본 연구는 제주도 축산진흥원과 농촌진흥청 난지농업연구소에서 사육되고 있는 제주마 5두를 사용하여 인공질을 이용, 정액을 채취하여 정액의 일반성상 및 CASA를 이용하여 정자의 운동성과 생사 염색으로 기형률을 조사하였다. 제주마 정액의 일반 특성으로 총 정액량은 평균 42.5ml이었으며 평균 pH는 7.3, 평균 정자농도는 평균 $198.5X10^6/m1$ 이었다. 정자의 운동성은 $64.3{\pm}23.2%$이며, motility parameters 별로 VAP$70.4{\pm}28.7{\mu}m/s,\;VSL\;69.6{\pm}28.9{\mu}m/s,\;VCL\;94.1{\pm}30.0{\mu}m/s,\;ALH\;2.3{\pm}0.7{\mu}m/s,\;BCF\;7.6{\pm}1.1Hz,\;STR\;99.1{\pm}1.2%,\;LIN\;77.1{\pm}12.7%$로 나타났다. 정자 부위별 기형률은 두부가 평균 4 %, 경부가 평균 20 %, 미부가 평균 4 %로 나타났다. 이 연구를 통해 천연기념물로 지정되어 있는 제주마의 유전자원 보존과 증식을 위한 인공수정기술의 실용화를 위한 기초 자료를 제공하고자 한다.
본 연구는 제주도 축산진흥원과 농촌진흥청 난지농업연구소에서 사육되고 있는 제주마 5두를 사용하여 인공질을 이용, 정액을 채취하여 정액의 일반성상 및 CASA를 이용하여 정자의 운동성과 생사 염색으로 기형률을 조사하였다. 제주마 정액의 일반 특성으로 총 정액량은 평균 42.5ml이었으며 평균 pH는 7.3, 평균 정자농도는 평균 $198.5X10^6/m1$ 이었다. 정자의 운동성은 $64.3{\pm}23.2%$이며, motility parameters 별로 VAP $70.4{\pm}28.7{\mu}m/s,\;VSL\;69.6{\pm}28.9{\mu}m/s,\;VCL\;94.1{\pm}30.0{\mu}m/s,\;ALH\;2.3{\pm}0.7{\mu}m/s,\;BCF\;7.6{\pm}1.1Hz,\;STR\;99.1{\pm}1.2%,\;LIN\;77.1{\pm}12.7%$로 나타났다. 정자 부위별 기형률은 두부가 평균 4 %, 경부가 평균 20 %, 미부가 평균 4 %로 나타났다. 이 연구를 통해 천연기념물로 지정되어 있는 제주마의 유전자원 보존과 증식을 위한 인공수정기술의 실용화를 위한 기초 자료를 제공하고자 한다.
The objective of the study was to assess the general characteristics and motility characteristics with Computer Assisted Sperm Analyzer (CASA) system in Jeju horse semen. Semen was collected from 5 fertile Jeju horse by use of a Missouri type artificial vagina. Semen volume and pH were recorded, and...
The objective of the study was to assess the general characteristics and motility characteristics with Computer Assisted Sperm Analyzer (CASA) system in Jeju horse semen. Semen was collected from 5 fertile Jeju horse by use of a Missouri type artificial vagina. Semen volume and pH were recorded, and sperm concentration was determined with a hematocytometer and motional characteristics of sperm were analysed by CASA. The viability and morphological abnormalities were assessed by a vital staining. The average volume of ejaculates was 42.5 ml and the average of sperm concentration was $198.5x10^6/m1$. The motional characteristics in Jeju horse semen was showed $70.4{\pm}28.7{\mu}m/s\;for\;VAP,\;69.6{\pm}28.9{\mu}m/s\;for\;VSL,\;94.1{\pm}30.0{\mu}m/s\;fo\;VCL,\;2.3{\pm}0.7{\mu}m/s\;for\;ALH,\;7.6{\pm}1.1Hz\;for\;BCF,\;99.1{\pm}1.2%\;for\;STR,\;and\;77.1{\pm}12.7%\;for\;LIN$. The percentage of sperm with abnormal head, midpiece and tail was 4.2%, 20.6%, 4.6% respectively.
The objective of the study was to assess the general characteristics and motility characteristics with Computer Assisted Sperm Analyzer (CASA) system in Jeju horse semen. Semen was collected from 5 fertile Jeju horse by use of a Missouri type artificial vagina. Semen volume and pH were recorded, and sperm concentration was determined with a hematocytometer and motional characteristics of sperm were analysed by CASA. The viability and morphological abnormalities were assessed by a vital staining. The average volume of ejaculates was 42.5 ml and the average of sperm concentration was $198.5x10^6/m1$. The motional characteristics in Jeju horse semen was showed $70.4{\pm}28.7{\mu}m/s\;for\;VAP,\;69.6{\pm}28.9{\mu}m/s\;for\;VSL,\;94.1{\pm}30.0{\mu}m/s\;fo\;VCL,\;2.3{\pm}0.7{\mu}m/s\;for\;ALH,\;7.6{\pm}1.1Hz\;for\;BCF,\;99.1{\pm}1.2%\;for\;STR,\;and\;77.1{\pm}12.7%\;for\;LIN$. The percentage of sperm with abnormal head, midpiece and tail was 4.2%, 20.6%, 4.6% respectively.
