면서 12 h 간격으로 균주의 생장 정도를 측정하여 Figure 2와 같은 생장곡선을 구할 수 있었다. 대조군으로는 아무 것도 처리하지 않은 여드름균과 시료를 희석할 때 사용한 DMSO를 여드름균에 처리한 2 종류를 사용하여 측정하였는데, 이들 대조군 모두 배양 24 h 후부터 균이 기하급수적으로 증식하기 시작하였으며, 약 60 h 배양하면 대수기(log phase)에 도달하는 것을 관찰할 수 있었다.
- 선학초 추출물을 20 mg/mL의 농도로 DMSO에 녹인 후, 1.5 mL microfuge tube에 넣어 주고, 70, 80, 90, 10 이의 항온수조에서 70 min간, autoclave (121℃)에서 15 min간 정치한 후, 이들 시료를 이용하여 paper disk diffusion method를 수행하였다.
- 5 ~ 500 μg/mL of DMSO) 50 μL씩 흡수시켰다. 시료가 처리된 plate를 anaerobic jar에서 Gaspack system을 이용하여 3일간 배양한 후 disk 주위의 생육 억제환의 크기로 항균 활성을 측정하였다. 호기성 균주에 대한 항균활성 평가는 Mueller-Hinton 배지를 사용하여 여드름균과 동일한 방법을 사용하였으며 37℃ incubator에서 24 h 배양 후 측정하였다.
- 5, 125, 250 μg/mL)로 준비한 선학초 추출물을 각 농도별로 200 μL씩을 넣어주고 잘 섞어 주었다. 시료처리 후, 바로 96-well plate에 각 tube 별로 200 μL씩 취하여, ELISA reader를 이용하여 620 nm의 파장에서 흡광을 측정하였고, 각 tube는 anaerobic jar에서 gas pack system을 이용하여 37℃ 에서 혐기성 배양하여 주면서 12 h 간격으로 흡광을 측정하여 시간경과에 따른 농도별 균 생장 억제정도를 측정하였다.
- 05% (500 μg/mL)로 관찰되었다(Table 2). 항균대조군으로는 triclosan과 방부제로 사용하고 있는 methyl paraben (MP)을 사용하였는데 triclosan에 대한 MIC는 0.004% (40 μg/mL), MP에 대한 MIC는 실험에 사용한 모든 균주에서 0.2% (2 mg/mL)로 측정되었다. MIC 결과들이 paper disk법에 의한 실험결과와 약간씩의 차이를 보이는 것은 두 실험방법에 따른 살균원리의 차이에서 생겨나는 오차이기 때문에 큰 유의성을 갖고 있지는 않는 것으로 여겨진다.
대상 데이터
- 05%의 농도에서는 36 mm로 커지는 것을 볼 수 있었다. 대조군으로 사용한 triclosan은 0.025%의 농도에서 선학초 0.05%의 농도와 비슷한 항균활성을 나타냈다 (Table 1). 호기성 균주들과의 항균활성 비교를 위해 0.
- 선학초 추출물(20 mg/mL of DMS0)을 RC 액체 배지를 이용하여 2배수씩 희석 (two-fold serial dilution)하여 농도별로 균주와 배지가 들어있는 96-well plate에 20 μL씩 넣어 주고 잘 섞어 주었다. 대조군으로 선학초 추출물이 들어 있지 않은 10% DMSO를 사용하였다. 균 희석액 및 시료를 접종한 96-well plate를 anaerocult® Gaspack system을 이용하여 3일간 배양한 후 균의 생육이 나타나지 않는 최소 농도를 MIC로 결정하였다.
- 본 실험에 사용된 균주는 여드름의 원인균인 Propio- nibacterium acnes KCTC3314와 호기성 그람 양성 균주인 Staphylococcus epidermidis KCTC1917, Staphyloc occus aureus KCTC1927, Bacillus subtilis KCTC1021, Bacillus cereus KCTC1012를 한국유전자 은행에서 분양받아 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 선학초(A pilosa L.)는 강원도 춘천대광약업사에서 건조 상태의 전초를 구입하여 분쇄기를 이용하여 분말로 만들고 메탄올(1:20, w/v)로 추출한 후 농축하여 필요한 실험에 사용하였다.
