구름버섯균 KN9522에서 degenerate primer를 이용한 Mn-Peroxidase 동위효소 유전자들의 PCR 클로닝 PCR Cloning of Genes Encoding the Mn-Peroxidase Isozyme Family from Trametes versicolor KN9522 Using Degenerate Primers원문보기
구름버섯균 KN9522로부터 분리한 Mn-peroxidase 동위효소 CVMP1, CVMP2, CVMP3 및 CVMP5를 코딩하는 게놈유전자를 분리하기 위해 4개의 동위효소 N-말단아미노산서열을 기준으로 제작한degenerate primer들이 사용되었다. 하나를 제외한 3개의 동위효소들은 그에 대응되는 염기서열 900정도 되는 PCR산물 (cmp1, cmp2 및 cmp5)을 얻었다. NCBI의 BLAST 프로그램을 사용하여 PCR산물들의 염기서열을 분석한 결과, cmp1, cmp2 및 cmp5는 구름버섯균 PRL572로부터 분리한 유전자 MPG-I (등록번호 Z30668) 및 PGV-II(등록번호 Z54279)와 유사하였다. cmp1과 cmp2는 MPG-I유전자의 염기서열과 각각 77%및 95%의 상동성을 보였고 cmp5는 PGV-II 염기서열과 88%의 상동성을 보였다. 본 실험을 통하여 저자들은 Mn-peroxidase 동위효소계의 아미노산 서열을 기준으로 제작된 degenerate primer들을 사용하여 게놈 DNA조각을 분리할 수 있었다.
구름버섯균 KN9522로부터 분리한 Mn-peroxidase 동위효소 CVMP1, CVMP2, CVMP3 및 CVMP5를 코딩하는 게놈유전자를 분리하기 위해 4개의 동위효소 N-말단아미노산서열을 기준으로 제작한degenerate primer들이 사용되었다. 하나를 제외한 3개의 동위효소들은 그에 대응되는 염기서열 900정도 되는 PCR산물 (cmp1, cmp2 및 cmp5)을 얻었다. NCBI의 BLAST 프로그램을 사용하여 PCR산물들의 염기서열을 분석한 결과, cmp1, cmp2 및 cmp5는 구름버섯균 PRL572로부터 분리한 유전자 MPG-I (등록번호 Z30668) 및 PGV-II(등록번호 Z54279)와 유사하였다. cmp1과 cmp2는 MPG-I유전자의 염기서열과 각각 77%및 95%의 상동성을 보였고 cmp5는 PGV-II 염기서열과 88%의 상동성을 보였다. 본 실험을 통하여 저자들은 Mn-peroxidase 동위효소계의 아미노산 서열을 기준으로 제작된 degenerate primer들을 사용하여 게놈 DNA조각을 분리할 수 있었다.
Degenerate primers corresponding to the sequences of the N-terminal regions of Mn-peroxidase isozymes were used to isolate the genomic fragments encoding the isozymes of Mn-peroxidase, CVMP1, CVMP2, CVMP3 and CVMP5 from the white-rot fungus Trametes versicolor KN9522. Three isozymes except one gave ...
Degenerate primers corresponding to the sequences of the N-terminal regions of Mn-peroxidase isozymes were used to isolate the genomic fragments encoding the isozymes of Mn-peroxidase, CVMP1, CVMP2, CVMP3 and CVMP5 from the white-rot fungus Trametes versicolor KN9522. Three isozymes except one gave the expected PCR products (cmp1, cmp2 and cmp5) of about 900 base pairs, respectively. DNA sequence data obtained from each PCR products were used to analyze the BLAST program search on the National Center for Biotechnology Information. cmp1, cmp2 and cmp5 were similar to MPG-I (GenBank accession number Z30668) and PGV-II (GenBank accession number, Z54279) gene T. versicolor PRL572. PCR products of cmp1 and cmp2 showed 77%, 95% base sequence similarities to MPG-I gene and cmp5 showed about 88% similarity to PGV-II gene from T. versicolor PRL572. From this experiment, we could isolate genomic DNA fragments with degenerate primers designed from the N-terminal amino acid sequences of Mn-peroxidase isozyme family.