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문제 정의
따라서 컴퓨터를 이용한 정액 분석 (Computer-Assisted Sperm Analysis; CASA)은 세포의 움직임, 속도, 형태와 같은 서로 다른 특징들에 대한 객관적인 평가를 가능하게 한다. 본 연구에서는 제주 종모마의 정자 운동성을 CASA를 이용하여 보다 객관적인 운동성을 평가하여 향후 수태율을 향상시키는데 기초 자료를 얻고자 하였다.
이 연구를 통해 천연기념물로 지정되어 있는 제주마의 유전자원 보존과 증식을 위한 인공수정기술의 실용화를 위한 기초 자료를 제공하고자 한다.
제주마와 같이 고부가 가치를 창출할 수 있는 동물에서는 정액을 이용하여 수정 능력을 최적화함으로써 수익성이 개선될 수 있다. 이를 위해서는 CASA 분석을 통하여 보다 객관적인 정자의 운동성 평가가 필요하리라 사료되고, 차후 제주마 등록 및 증식 사업의 성공적인 수행을 위한 동결 정액 생산 기술 개발의 기초 자료를 제공하고자 본연구를 수행하였다.
제안 방법
4개의 시야를 선택하여 이물질이 정자로 오인되는 것을 방지하기 위하여 화면상에서 실제 정자의 영상과 이진영상의 밝기와 대비를 조절하여 영상을 시스템에 입력한 후 1시야가 1초 노출되는 동안 25 frame을 분석하여 평균치를 측정하였다. 그 외 본 실험에 사용된 CASA system의 초기 설정치는 Table 1과 같다.
정액을 HEPES-buffered saline으로 1:10으로 희석시킨 다음 1 ml의 희석 정액에 10nM의 SYBR 14를 5μ1 첨가시켜 37℃에서 10분간 평형을 시켰다. 그리고 12μM의 propidium iodide(Sigma, PI)를 5μ1 혼합한 다음 다시 37℃에서 10분간 평형시키고 slide 위에 sample을 얹어 Zeiss 형광현미경 (excitation filter, 365 nm; barrier filter, 397nm)하에서 관찰하였다. 정자의 형태학적 기형 조사는 두부, 경부 및 미부 기형으로 구분하였다.
본 연구는 제주도 축산진흥원과 농촌진흥청난지농업연구소에서 사육되고 있는 제주마 5두를 사용하여 인공질을 이용, 정액을 채취하여 정액의 일반성상 및 CASA를 이용하여 정자의 운동성과 생사 염색으로 기형률을 조사하였다.
정액 채취 시 인공질의 온도는 37℃로 그 범위는 보통 37-42℃ 였다. 인공질 내로 음경의 삽입이 용이하도록 정자에 무해한 윤활제(Lube®, USA)를 인공질의비닐 내피에 도포하고 종마가 암말에 승가 하자마자 음경을 인공질로 유도하여 정액을 채취하였다. 채취된 정액은 알루미늄 은박으로 차광 처리된 50ml comical tube(Falcon, USA)에 나누어 넣은 후, 37℃로 맞춘 보온병에 저장하여 실험실로 수송하였으며 소요 시간은 30분 내외로 하였다.
채취된 정액은 알루미늄 은박으로 차광 처리된 50ml comical tube(Falcon, USA)에 나누어 넣은 후, 37℃로 맞춘 보온병에 저장하여 실험실로 수송하였으며 소요 시간은 30분 내외로 하였다. 정액은 실험실 도착 즉시 활력도와 형태학적 분석을 하였다.
그 외 본 실험에 사용된 CASA system의 초기 설정치는 Table 1과 같다. 정자 각각의 운동 특성은 정자의 실제 이동 경로에 따른 이동 속도인 곡선 경로 속도(VCL), 곡선 이동 경로에 대한 평균 이동을 나타내는 평균 경로 속도(VAP), 단위 시간 당 시점에서 종점까지의 속도를 나타내는 직선 경로 속도(VSL), 평균 이동 경로와 실제 이동 경로와의 측방 거리차인 측두 거리(ALH), 실제 이동 경로가 평균 이동 경로와 만나는 횟수의 시간당 비율(BCF), 및 위의 측정된 운동 특성들을 바탕으로 곡선 경로 선형도(LIN), 평균 경로 선형도(STR)의 값을 분석하였다.
정자의 운동 특성은 Marklefs counting chamber (Sefi medical, Israel)에 정액 5μ1를 넣은 후 현미경(Axios kop, Zeiss)의 관찰 배율을 x200으로 설정하고 CCD(Toshiba, Japan)로 연결하여 CASA sys-tem(VideoTesT-Sperm2.1, Image analysis software, Russia)으로 분석하였다.