- acnes는 4℃에서 보관하면서 실험 3일전에 활성화 시켰으며, 균을 배양 배지에 접종한 후 anaerobic jar에서 Gaspack system (Merck Anaerocult® Gaspack system, Germany) 을 이용하여 밀봉하여 37℃ incubator에서 3일 동안 혐기성 배양하였다. 호기성 균주들은 Mueller-Hinton 배지 (Merck, Germany)# 사용하였으며 균을 접종한 후 37℃ incuba- tor에서 24 h 배양하면서 사용하였다.
이론/모형
- 선학초 추출물을 10 mg/mL의 농도로 DMSO에 녹인후, 15 mL conical tube에 넣어주고 pH를 2 ~ 12의 범위로 조절하여 30 min간 정치한 후, 이들 시료를 이용하여 paper disk diffusion method를 수행하였다.
- 선학초 추출물의 항균활성 평가는 paper disk diffusion 법을 이용하였다. P.
- 균 희석액 및 시료를 접종한 96-well plate를 anaerocult® Gaspack system을 이용하여 3일간 배양한 후 균의 생육이 나타나지 않는 최소 농도를 MIC로 결정하였다. 호기성 균주에 대한 MIC 평가는 Mueller-Hinton 배지를 사용하여 여드름균과 동일한 방법을 사용하였으며 37℃ incubator에서 24 h 배양 후 결정하였다.
- 시료가 처리된 plate를 anaerobic jar에서 Gaspack system을 이용하여 3일간 배양한 후 disk 주위의 생육 억제환의 크기로 항균 활성을 측정하였다. 호기성 균주에 대한 항균활성 평가는 Mueller-Hinton 배지를 사용하여 여드름균과 동일한 방법을 사용하였으며 37℃ incubator에서 24 h 배양 후 측정하였다.
성능/효과
- MIC 결과들이 paper disk법에 의한 실험결과와 약간씩의 차이를 보이는 것은 두 실험방법에 따른 살균원리의 차이에서 생겨나는 오차이기 때문에 큰 유의성을 갖고 있지는 않는 것으로 여겨진다. Paper disk diffusion법과 MIC 평가에서도 선학초 추출물이 여드름에 대해 높은 항균 활성을 갖고 있는 것으로 확인되었으며, 이는 추출물에 포함되어 있는 항균물질들이 각 균주의 세포막에 강한 투과성을 가지고 있어서 세포막을 파괴하게 되고 이로 인해 세포내부 환경의 변화를 주게 되고 결국 세균은 사멸하게 되는 것으로 여겨진다. 특히 hexane 등을 이용한 선학초 추출물의 일부 분획에서는 crude extracts 보다 여드름균에 대한 항균활성이 더 강력한 것을 관찰할 수 있었지만(data not shown), 분획 추출에 따른 여러 공정과 회수율의 저하 등 실제적인 화장품 원료로서의 개발에는장애가 될 수 있을 것으로 여겨진다.
- 있었다. Paper disk 법을 사용한 P. ames균에 대한 항균 활성은 선학초 추출물의 농도가 증가할수록 inhibition zone의 크기가 증가하였는데, 0.006%의 농도에서 25 mm였던 것이 농도가 증가할수록 항균활성이 높아져 최대처리 농도였던 0.05%의 농도에서는 36 mm로 커지는 것을 볼 수 있었다. 대조군으로 사용한 triclosan은 0.