Degenerate primers corresponding to the sequences of the N-terminal regions of Mn-peroxidase isozymes were used to isolate the genomic fragments encoding the isozymes of Mn-peroxidase, CVMP1, CVMP2, CVMP3 and CVMP5 from the white-rot fungus Trametes versicolor KN9522. Three isozymes except one gave the expected PCR products (cmp1, cmp2 and cmp5) of about 900 base pairs, respectively. DNA sequence data obtained from each PCR products were used to analyze the BLAST program search on the National Center for Biotechnology Information. cmp1, cmp2 and cmp5 were similar to MPG-I (GenBank accession number Z30668) and PGV-II (GenBank accession number, Z54279) gene T. versicolor PRL572. PCR products of cmp1 and cmp2 showed 77%, 95% base sequence similarities to MPG-I gene and cmp5 showed about 88% similarity to PGV-II gene from T. versicolor PRL572. From this experiment, we could isolate genomic DNA fragments with degenerate primers designed from the N-terminal amino acid sequences of Mn-peroxidase isozyme family.
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제안 방법
Korea)사에 의뢰하여 합성하였다. 5, -primer들은 정제된 각 동위효소의 N-말단 아미노산 서열의 코돈을 바탕으로 하여 총 4개(CVMP1, CVMP2 및 CVMP5)의 degenerate primer를 제작하였으며(9, Table 1), 3'- piimer는 GenBank에 등록되어 있는 Trametes versicolor Mn- peroxidase 및 lignin peroxidase 유전자 family를 검색하여 cDNA 서열상에서 고도로 보존된 서열부위 2곳을 대상으로 2개(CVMPR3 및 CVMPR4)의 reverse degenerate primer를 제작하였다(Fig. 1). 합성된 모든 degenerate primer는 각 primer의 mole %를 높이기 위해 degeneracy가 4이상인 아미노산은 혼합염기 대신 inosine을 사용하였다.
PCR 실행 조건은 PTC-150 MiniCyclerTM (MJ Research, USA)를 이용하여 94℃에서 4분간 pre-denaturation한 후 95℃에서 40초간 denaturation하였다. Annealing단계는 각 degenerate primer의 melting 온도에 따라서 annealing 온도를 가감하였고 반응시간은 모두 45초로 실행하였다. Extensione 72℃에서 1분간 실시하고 총 33cycle을 반응하였으며 final extensione 72℃로 5분간 실시하였다.
PCR 반응 후 1.2% agarose gel 전기영동을 통하여 DNA 단편 들의 증폭을 확인한 다음, genomic DNA상에서 각 degenerate primer에 의한 예상 DNA 증폭크기와 일치하는 DNA 단편들을 gel에서 잘라내어 정제하였다. 정제된 DNA 단편들은 염기서열을 분석하기 위해 pGEM-T Easy Vector System (Promega, US A) 을 이용하여 제조사의 설명에 따라 TA-cloning한 후 Escherichia coli JM109 균주에 형질전환하였다.
PCR 반응조성은 0.5 ml PCR tube에 genomic DNA 40 ng과 degenerate primer 50-100 pmole을 혼합한 후, Tag DNA polymerase 1 U, dNTP 250 gM, KC1 40 mM, MgCl2 1.5 mM 되 게 20 μl의 10 mM Tris-HCl (pH 9.0)을 첨가하였다. PCR 실행 조건은 PTC-150 MiniCyclerTM (MJ Research, USA)를 이용하여 94℃에서 4분간 pre-denaturation한 후 95℃에서 40초간 denaturation하였다.
정제된 DNA 단편들은 염기서열을 분석하기 위해 pGEM-T Easy Vector System (Promega, US A) 을 이용하여 제조사의 설명에 따라 TA-cloning한 후 Escherichia coli JM109 균주에 형질전환하였다. PCR 증폭산물이 삽입된 형 질 전환체를 선별하여 pGEM-T Easy Plasmid를 추출, 정제한 다음 ABI PRISM 377 Automatic DNA Sequencer (Applied Biosystems, SA)를 이용하여 PCR 증폭산물의 염기서열을 결정 하였다. 결정된 염기서열은 NCBI의 Blast 검색프로그램을 통해 상동성 검색을 실시하였으며, Clustal X (Version 1.
