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문제 정의
- 3(%) 로 감소되었다(Table 1). 따라서 본 실험에서는 세포독성의 영향을 받지 않는 농도인 100/zg/me 이하의 砂仁을 使用하여 砂仁이 AD 유발인자에 미치는 영향을 살펴보았다.
- 이에 著者는 砂仁이 AD에 미치는 영향을 실험적으로 입증하고자, PC-12 세포주에서 APP, AChE, GFAP mRNA와 THP-1 세포주에서 IL-lpz IL-6, TNF-a 등의 proinflammatory cytokine mRNA 발현을 관찰하였고, PC-12 세포주 세포성 단백질에서 AChE 활성도를 관찰하였으며, scopolamine으로 유도된 기억력감퇴 白鼠 모델의 혈청내 glucose, uric acid, AChE에 대한 砂仁 의 효능을 관찰하였고 Moris water maze 틀 이용하여 VIDEOTRACK을 통한 생쥐의 행동 변화를 측정한바 유의한 결과를 얻었으므로 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- " data-before="IL" data-ocr-fix="">Ⅱ.-6의 proinflammatory cytokine의 발현을 억제하였고, 세포성 단백질 수준에서 AChE의 활성을 감소시켰으며, scopolamine으로 유도된 기억력감퇴 白鼠 모델의 혈청내 uric acid와 AChE를 감소시켰으며 Morris water maze 실험에서 scopolamine으로 유도된 생쥐의 기억력감퇴를 개선시켰다.
- 30주령 SD계 백서 5마리를 1군으로 하여 아무런 처리를 하지 않은 대조군, TacTine(10㎎/㎏)을 경구투여한 양성대조군, 砂 仁 추출물(75tng/kg)을 10일 동안 경구 투여한 실험군 3개 군으로 나누고, scopolamine(l㎎/㎏)을 7일간 1일 1회 복강 주사 후 심장 천자법으로 혈액을 채혈하여 혈청을 분리하였다.
- AChE 활성도는 ch이inesterase kit로 측정하였다. 혈청 중 AChE 활성도를 측정하기 위하여 test tube와 blank tube를 표시히■고, test tube에 sodium chloride solution(cat.
- PC-12 세포주는 24 w미Is plate에 2X106세포를 각각 분주한 후 12시간 이상 우태아 혈청 결핍 DMEM배지에서 배양한 후 砂 仁 추출물을 100/zg/1的g/畝과 以g/畝의 농도로 첨가하고 1 시간 후 P-amyloid(AP) 1011M를 처리하여 6시간 동안 동시 배양하였다.
- PC-12 세포주에 砂仁 추출물(IO。!死/m们 10您/印.们 應/【业)을처리하고 1시간 후 A0(lOiiM)를 첨가하여, 24시간 동시 배양한 후 세포 용해액을 얻어 AChE 활성도를 측정하였다. 세포 용해액을 얻기 위하여 50以의 lysis 완충용액(Tris-HCl(200mM, pH8.
- PC-12 세포주와 mLFC는 37℃, 5% CO2 배양기에서 자란 것을 Trysin-EDTA 용액으로 단일 세포들이 되도록 떼어내고, 2.0灯04개의 세포를 96 w이Is plate에 분주하고 배양기(37笆, 5% C6)에서 2시간 배양한 후 砂仁 추출물(최종 농도 400^/ml 20(川g/畝, 100//g/ 50俸/【畝 10/zg/ mt 以g/m幻을 48시간 동안 처리하였다. 배양종료 후에 배양액을 버리고 PBS로 2회 세척한다 각 well에 50% TCA(trichloroacetic acid) 50成를 가하고 1시간 동안 4℃에 방치한다.
- PCRe Primus 96 Legal PCR system을 이용하여 수행한다. 반응은 이미 합성된 3以의 cDNA를 주형으로 사용하고, 주형에 대한 primer는 interleukin-lp(IL-1 P), IL-6, Tumor necrosis factor(TNF)-az P-actin, APP, AChE, GFAP 그리고 G3PDH를 증폭하기 위하여 sense primer(20pmole/成)와 antisense primer(20pmole/ /成)를 혼합하여 1/况를 가하고, 다시 3成 2.