- 확인하여 보았다. 다양한 범위로 온도(70, 80, 90, 100, 121℃)나 pH(2~12)를 변화시켜서 시료를 반응시킨 후 paper disk diffusion 법에 의해 항균활성을 측정한 결과, 이들 추출물들은 온도(Table 3) 및 pH (Table 4)의 변화에 높은 안정성을 보여주는 것으로 나타났으며 이 결과는 선학초 추출물이 화장품 원료로 유용하게 쓰일 수 있음을 시사하고 있다.
- acnes 균을 접종하여 3일간 배양하면서 12 h 간격으로 균주의 생장 정도를 측정하여 Figure 2와 같은 생장곡선을 구할 수 있었다. 대조군으로는 아무 것도 처리하지 않은 여드름균과 시료를 희석할 때 사용한 DMSO를 여드름균에 처리한 2 종류를 사용하여 측정하였는데, 이들 대조군 모두 배양 24 h 후부터 균이 기하급수적으로 증식하기 시작하였으며, 약 60 h 배양하면 대수기(log phase)에 도달하는 것을 관찰할 수 있었다. 시험군의 경우 시료를 농도별로 처리하여 보면 24 h 배양할 때까지는 전체적으로 균의 증식이 억제되었지만 36 h 배양하게 되면 저농도(7.
- 본 연구에서는 여드름 유발 균주에 대한 항균 활성이 우수한 천연물질을 탐색하기 위하여 민간 및 한방 요법의 약재로서 오래 전부터 사용되어 온 선학초를 이용하여 여드름 균에 대한항균 활성을 평가하여 보았다. 선학초 추출물을 이용하여 P. qctms에 대한 MIC 값은 0.05 mg/mL로 측정되었으며, paper disk diffusion법에서도 높은 활성을 보였는데, 시료가 선학초 전초에 대한 crude extract임을 고려하면 매우 항균활성이 높은 것으로 평가되었다. 선학초 추출물의 온도, pH 안정성을 평가한 결과, 70, 80, 90, 100, 12VC 등 다양한 온도 조건과 pH 2~pH 12의 변화에 있어서도 그 효능이 변하지 않고 안정된 상태로 유지되는 것으로 관찰되었다.
- 05 mg/mL로 측정되었으며, paper disk diffusion법에서도 높은 활성을 보였는데, 시료가 선학초 전초에 대한 crude extract임을 고려하면 매우 항균활성이 높은 것으로 평가되었다. 선학초 추출물의 온도, pH 안정성을 평가한 결과, 70, 80, 90, 100, 12VC 등 다양한 온도 조건과 pH 2~pH 12의 변화에 있어서도 그 효능이 변하지 않고 안정된 상태로 유지되는 것으로 관찰되었다. 따라서 선학초 추출물은 여드름 균 억제제 및 치료제에 관련된 기능성 화장품 원료로서의 개발 가능성이 높은 것으로 기대된다.
- 대조군으로는 아무 것도 처리하지 않은 여드름균과 시료를 희석할 때 사용한 DMSO를 여드름균에 처리한 2 종류를 사용하여 측정하였는데, 이들 대조군 모두 배양 24 h 후부터 균이 기하급수적으로 증식하기 시작하였으며, 약 60 h 배양하면 대수기(log phase)에 도달하는 것을 관찰할 수 있었다. 시험군의 경우 시료를 농도별로 처리하여 보면 24 h 배양할 때까지는 전체적으로 균의 증식이 억제되었지만 36 h 배양하게 되면 저농도(7.8 μg/ mL)에서는 증식이 점차 증가되기 시작하였고, 60 h 배양 이후부터는 대부분의 농도범위에서 조금씩 증가하는 것으로 관찰되었지만 고농도의 시료가 포함되어있는 경우에는 증가폭이 그다지 크지 않은 것을 확인할 수 있었다.