PCR 증폭산물이 삽입된 형 질 전환체를 선별하여 pGEM-T Easy Plasmid를 추출, 정제한 다음 ABI PRISM 377 Automatic DNA Sequencer (Applied Biosystems, SA)를 이용하여 PCR 증폭산물의 염기서열을 결정 하였다. 결정된 염기서열은 NCBI의 Blast 검색프로그램을 통해 상동성 검색을 실시하였으며, Clustal X (Version 1.81)를 이용하여 multiple sequence alignment# 실시하였다.
배양된 균사체는 멸균된 3차 증류수로 여러 번 세척 후 수분을 제거한 뒤 막자사발에 균사체와 액체질소를 넣고 급히 냉동 시킨 상태에서 마쇄하였다. 균사분말은 Zolan과 Pukkila (1986)의 방법을 변형하여 DNA를 추출하였다. 균사분말 400 mg 당 400)11의 DNA추출 완충제 (SDS 3%, EDTA 50 mM, Tris-HCl pH 7.
versicolor KN9522 (12, 등록번호 AY686706)를 사용하였다. 본 균주의 배양은 맥아 한천 평판배지(2% malt extract, 2% glucose, 0.1% peptone, 2% agar)에 접종하여 25℃에서 일주일간 배양한 후 균사조각을 잘라 내 망간이 제한된 LNHC (Low Nitrogen High Carbon)배지에 접종하여 일주일간 정치배양하였다. 배양된 균사체는 마쇄하여 현탁액을 MnSQ가 80mg/L로 조절된 250ml LNHC 배지에 10%(v/v)로 접종하여 25℃에서 9일간 120 rpm으로 진탕 배양하였다.
본 실험실에서는 목재 부후균인 Trametes versicolor KN9522 로부터 정제된 Mn-peroxidase 동위효소 4종을 대상으로 degenerate primer를 이용한 PCR방법으로 Mn-peroxidase 동위효소를 코딩하는 게놈유전자를 탐색하여 보고된 유전자와 비교분석하였다.
2% agarose gel 전기영동을 통하여 DNA 단편 들의 증폭을 확인한 다음, genomic DNA상에서 각 degenerate primer에 의한 예상 DNA 증폭크기와 일치하는 DNA 단편들을 gel에서 잘라내어 정제하였다. 정제된 DNA 단편들은 염기서열을 분석하기 위해 pGEM-T Easy Vector System (Promega, US A) 을 이용하여 제조사의 설명에 따라 TA-cloning한 후 Escherichia coli JM109 균주에 형질전환하였다. PCR 증폭산물이 삽입된 형 질 전환체를 선별하여 pGEM-T Easy Plasmid를 추출, 정제한 다음 ABI PRISM 377 Automatic DNA Sequencer (Applied Biosystems, SA)를 이용하여 PCR 증폭산물의 염기서열을 결정 하였다.
54 volume의 isopropanol을 첨가한 뒤 원심 분리하여 상등액을 제거하고 침전된 genomic DNA만 취하였다. 침전된 genomic DNA는 멸균 3차 증류수로 녹여 분광광도계를 이용하여 DNA농도를 측정한 후 PCR에 이용하였다.
대상 데이터
배양된 균사체는 마쇄하여 현탁액을 MnSQ가 80mg/L로 조절된 250ml LNHC 배지에 10%(v/v)로 접종하여 25℃에서 9일간 120 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양을 위해 사용된 배지성분은 모두 Difco사 제품을 사용하였다.
사용된 균주는 본 실험실에서 분리한 T. versicolor KN9522 (12, 등록번호 AY686706)를 사용하였다. 본 균주의 배양은 맥아 한천 평판배지(2% malt extract, 2% glucose, 0.
성능/효과
NCBI의 Blast-2 염기서열 검색 프로그램을 통해 cmpl, cmp2 및 cmp5의 두 염기서열 서로간의 상동성을 비교한 결과, cmpl, cmp2 및 cmp5 간의 염기서열 상동성 검사에서는 cmpl과 cmp2의 염기서열이 세 부분에서 77%, 79% 및 78%로 나타났으며, cmpl과 cmp5의 염기서열 역시 세 부분에서 각각 81%, 76% 및 81%로 확인되었다. cmp2와 cmp5의 염기서열은 네 부분에서 각각 86%, 88%, 86% 및 80%의 상동성을 나타내어 비교적 두 유전자간의 유사성이 높은 것으로 확인되었다.