- THP-1(ATCC, TIB-202) 세포주는 acute monocytes 로 DMEM에 10% 우태아 혈청, penicillin (100U/me)z streptomycin (100/zg/그리고 10陽/畝의 gentamycinO] 함유된 배양액에 95% air/5% C6 인 37℃ 배양기에서 배양한 것에 lipopolysacchride(LPS) 2俸/戒를 동시 처리하여 proinflamatory cytokine을 유발시켰다. 砂仁 추출물은 처리 1시간 전에 Hank怎 balance salt solution (HBSS)으로 세척한 후에 우태아 혈청 결핍 DMEM배지에 10%g/畝, 10俸/或 以g/圳의 농도로 첨가하여 6 시간 동안 배양하였다.
- 砂仁 200g에 증류수 L300砒을 가하여 열탕 추출기에서 3시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류장치로 농축하고, 이를 다시 동결 건조기를 이용하여 완전 건조하여 얻은 砂仁 추출물을 냉동(-84℃) 보관하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.
- 유발시켰다. 砂仁 추출물은 처리 1시간 전에 Hank怎 balance salt solution (HBSS)으로 세척한 후에 우태아 혈청 결핍 DMEM배지에 10%g/畝, 10俸/或 以g/圳의 농도로 첨가하여 6 시간 동안 배양하였다.
- polymerase(5U/成)를 첨가한 다음 최종 부피가 30必가 되도록 멸균증류수를 가하고 pre-denaturation(95℃, 5분), denaturation(95℃), annealing(55℃, 1분), elongation(72℃/ 1분)을 25회 시행한 뒤 post-elongation을 72 ℃ 에서 3분 동안의 조건으로 PCR을 수행한다. 각 PCR products는 20汝씩 1.2% agarose gel에 loading하여 120 V 조건에서 20분간 전기영동을 통하여 분석하였다.
- 1 주일간 Morris water maze에서 1일 1회 반복학습시 30초 이내에 p。이에서 platform으로 올라가는 생쥐를 선별하였다. 선별된 ICR계 생쥐 10마리를 한 군으로 하여 대조군, 양성대조군(tacrine 10㎎/㎏ p.o), 실험군(砂仁 75㎎/㎏ p.o)으로 분류하였고, 21일간 계속 약물 투여와 platform에 오르는 반복훈련을 실시하였다.
- 세포독성방법은 SRB assay법助을 약간 변형하여 실험에 사용하였다. PC-12 세포주와 mLFC는 37℃, 5% CO2 배양기에서 자란 것을 Trysin-EDTA 용액으로 단일 세포들이 되도록 떼어내고, 2.
- 이에 著者는 砂仁의 痴呆에 대한 효과롤 알아보고자, PC-12 세포주에서 APP, AChE, GFAP의 유전자 발현과 AChE의 활성도를 관찰하였고 THP-1 세포주에서 IL-1P, IL-6, TNF-a 등의 유전자 발현을 관찰하였으며, scopolamine으로 처리한 백서에서의 血淸內 glucose, uric acid, AChE 를 측정하였으며, 역시 scopolamine으로 처리한 생쥐에서 Morris water maze를 통한 행동의 변화를 관찰하였다.
- 혈청중 glucose, uric acid치는 자동생화학분석기 (Express 550)를 사용하여 측정하였다.
- 훈련과 약물 투여가 종료된 ICR계 생쥐에 scopolamine(lmg /kg)을 복강 주사하고 30분 후에 water maze에 ICR계 생쥐를 한 마리씩 넣고 VIDEOTRACK으로 행동을 측정하였고, 이를 videotrack software로 분석하였다.
대상 데이터
- PC-12(ATCC, CRL1721) 세포주는 rat 의 adrenal pheochromocytoma에서 유래된 세포로 DMEM에 10% 말 혈청과 5% 우태아 혈청으로 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 砂仁(Amomum villosum ; AMV)은 대전대학교 부속한방병원에서 구입한 것을 정선하여 사용하였다.
- 본 실험을 위하여 사용된 International Cancer Research(ICR)계 생쥐와 Sprague-Dawley(SD)계 백서는 한국 생명과학연구원에서 분양 받아 1주 이상 적응시킨 후 실험에 사용하였으며 실험당일까지 고형사료(조단백질 221%이상, 조지방 8.0%이하, 조섬유 5.0%이하, 조회분 8.0%이하, 칼슘 0.6%이상, 인 0.4%이상, 삼양사, Korea)와 물을 충분히 공급하고 실온 22±2t 를 계속 유지하고 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다
- 본 연구에 사용된 기기는 spectrophotometer(shimazue/ Japan), rotary vaccum evaporator(BUCHI B-480, Switzerland), freeze dryer(EYELA FDU-540, Japan), centrifuge(sigmaz U.S.A.), Bio-fi■은 ezer(sanyo, Japan), Primus 96 thermocycler system(MWG Biotech., Germany), plate shaker (Lab-Line, U.S.A.), ice-maker(비전과학, Korea), ELISA reader (in이ecular devices, U.S.A.), 및 homogenizerfOMNI, U.S.A.), automatic chemical analyzer(Express 550, Ciba-Corning co., U.S.A.), VIDEOTRACK (Animal and human being behaviour analysis system, Viewpoint, France) 등의 것이었다.