그리고 12μM의 propidium iodide(Sigma, PI)를 5μ1 혼합한 다음 다시 37℃에서 10분간 평형시키고 slide 위에 sample을 얹어 Zeiss 형광현미경 (excitation filter, 365 nm; barrier filter, 397nm)하에서 관찰하였다. 정자의 형태학적 기형 조사는 두부, 경부 및 미부 기형으로 구분하였다.
종마 S두를 사용하였다. 발정이 확인된 제주 암말을 의빈축으로 이용하여 Missouri style의 인공 질을 이용하여 정액 채취를 하였다. 정액 채취 시 인공질의 온도는 37℃로 그 범위는 보통 37-42℃ 였다.
본 연구에 사용한 공시마는 제주도 축산진흥원과 농촌진흥청 난지농업연구소에서 사육되고 천연기념물 제 347호로 지정되어 있는 5~11세 된 제주마 종마 S두를 사용하였다. 발정이 확인된 제주 암말을 의빈축으로 이용하여 Missouri style의 인공 질을 이용하여 정액 채취를 하였다.
정자의 생사 판정을 위한 생사 염색은 LIVE/DEAD® Sperm Viability Kit(Molecular Probes Inc., Eugene, OR) 염색액을 이용하였다. 정액을 HEPES-buffered saline으로 1:10으로 희석시킨 다음 1 ml의 희석 정액에 10nM의 SYBR 14를 5μ1 첨가시켜 37℃에서 10분간 평형을 시켰다.
성능/효과
3, 평균 정자 농도는 평균 198xlO6/ml 이었다. 정자의 운동성은 64.3±23.2%이며, motility parameters 별로 VAP 70.4±28.7 n m/s, VSL 69.6±28.9 " m/s, VCL 94.1± 30.0 jum/s, ALH 2.3±0.7 n m/s, BCF 7.6±l.lHz, STR 99.1±1.2%, LIN 77.1±12.7%로 나타났다. 정자 부위별 기형률은 두부가 평균 4 %, 경부가 평균 20 %, 미부가 평균 4 %로 나타났다.
Jeulin 등 (1996)은 swim-up 기술에 의해 선별된 운동성 있는 정자의 ALH는 수정 비율에 긍정적인 상호 관련성이 있는 것으로 보고했으며, Chan 등(1989)은 swim- up 기술로 분리한 정자의 VCL을 CASA로 측정한 결과 IVF에서 아주 중요한 요소로 작용하였다고 한다. LINe VSL과 VCL의 비율은 체외수정에서 부정적인 효과를 가지며, 무정자증 정액의 정자에서는 VSL과 VCL 이 높은 비율을 차지하는 경향이 인정되었다. Quintero-Monen 등(2003) 이 연구한 종마 정액의 운동 성상을 보면 VAP 40.
13을 나타내었다. 이 결과와 비교해보면 VAP는 외국의 종마보다 움직임이 월등히 뛰어나는 것으로 보이지만 LIN의 경우는 오히려 제주마가 수정 효율이 떨어질 것으로 예상된다. 하지만 이러한 결과는 직접적으로 비교하기는 힘들며, 그 해석이 어렵고 종과의 차이가 충분히 날 수가 있으며, 그 외 온도의 영향, 측정 챔버의 영향, 특히 영상의 주파수 획득으로 정 자의 궤 도를 재 구성 하는 프래임 률에 의한 차이가 있을 수 있는 것으로 사료된다.
3에 나타난 바와 같았다. 전체 운동성은 64% 였으며, VAP는 70.4 μm/s, VSLe 69.6 μm/s, VCL 은 94.1μm/s, ALH는 2.3μm/s, BCF는 7.6 Hz, STRe 99.1%, LINe 77.1%로 나타났다.
5 ml 은 오 등(1994)과 양 등(2001)의 보고와 거의 비슷한 수준으로 채취되었다. 제주마와 크기가 비슷한 pony 종의 총 채 취 정 액량은 평균 34ml 정도이 며 gel을 제 거한 정액량은 평균 29ml 정도로 보.아 다소 제주마가 정 액 채 취량이 많은 것으로 보인다(McDonnell 과 Hize, 2005).
후속연구
그러나 Magistrini 등(1987) 이 보고한 농도와는 거의 비슷한 수준의 결과를 보였다. 그러나 본 연구에서 개체 간에 또한 채취 간에 정자 농도는 변이가 심했으며, 계절적인 요인도 변수로 작용할 수 있으리라 사료되며 이를 위해서는 번식 계절과 비번식 계절로 나누고 보다 많은 공시 두수를 조사할 필요가 있다고 사료된다.
본 연구를 통하여 제주마의 정액의 특성과 운동성을 CASA를 통하여 객관적으로 평가를 시도하였고, 차후 더 정확하고 표준화된 평가로 수태율과의 관계를 종합적으로 검토할 필요가 있을 것으로 사료된다.
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