T. versicolor KN9522의 genomic DNA를 template로 하여 각각의 degenerate primer 를 사용한 PCR 을 통해서 cmpJ (CMP1+CMPR4)은 911 bp, cmp2 (CMP2+CMPR4)는 880 bp, cmp3 (CMP3+CMPR4)는 872 bp 및 cmp5 (CMP5+CMPR4)는 893 bp의 증폭산물을 얻을 수 있었다 (Fig. 2).
NCBI의 Blast-2 염기서열 검색 프로그램을 통해 cmpl, cmp2 및 cmp5의 두 염기서열 서로간의 상동성을 비교한 결과, cmpl, cmp2 및 cmp5 간의 염기서열 상동성 검사에서는 cmpl과 cmp2의 염기서열이 세 부분에서 77%, 79% 및 78%로 나타났으며, cmpl과 cmp5의 염기서열 역시 세 부분에서 각각 81%, 76% 및 81%로 확인되었다. cmp2와 cmp5의 염기서열은 네 부분에서 각각 86%, 88%, 86% 및 80%의 상동성을 나타내어 비교적 두 유전자간의 유사성이 높은 것으로 확인되었다.
cmpl, cmP2 및 cmp5를 대상으로 NCBI의 Blast 프로그램 검색 결과, cmpl의 염기서열은 T. versicolor PRL572 균주의 MPG-I 유전자(6, 등록번호 Z30668)와 세 부분에서 각각 77 %, 78% 및 77%의 상동성을 나타냈으며, cmp2의 염기서열은 MPG- I 유전자와 95%의 높은 상동성을 보였다. ctnp5는 T.
versicolor PRL572 균주의 MPG-I 유전자(6, 등록번호 Z30668)와 세 부분에서 각각 77 %, 78% 및 77%의 상동성을 나타냈으며, cmp2의 염기서열은 MPG- I 유전자와 95%의 높은 상동성을 보였다. ctnp5는 T. versicolor PRL 572 균주의 PGV-H 유전자(등록번호 Z54279)와 네 부분에서 각각 88%, 85%, 90% 및 88%의 상동성을 나타냈으며, MPG-I 유전자와도 네 부분에서 각각 87%, 87 %, 86% 및 80%의 상동성을 보였다.
위와 같은 결과를 볼 때, 특정단백질의 아미노산 N-말단 서열 정보를 바탕으로 제작된 degenerate primer를 이용한 PCR유전자 탐색 방법은 DNA library를 이용한 hybridization방법보다 효율적으로 해당 유전자를 탐색 증폭시킬 수 있음을 확인하였다. 특히 아미노산 서열의 상동성이 높은 특정 효소군의 동위효소를 encoding하는 특정 유전자 famHy내에서의 유전자 검출도 degenerate primer를 이용한 PCR유전자 검색방법으로 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
증폭된 4종의 PCR산물(cmpJ, cmp2, cmp3 및 cmp5)을 염기서열 분석한 결과 각각의 primer조합에 의해 정상적으로 증폭되었음을 화인할 수 있었으며, 이 중 특히 cmpl, cmp2' 및 cmp5 염기서열은 Trametes versicolor KN9522의 Mn-peroxidase 동위효소 CVMP1, CVMP2 및 CVMP5의 N-말단 아미노산 부위를 코딩하고 있음을 알 수 있었다. 그러나 cmp3의 염기서열은 cmp5 와 100% 상동성을 가진 것을 확인하였다(Fig.
위와 같은 결과를 볼 때, 특정단백질의 아미노산 N-말단 서열 정보를 바탕으로 제작된 degenerate primer를 이용한 PCR유전자 탐색 방법은 DNA library를 이용한 hybridization방법보다 효율적으로 해당 유전자를 탐색 증폭시킬 수 있음을 확인하였다. 특히 아미노산 서열의 상동성이 높은 특정 효소군의 동위효소를 encoding하는 특정 유전자 famHy내에서의 유전자 검출도 degenerate primer를 이용한 PCR유전자 검색방법으로 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
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