- 본 연구에 사용된 시약 중 Cholinesterase kit(420-MC, sigma, U.S.A.), scopolamine, Tris-HCl, NaCl, Nonidet P-40, Ethyleneglycol-bis(P-amino- ethyl ether) N, N, N', N-tetraacetic acid(EGTA), phenylmethylsulfonyl fluo- ride(PMSF), DL-di나liothreitol(DTT), leupetin, Diethyl pyrocarbonate(DEPC)z chloroform, RPMI-1640 배양액, isopropanol, ethidium bromide(EtBr), Dulbecco's phosphate buffered saline(D-PBS)z formaldehyde, poly acryl- amide, magnesium chloride(MgC12) 은 Sigma사(U.S.A.) 제품을 사용하였으며, Taq polymerase와 Deoxynucleotide triphosphate(dNTP)는 TaKaRa사(Japan) 제품을 역전사효소 (Moloey Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase ; M-MLV RT) 와 RNase inhibitoi는 PromegaX} (Madison, U.S.A.) 제품을, RNAzolB는 T이-Test사(U.S.A.) 제품을, 우태아혈청(fet시 bovine serum)은 Hyclone사(Logan, U.S.A.) 제품을, 그리고 Agarose는 FMC사(USA.) 제품 등을 사용하였고, 그 외 시약들은 특급 및 일급을 사용하였다.
- p。이에서 platform으로 올라가는 생쥐를 선별하였다. 선별된 ICR계 생쥐 10마리를 한 군으로 하여 대조군, 양성대조군(tacrine 10㎎/㎏ p.
데이터처리
- 실험에서 얻은 결과는 mean士standard error로 기록하였다 유의성 검증은 Student's t-test 분석 방법”)을 이용하여 p<0.05 수준에서 검정하였다.
이론/모형
- 2【沌을 첨가한다, acetylcholine chloride solution을 첨가한 후 시간을 정확히 기록하여 25℃ 수조에서 정확히 30분간 배양시킨 후 ELISA reader 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 g = ABLANK - ATEST 공식에 의하여 활성도를 측정하였다.
성능/효과
- 06网/业)로 나타나 모두 유의성 있는 감소효과를 보였다 (Table 2). AChE activity는 대조군이 69.3±5.6(U/iN)인데 비하여, tacrine 투여군과 실험군은 각각 31.3+7.1, 40.1±6.6(U/m。)으로 나타나 모두 유의성 있는 감소효과를 보였다(Table 2).
- AChE mRNA 발현에 있어서 정상군은 25(버t)로 나타났고 대조군은 171(Ht)로 나타났으며 砂仁 100eg/ nie 투여 실험군은 32(Ht), 砂仁 10姻/圳 투여 실험군은 145(Ht), 砂仁 투여 실험군은 173(Ht)으로 나타났다(Fig. 2).
- 4). IL-6와 TNF-a mRNA 발현에서는 2陽/禍의 LPS만을 처리한 대조군에 비해, 2々g/i戒의 LPS와 100/zg/mt 1喚 /A 以g/戒의 砂仁을 함께 투여한 실험군에서 유전자 발현이 농도 의존적으로 억제되었는데(Fig. 5, 6), 이를 통하여 砂仁이 proinflammatory cytokine의 발현 억제를 통해 AIM] 치료에 효과가 있음을 알 수 있었다.
- PC-12 세포주 세포성 단박질에서 AChE 활성도 억제 효과를 본 결과 대조군에 비해 砂仁을 lOOeg/mCz 10//g/mt 却g/戒를 투여한 실험군은 각각 37.8±4.6, 61.0+7.2, 86.4±5.7(%)로 나타나 유의성 있는 억제효과를 보였다(Fig. 7).