- 여드름균에 대한 선학초 추출물의 MIC를 측정한 결과 0.005% (50 μg/mL)의 농도임을 알 수 있었으며, 호기성균주들의 선학초 추출물의 MIC 측정 결과는 paper disk dilution 법에 의한 결과와 유사하였는데 S. epidermidis 의 MIC는 0.2% 였으며 나머지 균주들은 0.01% (100 μg/ mL) ~ 0.05% (500 μg/mL)로 관찰되었다(Table 2). 항균대조군으로는 triclosan과 방부제로 사용하고 있는 methyl paraben (MP)을 사용하였는데 triclosan에 대한 MIC는 0.
- 05%의 농도와 비슷한 항균활성을 나타냈다 (Table 1). 호기성 균주들과의 항균활성 비교를 위해 0.05%의 농도를 각 균주에 처리해 준 결과 선학초 추출물은 여드름균에 가장 높은 항균활성을 보였는데, S. epi~ dermidis는 14 mm의 크기로 활성이 비교적 낮았으며, 나머지 균주들은 모두 20 mm의 범위내에 있는 것으로 관찰되었다 (Figure 1).
후속연구
- 선학초 추출물의 온도, pH 안정성을 평가한 결과, 70, 80, 90, 100, 12VC 등 다양한 온도 조건과 pH 2~pH 12의 변화에 있어서도 그 효능이 변하지 않고 안정된 상태로 유지되는 것으로 관찰되었다. 따라서 선학초 추출물은 여드름 균 억제제 및 치료제에 관련된 기능성 화장품 원료로서의 개발 가능성이 높은 것으로 기대된다.
- 일반적으로 세균의 세포막을 파괴하여 세균을 사멸시키는 기작을 응용하여 화장품에 응용되고 있는 방부제나 항균제들은 직접적으로 인체 피부와 접촉하여 반응하게 되므로 인체 피부에 영향을 주지 않는 가능한 한 최소량을 사용하여 최대의 효과를 얻을 수 있는 물질을 선택 사용하는 것이 중요하다. 이런 관점에서 살펴보면 본 실험에 대조군으로 사용된 호기성 균주들의 경우에도 여드름균에 비해 항균활성은 떨어지지만 비교적 우수한 항균활성 을 나타내고 있으며, 현재 사용되고 있는 방부제나 항균제가 평균적으로 0.2~0.4% 정도의 농도 범위 내에서 사용하고 있는 것을 감안하면 균주에 따라 보다 더 적은 농도를 사용하여도 우수한 천연 방부제나 항균제로서 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
- 특히 hexane 등을 이용한 선학초 추출물의 일부 분획에서는 crude extracts 보다 여드름균에 대한 항균활성이 더 강력한 것을 관찰할 수 있었지만(data not shown), 분획 추출에 따른 여러 공정과 회수율의 저하 등 실제적인 화장품 원료로서의 개발에는장애가 될 수 있을 것으로 여겨진다. 이상의 결과로 보았을 때 선학초 추출물은 우수한 항여드름균 활성을 갖고 있는 것으로 사료되어 여드름 관련 화장품 원료로서의 개발가능성을 시사하고 있다.
- Paper disk diffusion법과 MIC 평가에서도 선학초 추출물이 여드름에 대해 높은 항균 활성을 갖고 있는 것으로 확인되었으며, 이는 추출물에 포함되어 있는 항균물질들이 각 균주의 세포막에 강한 투과성을 가지고 있어서 세포막을 파괴하게 되고 이로 인해 세포내부 환경의 변화를 주게 되고 결국 세균은 사멸하게 되는 것으로 여겨진다. 특히 hexane 등을 이용한 선학초 추출물의 일부 분획에서는 crude extracts 보다 여드름균에 대한 항균활성이 더 강력한 것을 관찰할 수 있었지만(data not shown), 분획 추출에 따른 여러 공정과 회수율의 저하 등 실제적인 화장품 원료로서의 개발에는장애가 될 수 있을 것으로 여겨진다. 이상의 결과로 보았을 때 선학초 추출물은 우수한 항여드름균 활성을 갖고 있는 것으로 사료되어 여드름 관련 화장품 원료로서의 개발가능성을 시사하고 있다.
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