- PC-12 세포주의 세포성 단백질에서의 AChE 활성도를 측정한 결과 1011M의 AP 만을 처리한 대조군에 비해 100/2g/mt 10/zg IA 以g/就의 砂仁을 함께 투여한 실험군에서 모두 유의성 있는 AChE activity 억제 효과를 보였는데 (Fig. 7), 이를 AChE mRNA 발현 결과와 함께 보면 砂仁의 투여로 PC-12 세포주의 유전자 수준과 세포성 단백질 수준에서 모두 AChE가 억제되어, 砂仁의 투여가 acetylcholine을 활성화시킴으로써 기억력의 개선에 도움을 줄 것으로 기대된다.
- Scop시amine으로 유도된 기억력 감퇴 생쥐모델의 Morris water maze 실험을 통한 기억력 감퇴 억제 효과를 분석한 결과, stop-through latency는 대조군에 비해 Tacrine 투여군과 실험군에서 모두 유의성 있는 시간의 단축을 보였고(Fig. 8), distance movement-through latency틀 관찰한 결과, 대조군에 비해 Tacrine 투여군과 실험군에서 모두 유의성 있는 거리의 단축을 보였는데(Fig. 9, 10), 이것으로 砂仁 투여 후 기억력감퇴가 억제되었음을 볼 수 있었다.
- TNF-a mRNA 발현에 있어서 정상군은 42(Ht) 로 나타났고 대조군은 168(Ht)로 나타났으며 砂仁 100//g/m£ 투여 실험군은 55(Ht), 砂仁 10陽/畝 투여 실험군은 90(Ht), 砂仁 以g/砒 투여 실험군은 139(Ht)로 나타났다(Fig. 6).
- mLFC의 생존율에 있어서는 대조군에 비해 200俸/砒 이하의 실험군은 큰 변화가 없었고 400您/戒의 실험군은 83±3.7(%)로 유의성 있는 감소를 보였으며, PC-12 세포주의 생존율은 대조군에 비해 100 陽/)成 이하의 실험군에서는 큰 변화가 없었고 200, 400俸/畝의 실험군에서는 87±2.9, 85±4.3(%)로 유의성 있게 감소되었다(Table 1).
- 있어서 10μM의 A。만을 처리한 대조군에 비해, lQtiM의 A0와 100//g/i的 们 1鹿/畝의 砂仁을 함께 투여한 실험군에서 모두 농도 의존적으로 APP, AChE, GFAP의 mRNA의 발현이 억제되었는데(Fig. 1-3), 이를 통하여 砂仁은 AD를 유발하는 여러 물질의 유전자 발현의 억제를 통하여 AD에 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 먼저, 정상 생쥐의 mLFC와 PC-12 세포주를 분리하여 砂仁 의 세포독성을 측정한 결과, mLFC 및 PC-12 세포주 모두의 생존률에 있어서 대조군에 비해 200您/砒 이하의 실험군은 큰 변화가 없었고 40⑰g/叫의 실험군은 각각 83±3.7(%)와 85±4.3(%) 로 감소되었다(Table 1). 따라서 본 실험에서는 세포독성의 영향을 받지 않는 농도인 100/zg/me 이하의 砂仁을 使用하여 砂仁이 AD 유발인자에 미치는 영향을 살펴보았다.
- 이런 관점에서 砂仁이 scopolamine으로 유도된 기억력감퇴 白鼠 모델의 혈청내 glucose, uric acid 및 AChE에 미치는 효과를 분석한 결과' glucose는 대조군에 비해 Tacrine 투여군과 실험군에서 모두 증가틀 보였으나 유의성은 없었고, uric acid는 대조군에 비하여 tacrine 투여군과 실험군에서 모두 유의성 있는 감소를 나타냈으며, AChE 활성도는 대조군에 비하여 tacrine 투여군과 실험군에서 모두 유의성 있는 감소를 보여주었는데(Table 2), 이로써 砂仁이 glucose를 효과적으로 증가시키지는 못했으나, uric acid를 감소시키고 AChE의 활성을 억제함으로써 AChE의과다로 인한 acetylcholine의 작용 저하를 개선하여 기억력감퇴에 대한 치료효과가 있을 것으로 판단된다.
후속연구
- 痰飮은 痴呆의 중요한 원인 중 하나인데어? 脾胃는 水液代 謝의 中樞로 痰飮의 生成과 밀접한 관련이 있으므로찌, 化濕開胃 의 效能 및 그 主治로 미루어 砂仁을 痴呆의 치료와 예방에 응용할 수 있으리라 사료된다.
- 이러한 결과를 종합해 봤을 때 砂仁은 AD에 대한 예방과 치료에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 보아 砂仁은 AD의 치료와 예방 및 기억력 감퇴에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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